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文档简介

感受态细胞制备

Preparationofcompetentcell

实验五实验原理

受体细胞经过一些特殊方法(如电击法、CaCl2、RbCl等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenentcells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞）。实验材料和试剂实验材料：E.coliDH5α菌(R-，M-，Amp-)。实验试剂：LB液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeastextract)5g，NaCl10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH

调pH至7.5，加去离子水至总体积1L，高压下蒸气灭菌20min。LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉，高压灭菌。0.05mol/LCaCl2溶液：称取0.28gCaCl2(无水,分析纯)，溶于50mL重蒸水中，定容至100mL，高压灭菌。实验仪器台式高速冷冻离心机恒温摇床制冰机实验步骤菌体的培养受体菌的培养从

LB

平板上挑取新活化的E.coliDH5α单菌落，接种于3-5mLLB液体培养基中，37℃下振荡培养

12h左右，直至对数生长后期。再将该菌悬液以

1:

100-1:

50

的比例接种于100mLLB液体培养基中，37℃振荡培养

2-3h至OD600为0.5左右。将培养液转入离心管中，冰上放置10min，然后于4℃下3000g离心10min。弃去上清，用预冷的

0.05

mol/L

的CaCl2溶液10mL轻轻悬浮细胞，冰上放置

15-30min后，4℃

下

3000g

离心10min。弃去上清，加入

4mL预冷含15%甘油的

0.05mol/L的CaCl2

溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。感受态细胞分装成

200μL的小份，贮存于-70℃可保存半年。2.感受态细胞的制备(CaCl2

法)实验注意事项细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可通过监测培养液的OD600

来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5×107

个/mL左右，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体

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