材料近代测试技术：第四章 高效液相色谱法

第四章高效液相色谱法一、高效液相色谱的特点与仪器featureandinstrumentofHPLC二、基本原理与主要分离类型basicprincipleandmainseparatingtype三、固定相与流动相stationaryphaseandmobilephase第四章高效液相色谱分析液相色谱仪（1）液相色谱仪（2）一、高效液相色谱法的特点与经典液相色谱法相比颗粒极细（一般为10m以下）、规则均匀的固定相，(键合相)传质阻抗小，柱效高，分离效率高；高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快；高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检测器最小检测限可达109g，而荧光检测器最小检测限可达1012g。4.1高效液相色谱的特点与仪器highperformanceliquidchromatography,HPLC

特点：高压、高效、高速

高沸点、热稳定差的有机及生化试样的高效分离分析方法。4.1高效液相色谱的特点与仪器一、高效液相色谱法的特点4.1高效液相色谱的特点与仪器一、高效液相色谱法的特点HPLC与GC：相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测

主要差别：分析对象、流动相及操作条件的差别1．分析对象

GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测，仅能分析有机物的20%

HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测，用途广泛，占有机物的80%2．流动相差别GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用

HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用。选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性3．操作条件差别

GC：加温操作;

HPLC：室温；高压其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。二、液相色谱仪流程及主要部件4.1高效液相色谱的特点与仪器输液系统进样系统分离系统检测系统控制与记录系统

脱气方法

（1）真空泵抽滤系统（2）低溶性惰性气体导入替换

（3）超声脱气

4.1高效液相色谱的特点与仪器二、液相色谱仪流程及主要部件活塞式输液泵4.1高效液相色谱的特点与仪器二、液相色谱仪流程及主要部件1.输液系统

包括流动相贮存器、高压泵和梯度仪三部分。

高压输液泵：将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。恒流泵：在输送流动相过程中流量恒定。常用柱塞往复泵双泵：为了克服流量的脉动。有串联式和并联式

高压泵的一般压强为l．47～4．4X107Pa，流速可调且稳定，当高压流动相通过层析柱时，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。输液系统输液泵应具备的性能：输出压力高流量精度高且稳定流量范围宽密封性能好耐腐蚀4.1高效液相色谱的特点与仪器二、液相色谱仪流程及主要部件输液泵操作注意事项：防止固体微粒进入泵体流动相不应含有腐蚀性物质防止溶剂瓶内的流动相被用完不超过规定的最高压力流动相一般应该先脱气分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度程序）来达到。梯度淋洗装置梯度淋洗装置外梯度:

利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度:

一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。可使流动相随固定相和样品的性质而改变，这就可使各种物质（即使仅有一个基团的差别或是同分异构体）都能获得有效分离。

2.进样系统

不使整个压力变化的情况下将样品注入色谱柱，通常使用六通阀

4.1高效液相色谱的特点与仪器二、液相色谱仪流程及主要部件六通阀4.1高效液相色谱的特点与仪器二、液相色谱仪流程及主要部件六通阀进样器的工作原理：手柄位取样(Load)位置时，样品经微量进样针从进样孔注射进定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔排出；将手柄转动至进样(Inject)位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液相分析柱进行分析。进样量是恒定的.各种色谱柱

柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。4.1高效液相色谱的特点与仪器二、液相色谱仪流程及主要部件3.分离系统该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。

紫外检测器荧光检测器示差折光检测器浓度型通用检测器，对所有溶质都有响应红外检测器电化学检测器质谱检测器HPLC检测器4.1高效液相色谱的特点与仪器二、液相色谱仪流程及主要部件4.检测系统常用LC检测器名称使用量商品化灵敏度价格/万元吸光度71％Yes100pg-1ng1荧光13%Yes1-10pg2-20电化学4.3%Yes10pg-1ng1-2折光5.4%Yes100ng-1ug1-电导Yes500pg-1ug1-质谱Yes-9910ng200FTIRYes1ug40光散射Yes-981ng5-40光离子化No1pg-1ng元素选择No10ng二、高效液相色谱法的主要类型和原理

和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相—固定相和流动相组成。液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。二、高效液相色谱法的主要类型和原理

1)液-固吸附色谱

liquid-solidadsorptionchromatography

固定相：为固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；

流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。

基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；

缺点：非线性等温吸附常引起峰的拖尾；2）液-液分配色谱

liquid-liquidpartitionchromatography

固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相

normalphase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相

reversephase）。正相与反相的出峰顺序相反；

固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；

化学键合固定相：现在应用很广泛（70~80%）。将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。3）离子交换色谱

ion-exchangechromatography

固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；

基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子与交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。

阳离子交换：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

阴离子交换：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-

应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。4）离子色谱

ionchromatography

离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一种技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。试样组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交换色谱法相同。

5）离子对色谱

ionpairchromatography

原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为，使其能够在两相之间进行分配；

阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；

反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-后；在两相间分配。6）排阻色谱

size-exclusionchromatography固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离尺寸排阻色谱色谱

7）亲和色谱(AC)

Affinitychromatograph

原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。

先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，