演示文稿基因工程的基本操作程序

基因工程转基因生物基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。该技术是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。什么是基因工程？练习：基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定1.1DNA重组技术的基本工具准确切割DNA的工具（“分子手术刀”）——限制性内切酶DNA片段的连接工具（“分子缝合针”）——DNA连接酶基因转移工具（“分子运输车”）——运载体概述：切割DNA的工具是限制性核酸内切酶，又称限制酶。这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。现在已分离出约4000种限制酶。限制酶能识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列。一、限制性核酸内切酶—“分子手术刀”一、限制性核酸内切酶—“分子手术刀”特点：限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且在特定的位点切割DNA分子。（专一性）例如：大肠杆菌(E.coli)的EcoRⅠ限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。黏性末端黏性末端回文序列如何切割DNA分子呢？DNA分子磷酸二酯键切割DNA分子实质是断开两个核苷酸之间的磷酸二酯键。一、限制性核酸内切酶—“分子手术刀”思考：（1）在一个DNA分子片段中，含有

个游离的磷酸基团，如果是环状DNA分子呢？切割DNA分子后形成什么呢？产物：

黏性末端（在中轴线两侧切割DNA）平末端（在中轴线处切割DNA）一、限制性核酸内切酶—“分子手术刀”小结：（1）限制酶的种类、分布、特点、作用部位、作用结果；（2）练习1.酶的的种类：：二、DNA连接接酶—““分子缝缝合针””（1）E·coliDNA连连接酶只只能将双双链DNA片段段互补的的黏性末端端之间连接接起来。。（2）T4DNA连连接酶（（噬菌体体）两种酶的的区别：：（1）E·coliDNA连连接酶（（大肠杆杆菌）（2）T4DNA连连接酶都都能连接接黏性末端端和平末端，，但连接平平末端之之间的效效率比较较低。2.酶的的作用：：将双链DNA分分子片段段“缝合合”起来来，恢复复两个核核苷酸之之间的磷酸二酯酯键。二、DNA连接接酶—““分子缝缝合针””思考：比比较(考点一一)限制性内内切酶与与DNA连接酶酶跟踪演练练：AATTGCCTTAAG磷酸二酯酯键磷酸二酯酯键DNA复制思考：比比较DNA连连接酶和和DNA聚酶？？DNA聚聚合酶只只能将单个核苷苷酸加到已有有的单链核苷酸片片段的末末端，形形成磷酸酸二酯键键,需要要摸板。。DNA连接酶酶是连接接两个双链链DNA片段的末端，，形成磷磷酸二酯酯键,不不需要摸摸板。要让一个个从甲生物细胞胞内取出出来的基基因在乙生物体内内进行表表达，首首先得将将这个基基因送到到乙生物物的细胞胞内去。。能将外外源基因因送入细细胞的工工具就是是运载体。常用的的载体是是质粒，还还有λ噬菌体体的衍生生物、动动植物病病毒等。三、基因因进入受受体细胞胞的载体体—“分分子运输输车”作为基因因工程运运载体的的条件①能够在在宿主细细胞中复制并稳定地保存。②具多种限制制酶切点点，以便与与外源基基因连接接。③具有某某些标记基因因，便于进进行筛选。④载体是是安全的的，不能能对受体体细胞有有害。⑤载体DNA分分子大小小应合适适，以便便提取和和在体外外进行操操作。。。（2009高考考-理综综山东东）35.人人类在在预防与与诊疗传传染性疾疾病过程程中，经经常使用用疫苗和抗抗体。已知某某传染性性疾病的的病原体体为RNA病毒毒，该病病毒表面面的A蛋蛋白为主主要抗原原，且疾苗生产产和抗体体制备的流程之之一如下下图：四、典型型例题解解读———基因工工程与细细胞工程程请回答：：（1）过过程①代代表的是是。（2）过过程②构构建A基因表过过载体时，必须须使用和两种工具酶。（3）过过程③采采用的实实验技术术是，获得的的X是。（4）对对健康人人进行该该传染病病免疫预预防时，，可选用用图中基因工工程生产产的所制备的的疫苗。。对该传染病疑疑似患者者确诊时时，可以以疑似患患者体内内分离病毒，，与已知知病毒进进行比较；或或用图中中的进行特异异性结合合检测。。参考答案案：（1）逆逆转录录（2）限限制性性核酸内内切酶（（限制酶酶\限制制性内切切酶）DNA连连接酶（（两空可可以互换换）（3）细细胞融融合杂交瘤细细胞（4）A蛋白白核酸（基基因）序序列抗A蛋白白的单克克隆抗体体合成基因组织、器官、细胞基因组DNAcDNA文库基因文库目的基因的克隆基因工程程的基本本操作程程序第一步：：目的基因因的获取取如何建立立?基因组DNA文文库与cDNA文库的的比较②基因文库库的构建建a.直直接分离离法:②基因文库库的构建建a.直直接分离离法:②基因文库库的构建建a.直直接分离离法:基因组文文库的构构建②基因文库库的构建建a.直直接分离离法:基因组文文库的构构建②基因文库库的构建建a.直直接分离离法:基因组文文库的构构建b.反转转录法：：②基因文库库的构建建a.直直接分离离法:基因组文文库的构构建b.反转转录法：：mRNAcDNA(互补DNA)双链DNA反转录DNA聚聚合酶②基因文库库的构建建a.直直接分离离法:基因组文文库的构构建b.反转转录法：：mRNAcDNA(互补DNA)双链DNA反转录DNA聚聚合酶cDNA文库的的构建②基因文库库的构建建a.直直接分离离法:基因组文文库的构构建b.反转转录法：：解读cDNA文文库的构构建过程程(1)提提取某种种生物发发育某一一时期的的mRNA;(2)mRNA反转录录形成DNA片片段;(3)DNA片片段与载载体连接接后,储储存在一一个受体体菌的群群体中。。文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子(具有启动作用的DNA片段)无有基因中内含子(位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段)无有基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以cDNA文库和和基因因组文库库的区区别DNA复制PCR技术基因克隆场所细胞核或细胞器生物体外细胞内酶解旋酶、DNA聚合酶耐高温DNA聚合酶限制酶、连接酶载体不需要不需要需要遵循原则碱基互配对碱基互配对碱基互配对结果形成DNA分子形成DNA分子片段形成DNA分子片段DNA复复制、PCR技技术与基基因克隆隆的比较较三种目的的基因提提取的方方法有何何优缺点点？优点缺点鸟枪法反转录法根据已知氨基酸合成DNA法操作简便便广泛使使用工作量大大，盲目目，分离离出来的的有时并并非一个个基因专一性强强操作过程程麻烦，，mRNA很不不稳定，，要求的的技术条条件较高高专一性最最强仅限于合合成核苷苷酸对较较少的简简单基因因目的基因因转移转转化或感感染合成基因组织、器官、细胞基因组DNAcDNA文库基因文库目的基因的克隆基因工程程的基本本操作程程序第二步：：基因表达达载体构构建（二）基因因表达载载体的构构建———核心（二）基因因表达载载体的构构建———核心1.作用用（二）基因因表达载载体的构构建———核心1.作用用（1）使目的基基因在受受体细胞胞中稳定定存在并并遗传给给子代（二）基因因表达载载体的构构建———核心1.作用用（1）使目的基基因在受受体细胞胞中稳定定存在并并遗传给给子代（2）同时使目目的基因因能表达达和发挥挥作用（二）基因因表达载载体的构构建———核心1.作用用（1）使目的基基因在受受体细胞胞中稳定定存在并并遗传给给子代（2）同时使目目的基因因能表达达和发挥挥作用2.组成成（二）基因因表达载载体的构构建———核心1.作用用（1）使目的基基因在受受体细胞胞中稳定定存在并并遗传给给子代（2）同时使目目的基因因能表达达和发挥挥作用2.组成成（二）基因因表达载载体的构构建———核心1.作用用（1）使目的基基因在受受体细胞胞中稳定定存在并并遗传给给子代（2）同时使目目的基因因能表达达和发挥挥作用2.组成成目的基因因启动子终止子标记基因因（二）基因因表达载载体的构构建———核心3.构建建过程（二）基因因表达载载体的构构建———核心3.构建建过程①用一定定的________切割质质粒，使使其出现现一个切口，，露出_________。。②用____________切断断目的基基因，使使其产生生_________________。③将切下下的目的的基因片片段插入入质粒的的______处，再加加入适量量____________，形成成了一个个重组DNA分子子（重组组质粒））（二）基因因表达载载体的构构建———核心3.构建建过程①用一定定的________切割质质粒，使使其出现现一个切口，，露出_________。。②用____________切断断目的基基因，使使其产生生_________________。③将切下下的目的的基因片片段插入入质粒的的______处，再加加入适量量____________，形成成了一个个重组DNA分子子（重组组质粒））限制酶黏性末端端（二）基因因表达载载体的构构建———核心3.构建建过程①用一定定的________切割质质粒，使使其出现现一个切口，，露出_________。。②用____________切断断目的基基因，使使其产生生_________________。③将切下下的目的的基因片片段插入入质粒的的______处，再加加入适量量____________，形成成了一个个重组DNA分子子（重组组质粒））限制酶黏性末端端同一种限限制酶相同的黏黏性末端端（二）基因因表达载载体的构构建———核心3.构建建过程①用一定定的________切割质质粒，使使其出现现一个切口，，露出_________。。②用____________切断断目的基基因，使使其产生生_________________。③将切下下的目的的基因片片段插入入质粒的的______处，再加加入适量量____________，形成成了一个个重组DNA分子子（重组组质粒））限制酶黏性末端端同一种限限制酶相同的黏黏性末端端切口DNA连连接酶人胰岛素素基因与与质粒结结合形成成重组质粒粒质粒DNA分分子一种限制制酶处处理一个切口口两个黏性性末端两个切切口获得目目的基基因DNA连接接酶重组DNA分子子(重重组质质粒)你知道道双酶酶切法法吗？？例1（（10年江江苏高高考））下表表中列列出了了几种种限制制酶识识别序序列及及其切切割位位点，，图1、图图2中中箭头头表示示相关关限制制酶的的酶切切位点点。与只使使用EcoRⅠ相相比较较，使使用BamHⅠ和和HindⅢ两两种限限制酶酶同时时处理理质粒粒、外外源DNA的优优点在在于可可以防防止___________________。×√√√原核细胞表达真核细胞表达植物中表达动物中表达人体表达发酵工程转基因植物动物器官发生器转基因动物基因治疗目的基基因转转移转转化化或感感染合成基因组织、器官、细胞基因组DNAcDNA文库基因文库目的基因的克隆基因工工程的的基本本操作作程序序第三步步：将目的的基因因导入入受体体细胞胞第四步步：目的基基因的的检测测与鉴鉴定3、将将目的的基因因导入入受体体细胞胞方法：：将目的的基因因导入入植物物细胞胞：农杆菌菌转化化法（双子叶叶植物物和祼祼子植植物）、基因因枪法法（单子叶叶植物物）、花粉粉管通通道法法将目的的基因因导入入动物物细胞胞显微注注射法法将目的的基因因导入入微生生物细细胞感受态态细胞胞将目的的基因因导入入植物物细胞胞农杆菌菌转化化法类型步骤检测内容方法结果显示分子水平检测第一步目的基因是否插入受体细胞DNADNA分子杂交是否显示杂交带第二步目的基因是否转录出mRNADNA与mRNA分子杂交是否显示杂交带第三步目的基因是否翻译出蛋白质抗原—抗体杂交是否显示杂交带个体水平鉴定包括做抗虫，抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；对基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较，以确定功能是否相同。4.目目的基基因的的检测测与鉴鉴定4、目目的基基因的的检测测与鉴鉴定鉴定：：（个个体水水平））抗虫鉴鉴定、、抗病病鉴定定、活活性鉴鉴定等等4、目目的基基因的的检测测与鉴鉴定将每个个受体体细胞胞单独独培养养形成成菌落落，检检测菌菌落中中是否否有目目的基基因的的表达达产物物。淘淘汰无无表达达产物物的菌菌落，，保留留有表表达产产物的的进一一步培培养、、研究究。无表达产物无表达产物有表达产物无表达产物1、例22、课课时作作业：：1、、2、、3、、6、、7、、8、、9、10、11思考：：跟踪演演练2四、典典型例例题解解读———基因工工程操操作过过程3、（（2008