第五章 一般毒性作用及其试验与评价方法

第三节蓄积毒性作用

一、蓄积毒性作用的基本概念

二、蓄积作用的研究方法

第五章一般毒性作用及其试验与评价方法第三节蓄积毒性作用一、蓄积毒性作用的基本概念外源化学物进入机体后，经过代谢转化排出体外，或直接排出体外。但是当其连续地、反复地进入机体，而且吸收速度或总量超过代谢转化排出的速度或总量时，化学物质就有可能在体内逐渐增加并贮留，这种现象称为化学物质的蓄积作用。

（一）概念：

多次间隔给予小剂量受试物，当给予受试物的时间间隔和剂量超过机体的解毒和排泄能力时，导致受试物在体内蓄积，由此引起的毒性作用称为蓄积性毒性作用。

（二）目的：

1.了解受试物是否具有蓄积作用及蓄积性大小如何;2.评定该化合物是否可引起潜在的慢性毒性危害;3.为制订该物质在食品中的卫生限量标准时,安全系数的选择提供依据。

4.确定该受试物是否可以用于食品供人类长期食用。物质蓄积：是指机体少量反复多次接触毒物后，该毒物在机体内逐渐积累。可以用一定的分析方法检测出体内该物质或其代谢产物在体内的增加过程，这种累计随着时间延长而含量增加，当达到中毒阈值时而产生毒性作用。功能蓄积：是指机体少量反复多次接触化学毒物或其他形式的危害物，每次引起的轻微功能损害逐渐积累，当积累到一定程度时出现毒性效应，而这时用检测手段却查不出体内毒物的的存在或增加。蓄积毒性作用产生的因素（1）与接触剂量大小和时间间隔有关（2）与毒物本身的性质有关脂溶性物质水溶性物质贮存库：如血浆蛋白、脂肪组织、肝脏、肾脏、骨骼等是某些毒物的常见贮存库。（3）与动物种属的代谢特点有关上一内容回主目录返回下一内容返回

上一内容下一内容回主目录第三节蓄积毒性作用二、蓄积作用的研究方法蓄积毒性试验目的是求出外源化学毒物的蓄积系数，了解蓄积毒性的强弱，并为慢性毒性试验及其他有关毒性试验的剂量选择提供参考。蓄积毒性作用的研究方法有多种，常用方法有蓄积系数法和生物半减期法。上一内容回主目录返回下一内容返回

上一内容下一内容回主目录二、蓄积作用的研究方法（一）蓄积系数法

蓄积系数法是一种以生物效应为指标，用经验系数（K）评价蓄积作用的方法，即将多次染毒与一次染毒所产生的毒性效应（或死亡）进行比较。蓄积系数是多次染毒使半数动物出现效应（或死亡）的蓄积剂量［ED50（n)］与一次染毒使半数动物出现相同效应（或死亡）的剂量[ED50（1）」的比值，即：上一内容回主目录返回下一内容返回

上一内容下一内容回主目录二、蓄积作用的研究方法（一）蓄积系数法在毒理学中研究化学毒物蓄积作用多选择动物来进行，以动物死亡一半为效应指标，那么上式可改写为：

∑LD50(n)K=LD50(1)K值越小，表示化学毒物的蓄积性越大。实验动物对化学毒物发生过敏现象，则可能出现K<1。随着化学毒物蓄积作用减弱，K值增加，通常认为K≥5，其蓄积毒性极弱。上一内容回主目录返回下一内容返回

上一内容下一内容回主目录1、固定剂量法测定蓄积系数法常选用大、小鼠等小型实验动物，染毒途径多用经口灌胃或腹腔注射。先求出某毒物的LD50，然后选取相同条件的40只（或更多）实验动物，随机分为两组，一为染毒试验组，一为对照组，每组至少20只，雌雄各半。在1/20～1/5LD50的范围内选定一个剂量，每日以固定剂量，定时和相同途径对试验组进行染毒，观察记录动物死亡数。上一内容回主目录返回下一内容返回

上一内容下一内容回主目录1、固定剂量法测定蓄积系数法当试验组累积发生一半动物死亡即可终止试验。此时，计算累积总接触剂量，根据公式计算K值，然后依上表进行评价。若接触剂量已累积达到5个LD50剂量，也可终止试验，此时计算出K＞5。固定剂量法试验期为25～100天。上一内容回主目录返回下一内容返回

上一内容下一内容回主目录2、剂量递增法

试验方案同上，实验开始时按0.1LD50剂量给予试验组染毒，以4天为一期，每期增加1.5倍。第一个四天按0.1LD50×4天第二个四天按0.15LD50×4天第三个四天按0.22LD50×4天……依次类推。这一方案试验期最长28天。上一内容回主目录返回下一内容返回

上一内容下一内容回主目录2、剂量递增法

在试验期间，当化学毒物引起动物累积死亡一半时即可终止试验，计算K值进行评价。一般来说，在试验第21天也可结束试验，因为这之前如果动物没有死亡或死亡数不足一半，说明其累积量已达5.26LD50，即K＞5。本方法剂量设计方案见表6-6。上一内容回主目录返回下一内容返回

上一内容下一内容回主目录3、剂量固定的20天蓄积法

该法是基于蓄积系数的原理而设计的。它通常采用经口灌胃染毒方式，将动物随机分为5个组，包括阴性对照组和1/20LD50、l/10LD50、l/5LD50和1/2LD50四个剂量组，每组动物数10只，雌雄各半。每日染毒一次，连续染毒20天。观察每组雌雄合计的死亡动物数量。上一内容回主目录返回下一内容返回

上一内容下一内容回主目录3、剂量固定的20天蓄积法

试验结束时根据下列标准进行评定：①1/20LD50组有死亡，且各组呈剂量-反应关系，则为强蓄积性；②1/20LD50组无死亡，且各组呈剂量-反应关系，则为中等蓄积性；③1/20LD50组无死亡，各组也不呈剂量-反应关系，则为无明显蓄积性；④如仅1/2LD50组有死亡，其他组均无死亡，则为弱蓄积性。上一内容回主目录返回下一内容返回

上一内容下一内容回主目录二、蓄积作用的研究方法（二）生物半减期法

生物半减期(BiologicalHalf-life,BL,T1/2)

指化学物质进入体内以后,在体内每减少一半所需的时间。对同一化合物在同一种动物体内是一恒值。生物半减期法（t1/2）是用毒物动力学原理描述化学毒物在机体内的蓄积作用。化学毒物在体内蓄积的速度和量与机体单位时间内吸收该物质的速度以及清除速度有关。上一内容回主目录返回下一内容返回

上一内容下一内容回主目录（二）生物半减期法

一般来说，tl/2较短的化学毒物达到蓄积极限所需的时间也短，t1/2长者达到蓄积极限的时间也长。一种化学毒物若以tl/2相等的时间间距染毒，其在体内经过6个t1/2的接触期就可以基本上达到蓄积的极限，此时理论蓄积量达到极限的98.4％。此后即使继续接触该物质，机体内的蓄积量基本上也不会增加。上一内容回主目录返回下一内容返回

上一内容下一内容回主目录（二）生物半减期法一种化学毒物若以tl/2相等的时间间距染毒，其在体内经过6个t1/2的接触期就可以基本上达到蓄积的极限，此时理论蓄积量达到极限的98.4％。此后即使继续接触该物质，机体内的蓄积量基本上也不会增加。根据tl/2=0.693Ke，通过动物血浆中化学毒物浓度求得tl/2。蓄积极限值

蓄积过程:

第一个BL(T1/2)末蓄积量=L×50%

第二个BL(T1/2)末蓄积量=L×75%

第三个BL(T1/2)末蓄积量=L×87.5%

第四个BL(T1/2)末蓄积量=L×93.75%

第五个BL(T1/2)末蓄积量=L×96.88%

第六个BL(T1/2)末蓄积量=L×98.44%

一般经过６个生物半减期即可达蓄积极限值

L100500给毒123456

T1/27587.5

计算：

蓄积极限值Ｌ＝Ａ×ＢＬ×１．４４

式中：Ａ：单位时间内毒物的吸收量（mg/d)BL：生物半减期应用：可根据一个化合物的Ｔ１／２值，计算出它在人体内达到的Ｌ值，并可计算出达到Ｌ值所需的时间上一内容回主目录返回下一内容返回

上一内容下一内容回主目录（三）蓄积率测定法常用的动物为小鼠或大鼠，首先将受试动物分成蓄积试验组和对照组两大组，每组动物数60~70只。蓄积性试验组动物每次以一定剂量（低于最小致死量）按同一染毒途径预先给受试物，经过一定时间之后，按常规方法测定蓄积性试验组和对照组的LD50，并按下列公式计算蓄积率。蓄积率=对照组LD50-蓄积组LD50对照组LD50-蓄积组LD50蓄积组给予受试物的总剂量蓄积组给予受试物的总剂量蓄积组给予受试物的总剂量蓄积组给予受试物的总剂量蓄积率应标明预先给予受试物的时间及剂量。在相同时间及剂量条件下，蓄积率越大表示该物质在体内的蓄积作用越强；反之，蓄积性则越弱。蓄积组给予受试物的总剂量对照组LD50-蓄积组LD50蓄积组给予受试物的总剂量对照组LD50-蓄积组LD50×100%

一、慢性毒性的概念二、慢性毒性试验的目的三、慢性毒性试验方法要点四、慢性毒件试验的注意事项第四节慢性毒性试验设计

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上一内容下一内容回主目录第四节慢性毒性作用一、慢性毒性的概念

慢性毒性（chronictoxicity）是指实验动物或人长期（甚至终生）反复接触外源化学物所产生的毒性效应。

所谓“长期”，一般是指2年。对大鼠相当于终生染毒，对兔相当于生命期的36%，对犬为20%，对猴为13％。对于有些远期毒性评价，试验期要求达到7~10年，甚至在有些动物上要包括若干代试验。上一内容回主目录返回下一内容返回

上一内容下一内容回主目录1、研究慢性毒性剂量-反应（效应）关系。确定长期接触造成有害作用的最低剂量（LOAEL)或阈剂量和未造成有害作用的剂量（NOAEL)；2、为制定外来化学物质在食品中的安全限量，如人体ADI值，最高残留限量MRL值，以及为危险度评价与管理提供毒理学依据；3、观察慢性毒性效应谱、毒作用特点和毒作用靶器官，为毒性机制研究和将毒性结果外推到人提供依据。二、慢性毒性试验的目的上一内容回主目录返回下一内容返回

上一内容下一内容回主目录三、慢性毒性试验方法要点1、实验动物的选择实际工作中大多用大鼠、犬和猴，经皮染毒也可使用豚鼠和家兔。动物数量要明显多于亚慢性试验，每组大鼠40～60只，犬8～12只，雌雄各半。啮齿类动物数不少于10只，非啮齿类不少于4只。上一内容回主目录返回下一内容返回

上一内容下一内容回主目录三、慢性毒性试验方法要点2、染毒途径和时限

染毒方法和途径尽量选择和人类接触途径相似的方式。一般采用经口染毒，多采用饲喂法。研究工业毒物一般认为染毒6个月或更长时间，环境毒物与食品的慢性毒性试验染毒期则要求1年以上或2年。上一内容回主目录返回下一内容返回

上一内容下一内容回主目录三、慢性毒性试验方法要点3、剂量分组

设计原则：高剂量组不能出现明显中毒，但要有轻微毒性反应；中剂量组应为慢性毒性作用的阈值剂量；低剂量组应为慢性毒性的最大无作用剂量组。上一内容回主目录返回下一内容返回

上一内容下一内容回主目录三、慢性毒性试验方法要点剂量分组：一般设3个染毒剂量组和1个对照组，必要时另设1个溶剂对照组。一般认为以亚慢性毒性试验的LOAEL等确定。以其1/5～1/2为高剂量组，以1/50～1/10为中剂量组，1/100为低剂量组。上一内容回主目录返回下一内容返回

上一内容下一内容回主目录三、慢性毒性试验方法要点如无亚慢性试验资料，可以参照LD50值设计剂量，如以l/10LD50，为高剂量组，1/100LD50为中剂量组，l/l000LD50为低剂量组。组间剂量差一般以5～10倍为宜，最低不小于2倍。上一内容回主目录返回下一内容返回

上一内容下一内容回主目录三、慢性毒性试验方法要点4、观察指标一般性指标、实验室检查、病理学检查及其他特异性指标的检查四方面。以亚慢性毒性试验所提供的毒效应和靶器官为基础，重点观察在亚慢性毒性试验中已经显现的阳性指标。优先采用亚慢性毒性试验筛选出来的敏感指标或特异性指标。上一内容回主目录返回下一内容返回

上一内容下一内容回主目录四、慢性毒性试验的注意事项1、试验动物环境的要求试验动物的饲养和试验环境规范化十分重要。2、检测条件的控制

3、重视试验前和对照