细菌鉴定流程

细菌鉴定流程细菌鉴定细菌形态学鉴定16SrDNA鉴定生理生化鉴定细菌形态学鉴定从-80˚Ϲ冰箱中取出菌株放4˚Ϲ复苏，轻柔混匀后用接种环接一环菌液在培养基平板上划线活化，根据菌株来源选择适宜的培养基。放入培养箱倒置培养，实验室一般采用28˚Ϲ培养，特殊菌株依据该菌最适条件（时间、温度）培养24-48h。3.纯化：从活化培养基平板上挑取单菌落继续划板培养。4.观察记录菌落形态特征：大小（mm）、形状、干湿、透明度、颜色、边缘整齐还是，，，，，，，细菌大小（mm）形状干湿透明度颜色边缘注意事项：接种划线应在酒精灯旁边操作培养时应倒置培养，防止污染二、革兰氏染色涂片固定将纯化后的菌株进行革兰氏染色，滴一滴生理盐水于载玻片上，无菌条件下用接种环挑取少量菌落均匀涂布水滴中，使其自然干燥，菌面向上，经火焰固定。注意事项：菌液涂片时不可过于浓厚，干燥、固定。固定时通过火焰1~2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。染色一般包括初染、没染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：加上结晶紫后，染色1分钟，水洗。加上碘液染色1分钟，水洗。加上95%酒精，摇动玻片，根据涂片厚度，脱色约20~60秒，水洗，吸去水分。加上蕃红后，染色1分钟，水洗。吸干或在空气中晾干后，油镜镜检。结果观察：革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以均匀分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，都常呈现假阳性。注意事项：①标本涂片不能太厚，严格按操作要求进行。若涂片较厚，应延长脱色时间，直至不再出现紫色为止。②玻片通过火焰温度不能太高。③碘液变透明，则不能使用。④水洗时动作要轻，沿载玻片对角线方向用洗瓶冲洗，以免把菌体冲掉。三、16SrDNA鉴定（16SrDNA只能鉴定到属，需进行生理生化、药敏实验等鉴定到种）1. 细菌复苏、活化、纯化同细菌形态学鉴定3. 挑取单菌落至少2-3个接到含有1ml灭菌纯水的1.5ml离心管中混匀。4. 沸水浴10min，12000rmp离心2min，取1.5ul上清作为模板，上下游引物各0.5ul加到23ul体系中，每个样品做3个平行，进行PCR扩增。注意事项：①使用离心机时一定要配平，防止损坏离心机。②实验前所用离心管、纯水、枪头要灭菌后使用。（若结果不理想则用改良方法）1．收集菌体，或直接从平板上刮取细菌（直径约1.5-2mm左右大小菌落的菌量），加入含20ul0.1-0.5%TritonX-100的200ulPCR管中，充分重悬。2．对于较难散开的细菌则可采用500ul体积（同样含0.1-0.5%TritonX-100），使用超声重悬（菌体相应增加），处理后取出20ul加入200ulPCR管中。3.将上述PCR管置于沸水中水浴处理5分钟，短暂离心（约30s）后，取1ul作为模板加入20ul（或25ul）体系中，进行PCR扩增。0.1-0.5%TritonX-100的配置：①30%储备液的配置TritonX-1001.41ml0.1mol/LPBS(pH=7.3)3.64ml充分混合后，置37℃～40℃水浴中2～3h，使其充分溶解混匀，备用。②用前取该储备液稀释至所需浓度，取1-5ul储备液加入300ul双蒸水中。普通PCR体系：（23ul反应体系）50管×PCR体系配制ddH2O918.5ul10×buffer125uldNTP100ulrTaq6.5ul配制体系所用的200μlPCR管、1.5ml离心管、纯水、1ml枪头、200μl枪头、10μl枪头均需灭菌，且在无菌操作台中操作。配制体系前先将50个200μl的PCR管放在冰盒上预冷。取一个无菌的1.5ml离心管，依次将药品加入管中，在漩涡混合器上混合5~10秒。每23μl分装入200μlPCR管中，放-20˚Ϲ备用。使用体系之前先验证体系是否好用。例如：取实验室已知菌加16s上下游引物进行PCR反应，电泳后凝胶成像系统观察是否有已知条带。注意事项：（1）10×buffer、dNTP、rTaq用完尽快放回-20˚Ϲ保存。（2）无菌操作PCR程序：94˚Ϲ5min94˚Ϲ30s35个循环55˚Ϲ30s72˚Ϲ1min30s72˚Ϲ10min4˚Ϲ1minPCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳先安装配胶槽，再将梳子插到槽中缓冲液的配制：50×TAEBuffer储备液Tirs12.1g、Na2EDTA.2H2O1.86g，加30ml去离子水搅拌溶解，加醋酸2.855ml充分混匀，去离子水定容至50ml。1×TAEBuffer取10ml50×TAEBuffer储备液加490ml的纯水，摇匀，待用。配胶：琼脂糖0.15g缓冲液（1×TAE）15ml加热煮沸3次待温度降低到50˚Ϲ~60˚Ϲ时加入1滴核酸染液（GoldView）摇匀倒入槽内待胶凝固约30min。拔出梳子，将凝胶放入水平电泳槽中，保证缓冲液没过梳孔。上样：取3ul标准DNAMaker点入左边第一个梳孔，从左到右顺序点样。取一只塑料手套，将1ul6×Loadingbuffer点到手套上取3ulPCR产物与1ul6×Loadingbuffer即3:1混匀点入梳孔。6．盖上电泳槽盖子，恒压120V电泳，至溴酚蓝跑到胶的1/3处停止电泳（约20min），用凝胶成像系统进行采集观察，其浓度与DNAMaker比较，即亮度和长度。7.如果与预测结果相同时，填写送出测序的单子，并联系北京华大基因有限公司，同时将至少40μlPCR产物放4˚Ϲ保存待测序公司来取样。PCR产物送进行测序。*注意事项：核酸染液属于致癌物质，配胶以及与胶有关的仪器一定要戴胶皮手套操作测序结果分析：将测序结果掐头去尾后在NCBI（/）网站上进行BLAST比对。具体操作步骤如下：粘该菌序列粘该菌序列可参照相似度95%以上为可信结果。结合细菌形态学鉴定、革兰氏染色、16SrDNA比对结果初步判定该菌是属于哪个属，进行以下实验。四、生理生化鉴定选用API相关菌属鉴定试剂盒，具体类型参照以下：（1）API20E鉴定革兰氏阴性杆菌（2）APIListeria鉴定李斯特菌（3）API20NE鉴定非肠道革兰氏阴性杆菌（4）API20CAUX鉴定酵母菌（5）API20A鉴定厌氧菌（6）APICoryne鉴定棒状杆菌（7）API50CHB鉴定芽孢杆菌（8）APICampy鉴定弯曲菌（9）APIStaph鉴定葡萄球菌和微球菌（10）APIStrep鉴定链球菌（11）API50CHL鉴定乳酸杆菌（12）APINH鉴定奈瑟氏菌、嗜血杆菌、布兰汉球菌检测方法：（具体参考说明书）试剂条的准备：准备培养盒（盘和盖子），向盘的蜂窝状孔中倒入约5ml蒸馏水或去离子水，创一种潮湿的环境。将菌株参考号记录在托盘的长条上，从各个包装中取出试剂条，将试剂条放入培养盒中。2.接种物的准备：用0.9%的生理盐水将培养板上的菌冲下收集（建议使用早期培养物18~24h），该菌悬液制备好后必须立即使用。3.试剂条的接种：将菌悬液接种到微型管中，只填充试管部分，杯型器不填充（微型管留少许不充满）。将试剂条稍前倾，将吸管或滴管的顶部靠在杯的侧面，以免管的底部形成气泡。4.用矿物油填充杯形器，形成凸出弯月面，以保证ADH和URE实验的无氧环境。5.在36˚Ϲ下培养18~24h。五、药敏实验将平板上纯化出的菌用2~3ml0.9%灭菌生理盐水冲下，制成菌悬液。无菌条件下取100μl菌悬液到培养基平板上。根据培养基的干湿程度适当调整菌悬液的用量。三角玻璃刀蘸酒精后，经过酒精灯高温灭菌，待火灭后温度降低至20˚Ϲ左右，均匀涂布将药敏纸片贴到平板上，每个平板上可贴4个药敏纸片，常用水产药物：诺氟沙星（氟哌酸）、头孢曲松（菌必治）、庆大霉素、奥复星（氧氟沙星）、头孢哌酮、强力霉素、四环素、卡那霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、环丙沙星、链霉素、吡哌酸、先锋霉素、氨苄西林、青霉素、利福平、多粘菌素、磺胺甲基异恶唑28℃恒温培养24h后测量抑菌圈直径大小。注意事项：贴药敏纸片时字朝里正置培养例如：配制培养基例如：NA固体培养基（1） 称取蛋白胨3.3g放入三角锥形瓶中。（海水培养基加NaCl至终浓度为20‰）（2） 蒸馏水定容至100ml，并放入转子，用锡箔纸封口，记号笔标注时间名称。（3） 将三角锥形瓶放在磁力搅拌器上高温搅拌，待液体透明并大量气泡产生时迅速拿下（戴手套，防止烫伤），用吸铁吸出转子。（4） 将三角锥形瓶、装有平板的铁桶放