酶反应原理课件

（1）米氏方程（Michaelis-Mentenequation）V=Vmax[S]Km+[S]米氏方程解释：当[S]Kmv=(Vmax/Km)[S],即v[S]当[S]KmvVmax,即[S]而v不变米氏方程成立条件：

初速度为标准稳态（steadystate）（2）米氏方程推导测定Km和V的方法很多，最常用的是Lineweaver–Burk的作图法—

双倒数作图法。

1Km11

=

+

V

Vmax[S]Vmax取米氏方程式的倒数形式：1/Vmax斜率=Km/Vmax-1/Km米氏常数Km的测定：例题D-丝氨酸脱水酶需要磷酸吡哆醛作为辅酶。催化反应：CH2OH·CHNH2·COOHCH3CO·COOH+NH3在实验中测定酶的磷酸吡哆醛饱和曲线得到下列数据：

[s]v磷酸吡哆醛10-5（M）

20分钟生成丙酮酸（M）

0.200.1500.400.2000.850.2751.250.3151.700.3402.000.3508.000.360用这些数据求丝氨酸脱水酶对磷酸吡哆醛的表观米氏常数。

vVm0.30.2Vm20.101234567810-6[S]丙酮酸M/20minVm=0.361/2Vm=0.18Km=3.210-6M解：1、v对[S]作图法:

磷酸吡哆醛10-

5（M）

20分钟生成丙酮酸（M）

[S]1/[S]v1/v0.205.00.1506.660.402.50.2005.000.851.170.2753.641.250.800.3153.171.700.580.3402.942.000.500.3502.868.000.1250.3602.78解2、1/v对1/[S]作图法：2、酶浓度对反应速度的影响反应速度与酶浓度成正比：当[S][E],式中Km可以忽略不计。k3[E][S]Km+[S]=k3[E]v=v[E]o酶的最适pH:酶催化活性最高时的pH。2810pH酶的活性

pH对某些酶活性的影响A:胃蛋白酶;B:葡萄糖-6-磷酸酶4、pH对酶促反应速度的影响AB5、抑制剂对酶促反应速度的影响抑制作用:直接或间接地影响酶的活性中心,使酶活性降低或丧失。抑制剂：凡能降低酶活性而不引起酶蛋白变性的物质。（1）不可逆抑制（irreversibleinhibition）

SH

SE+Hg2+EHg+2H+

SH

S

SH

Cl

SE+As-CH=CHClEAs-CH=CHCl+2HCl

SH

Cl

S巯基酶路易士气例1：巯基酶的抑制抑制剂与酶的必需基团以牢固的共价键结合,使酶丧失活性,不能用透析超滤等物理方法除去抑制剂使酶恢复活性.

SEHg+

SCOONaCHSHCHSHCOONa

SHE+Hg

SHCOONaCHS

CHSCOONa二巯基丁二酸钠

SCH2OHSHCH2OHEAs-CH=CHCl+CHSHE+CHS

SCH2SH

SHCH2SAs-CH=CHCl二巯基丙醇解毒方法：ROOROOROXROO—EP+E—OHP+HX有机磷化合物羟基酶磷酰化酶(失活)ROOROO—EP+-CHNOH磷酰化酶(失活)N+CH3

-CHNN+CH3OOROOR+E—OH

P例2：羟基酶的抑制羟基酶:有丝氨酸侧链上的羟基为必需基团的酶有机磷(敌百虫、敌敌畏、对硫磷)不可逆抑制羟基酶的活性中心解磷定（2）可逆抑制(reversibleinhibition)抑制剂与酶以非共价键疏松结合引起酶活性的降低活丧失,结合是可逆的,能够通过透析、超滤等物理方法使酶恢复活性。可逆抑制类型：竞争性抑制(competitiveinhibition)非竞争性抑制（non-competitiveinhibition）反竞争性抑制（uncompetitiveinhibition）竞争性抑制的动力学方程:v=Vmax[S]Km(1+[I]/Ki)+[S]1v=KmVmax(1+)+[I]Ki1[S]1Vmax竞争性抑制的特征曲线：[I]正常1v1[S]1Vmax-1Km(1+)[I]Ki-1Km竞争性抑制的特点：I与S分子结构相似；Vmax不变，表观Km增大；抑制程度取决于I与E的亲和力，以及[I]和[S]的相对浓度比例。（4）非竞争性抑制non-competitiveinhibition）SSEEEE+PSESIIII概念抑制剂与酶分子活性中心以外的其它部位结合而抑制酶活性，I和S与酶结合不存在竞争关系。非竞争性抑制作用过程：

非竞争性抑制的动力学方程:1v=KmVmax(1+)+[I]Ki1[S]1Vmax（1+）[I]Ki非竞争性抑制的特征曲线：1v正常[I]1[S]-1Km1Vmax(1+)[I]Ki概念抑制剂仅与酶和底物的中间复合物结合而抑制酶活性。

反竞争性抑制作用过程：

EEE+PEIISSS（5）反竞争性抑制（uncompetitiveinhibition）反竞争性抑制的动力学方程:v=Vmax[S]Km+(1+[I]/Ki)[S]1v=KmVmax(1+)[I]Ki1[S]1Vmax反竞争性抑制的特征曲线：[I]正常1v1[S]1Vmax-1Km[I]Ki+(1+)-1Km1Vmax(1+)[I]Ki反竞争性抑制的特点：1、I与S分子结构不同,I只与ES结合2、Vmax和表观Km都减小；3、抑制程度取决于[I]和[ES]二者的浓度。氰化物或肼对芳香硫酸酯酶的抑制6、激活剂对酶促反应速度的影响（1）激活剂:凡能使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质。如：金属离子：Mg2+、

K+、Mn2+阴离子：Cl-

有机物：胆汁酸盐（2）分类：必需激活剂Mg2+对己糖激酶非必需激活剂Cl-

对淀粉酶四、酶活性测定1、酶活性酶的催化能力，以酶促反应速度来衡量。2、酶活性单位指酶促反应在单位时间（s,min,h）内生成一定量（mg,μg,μmol）的产物或消耗一定量的底物所需的酶量。一个国际单位（IU,1976年）：在特定条件下,1min内使底物转变1μmol所需的酶量；一个催量（kat）：在特定条件下,1Sec内使底物转变1mol所需的酶量

1I.U.=16.6710-9kat=16.6710-3

Kat；

1Kat=6107I.U.

酶比活：每毫克蛋白所含有的每活力单位数。3、酶活力测定包括两个阶段：反应阶段和测定阶段。一般采取如下步骤：(1)根据酶的专一性，选择适宜的底物，并配制成一定浓度的底物溶液。要求底物均匀一致，具有一定的纯度，新鲜配制。（2）确定酶促反应的温度，pH值等条件。温度可选酶反应最适温度pH值应是酶促反应的最适pH值反应条件在反应过程中应尽量保持恒定不变。(3)酶液与底物溶液在规定状态下混合开始反应。(4)适时测定产物的生成量或底物的减少量。终止酶反应的方法①加热失活：酶反应时间一到立即取出适量的反应液，置于沸水浴中；②变性失活：酶反应时间一到立即加入适宜的酶变性剂，如三氯醋酸等；③酸碱失活：酶反应时间一到使反应液的pH值迅速远离酶催化反应的最适pH，从而终止反应；④低温失活：酶反应时间一到将取出的反应液立即置于冰粒堆中或冰盐溶液中，使反应液的温度迅速降低至10℃以下。固定化酶的活力测定振荡测定法：称取一定重量的固定化酶，放在一定形状，一定大小的容器中，加入一定量的底物溶液，在特定的条件下，一边振荡或搅拌，一边进行催化反应经过一定时间，取出一定量的反应液进行测定。注意点：

（1）在振荡或搅拌速度速度不高时，反应速度随振荡或搅拌速度的增加而升高，在达到一定水平后不再升高。（2）若速度过大，可能引起固定化酶的结构破坏，缩短固定化酶的使用寿命。（3）底物浓度，pH值，温度，反应时间等条件可与游离酶活力测定的条件相同。例题：某无细胞的粗提液，每mL含20mg蛋白质。在0.5mL的标准总反应体积中，含有10L这中提取液。在最适宜条件下，一分钟内生成30ng的产物。求：用下述单位表示反应速度v:nmol/ml/min,nmol/L/min,mol/L/min,mol/L/min若10l该提取液，在1ml总反应体积中进行实验，其反应速度是多少？反应混合液和提取液中酶活性浓度各是多少？酶制剂的比活力是多少？解：V=30/0.5=60nmol/ml/min=60103nmol/L/min=60mol/L/min=610-5mol/L/minV=30/1=30nmol/ml/min=310-5mol/L/min反应液酶活性浓度=60nmol/ml/min

=0.06mol/ml/min=0.06单位/ml0.5ml的反应液内含0.03单位酶，即10l(0.01ml)提取液含0.03单位酶，所以：提取液酶活性浓度=0.03/0.01=3单位/ml酶比活=3/20=0.05单位/mg蛋白五、酶的分类与命名(一)分类1961年国际酶学委员会（EnzymeCommittee,EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把蛋白类酶分成6大类：1.氧化还原酶类：主要是催化氢的转移或电子传递的氧化还原反应。AH2+B（O2）A+BH2（H2O2，H2O）（1）脱氢酶类：催化直接从底物上脱氢的反应。AH2+BA+BH2（需辅酶Ⅰ或辅酶Ⅱ）（2）氧化酶类①催化底物脱氢，氧化生成H2O2：AH2+O2A+H2O2（需FAD或FMN）②催化底物脱氢，氧化生成H2O：2AH2+O22A+2H2O（3）过氧化物酶ROO+H2O2RO+H2O+O2（4）加氧酶（双加氧酶和单加氧酶）O2+OHOHC=OC=OOHOH（顺，顺-已二烯二酸）ROH+H2O+氧化型辅助因子RH+O2+还原型辅助因子（又称羟化酶）2.转移酶类：催化化合物中某些基团的转移。A·X+BA+B·X根据X分成8个亚类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烃基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。3.水解酶类：催化加水分解作用。AB+H2OAOH+BH4.裂解酶类：催化非水解性地除去基团而形成双键的反应或逆反应。CH3C=OCOOHC—C键CH3C=OH+CO2C—O键CH2COOHHO—CH—COOHHCCOOHHOOCCH+H2OC—N键COOHCH—NH2CH2COOHCOOHCHHCCOOH+NH35.异构酶：催化各种异构体之间的互变。AB常见的有消旋和变旋、醛酮异构、顺反异构和变位酶类。6.合成酶类：催化有ATP参加的合成反应。A+B+ATPA·B+ADP+Pi7.核酸酶（催化核酸）Ribozyme（1）ribozyme的发现

80年代初期，美国科罗拉多大学博尔德分校的ThomasCech和美国耶鲁大学的SidneryAltan各自独立地发现RNA具有生物催化功能.从而改变了生物催比剂的传统概念。为此，T.Cech和S.Altman共同获得了1989年度诺贝尔化学奖。（2）Ribozyme的种类根据催化底物是否是本身的RNA分为：分子内酶（incis）包括：自我剪切酶、自我剪接酶分子间酶(intrans）包括：RNA剪切酶、DNA剪切酶、多糖剪切、多糖剪接酶、氨基酸酯剪切酶、多功能酶根据结构特点锤头型酶、发夹型酶、IVS酶；自我剪接ribozyme简介自我剪接ribozyme比较复杂，通常包括200个以上核苷酸，主要催化mRNA前体的剪接反应。四膜虫核糖体前体RNA可以在体外无蛋白质参与下除掉它自身413nt内含子。具有核酸内切酶和连接酶活性。自我剪接ribozyme可分为两类：