狂犬病监测和实验室检测技术培训狂犬病实验室操作手册

美国CDC狂犬病实验室操作手册直接免疫荧光试验（DFA）检测中脑组织印片的制备目的：用标准的操作规范正确地鉴定用于狂犬病毒检测的脑组织部位；对脑组织进行解剖，制作脑组织印片。取样：狂犬病诊断实验要求对小脑（包括小脑蚓、左叶和右叶）和脑干的整个横截面进行检验。如果不能获得小脑组织，应该对脑干和海马回（左、右）进行检验以诊断狂犬病。材料：脑组织来源A.狗或浣熊B.鼠（蝙蝠脑组织采用同样的处理方法）C.臭鼬或猫鼬手术刀（一次性）镊子（一次性）脑组织储存管纸巾载玻片，3孔或2孔聚四氟乙烯树脂覆盖表面的带孔载玻片玻片架，聚丙烯塑料桌垫消毒塑料大烧杯丙酮记号笔铅笔（在载玻片的毛玻璃面末端做标记）培养皿锐器盒，用于放置废弃的一次性手术刀仪器设备：生物安全柜（II级）-20℃操作步骤：在载玻片上用铅笔标记动物种类（缩写），脑组织取样部位名称（如脑干、小脑）以及操作者名字首字母。如果脑组织体积比较大，最好使用脑组织的多个部位制备多张脑组织印片；一次只操作一份样本；把脑组织置于培养皿上，便于操作；A．定位并鉴别脑组织成分确定脑干的位置。有时需要将脑组织倒置才能找到脑干。确定小脑的位置。小脑外表面有三个紧致旋绕的叶状区域。确定海马回（左、右）的位置。要确定海马回的位置就必须解剖完整的脑组织样本，沿中线切开两个脑半球，就会发现海马回为突出于脑室之外的白色圆柱状组织。B．准备脑组织横切面，用于制备脑组织印片制备脑干的横切面，将其置于纸巾上。制备小脑的横切面，将其置于纸巾上。制备海马回（左、右）的横切面，将其置于纸巾上。在必要的情况下，将组织横切面分成若干小块，以便使脑组织印迹能够适合载玻片孔径的大小。用脑组织切面轻轻接触载玻片来制备脑组织印片；在标记好的载玻片上，使用每个脑组织制备两个印片（至少含有1个脑干组织印片和1个小脑组织印片）。海马回也可以用做印片练习，但不检测。用纸巾充分吸干并除去印片上多余的脑组织。确定鼠脑样本小脑和脑干的位置制备小脑和脑干的横切面，置于纸巾上在标记好的载玻片上，用脑组织切面轻轻接触载玻片来制备脑组织印片用纸巾充分吸干并除去印片上多余的脑组织。风干载玻片。把每组印片放在单独的玻片架上，并标明名字和组名用以区别。实验操作人员会用丙酮来固定脑组织印片。注：脑组织印片在-20℃用丙酮固定至少1小时。每个检测样本和对照样本都应在单独的容器内进行固定，避免印片之间发生交叉污染。DFA检测狂犬病毒抗原目的：用商业化狂犬病检测试剂对多种脑组织样本进行DFA检测，练习标准的DFA操作方法。材料：丙酮固定的脑组织印片在周一准备实验样本（3）阴性和阳性对照样本的脑组织印片微孔板盖，在染色和转移过程中盖住印片。Fujirebio公司：FDI；Millipore公司：LightDiagnosticsDFAI；Millipore公司：LightDiagnosticsDFAII；或Millipore公司：LightDiagnosticsDFA抗狂犬病多克隆抗体。PBS稀释液+伊文思蓝与0.45um的低分子量蛋白结合滤器相适应的注射器冲洗用PBS（0.01M的磷酸盐缓冲液，PH7.4-7.6，制备方法：8.5g氯化钠，0.23g磷酸氢二钾，1.46g磷酸二氢钾,去离子水补至1L）20%甘油-Tris缓冲盐溶液10.盖玻片11.盛放载玻片的不锈钢托盘12．塑料桌垫13.消毒塑料大烧杯仪器设备：37℃保湿型恒温培养荧光显微镜操作步骤：将脑组织印片从丙酮固定液中取出，室温晾干。每个实验参与者都将根据标准实验操作方法用2种抗原结合物检测脑组织印片。用PBS稀释液（含伊文思兰）稀释抗狂犬病毒抗原结合物至工作浓度，并充分混匀。因为浓度的不同，所以对每种抗原结合物稀释至工作浓度的准备分别会有说明。用0.45um孔径的低分子量蛋白结合滤器过滤稀释的抗原结合物。每张印片的每个孔中加入足以覆盖整个孔的抗原结合物。将印片放在37℃的湿盒中孵育30分钟，以免结合物干燥。冲洗载玻片：A.去除印片上多余的抗原结合物，用PBS温和的冲洗印片，然后将印片在PBS液中浸泡3-5分钟（每个实验样本和对照样本的印片都应该放在单独的容器中浸泡，避免印片间发生交叉污染）。B.弃掉废旧的PBS液，将印片置于新的PBS缓冲液中继续浸泡3-5分钟。注：无需蒸馏水冲洗。C.将印片倒置在纸巾上去除多余的液体（不能在纸巾上按压印片）。在盖玻片加封片剂之前，将印片放在纸巾上顺次排开，风干。用1ml配有0.45um低分子量蛋白结合滤器的注射器在盖玻片上滴加少量20%的甘油-tris缓冲液封片剂。印片上的每个小孔只需要很小的一滴封片剂，将印片倒置放在盖玻片上，轻轻按压印片的背面，用吸水纸吸去多余的封片剂。封片后2小时之内观察印片。狂犬病毒特异性染色在这期间不会褪色。如果不能及时观察的话，应该将其置于冰箱中。染色的印片在-20℃能保存数周到数月。结果的观察和描述：所有被抗狂犬病毒结合物染色的组织都要在200×显微镜下观察荧光包涵体。任何提示可能为狂犬病的荧光都要在400×显微镜下进行确认.每一个待检动物的脑组织印片荧光结果都应由两名不同的显微镜操作技术人员来读取。狂犬病毒在感染动物脑组织内会产生大小和形状不一的胞浆内包涵体。单个显微镜视野中含有一些直径小于1µm的粉尘状颗粒,大量圆形或椭圆形的聚团,以及一些线性的直径在2到10µm的荧光物质。当被荧光标记抗体特异性染色后，这些包涵体颗粒变得光滑，而且边缘明亮,而中间区域染色较边缘要浅一些。每一个阳性荧光片的观察结果都以“染色强度/抗原分布”的形式被记录下来（例：+4/+2）。染色强度分为四个等级（+4，+3，+2，+1）,所有检测中使用的阳性对照应是+4级染色强度的荧光片(耀眼的苹果绿)。比+4级稍微弱一点的染色强度（稍微暗一些）为+3级，阳性样本如果没有得到最佳的处理其结果也会呈现染色强度为+3级。在没有确定其特异性的情况下，微弱可见的+2和+1级染色强度是不能做为狂犬病感染诊断依据的。即使染色强度的减弱可能是由于病毒抗原的变性引起，其荧光抗体和发炎或腐烂组织成分的非特异性结合也会导致荧光染色强度的减弱。抗原分布是根据抗原呈现的数量为依据进行分级的，如下：+4=几乎在所有视野中都会观察到大量的大小形状不一的包涵体颗粒；+3=几乎在所有视野中都会观察到大小形状不同的病毒包涵体颗粒,每个视野中包涵数目也不尽相同，在大多数视野中含有大量的包涵体；+2=在10%-50%的视野中观察到不同形状和大小的包涵体,但是大多数视野中只含少量可见的包涵体颗粒；+1=在不到10%的显微镜视野中观察到不同形状和大小的包涵体,而且每个视野下只可见少数的包涵体颗粒。结果报告：如果阳性对照荧光片是+4级染色强度和+3到+4级抗原分布,而阴性对照没有荧光时，检测样本为明显的阴性（没有特异性染色）或阳性（在用脑干、小脑或海马回组织的荧光片中至少是+3到+4级染色强度以及+2到+4级抗原分布）。说明：在检测报告出来前，所有的样本都应该妥善保存。在检测报告之后，分装的脑组织样本应该保存起来作为参考，而病畜的尸体和其它部分可以处理掉。当以下情况发生时，需要重复（证实性）检测:典型的狂犬病毒感染后包涵体颗粒在不到10％的视野中出现，或在多于10％的视野中有出现，但抗原分布极度稀疏（如每个视野中只有1到2个包涵体颗粒）；存在典型的狂犬病毒感染后包涵体颗粒，但染色强度较弱（〈+3）并且缺乏特征性；包含体形态不够典型，但表现出＋4级的染色强度（如结构大小均匀、形态规则）；大量荧光染色细菌的存在掩盖了少量狂犬病毒颗粒的特异性染色；游离荧光素或荧光颗粒的存在也会掩盖少量狂犬病毒颗粒的特异性染色；两种试剂的检测结果或两个技术人员的结果判定不一致。确定狂犬病毒染色特异性的确证性（重复）直接免疫荧光检测目的：确定免疫荧光反应的特异性。如果有必要做确证性直接免疫荧光检测（DFA），那么要用原始的脑组织样本再次制备一些印片。确证性DFA需要使用两种诊断试剂和至少一种特异性对照。异硫氰荧光素（FITC）标记的抗狂犬病毒超免疫血清诊断试剂（MilliporeLightDiagnosticsRabiesPolyclonalDFAReagent，山羊来源的，货号#5199）的特异性对照就是在同一动物宿主体内制备的FITC标记的免疫血清诊断试剂（MilliporeRabiesNegativeControl狂犬病阴性对照，NormalgoatIgGFITCconjugate，货号#5202）。类似的，用小鼠来源的单克隆抗体制备的狂犬病检测试剂（Fujirebio抗狂犬病毒诊断试剂，货号#800-092,MilliporeLight狂犬病直接免疫荧光诊断试剂DFAI,货号#5100,MilliporeLight狂犬病直接免疫荧光诊断试剂DFAII,货号#5500以及MilliporeLight狂犬病直接免疫荧光诊断试剂DFAIII,货号#6500）的特异性对照是同种类型异硫氰荧光素标记的小鼠单克隆抗体诊断试剂（MilliporeLight狂犬病诊断试剂阴性对照,FITC标记的单克隆抗体,货号#5102），只是它针对的是另外一种病原体，而不是狂犬病毒。对照试剂在使用时要稀释成和检测试剂相同的浓度（mg/mL）。不同脑组织部位都应该进行印片的制备和检测。如果因为任何原因导致检测不能重复，检测报告则应声明不能排除样本中狂犬病毒感染的存在，并且不建议将类似的样本暂时报告为阳性或者阴性。材料：丙酮固定的标本两张可同时检测三个样本的三孔载玻片阳性、阴性对照印片诊断试剂：FDI,DFAI,DFAII,或羊源多克隆DFA试剂诊断试剂的特异性对照试剂（如目的中所述）PBS（含伊文斯兰）用于检测试剂的稀释和特异性对照塑料桌垫消毒塑料烧杯仪器设备：37℃保湿型恒温培养箱荧光显微镜操作步骤:按以下方式将检测试剂和PBS（含伊文思兰）混合后滤过到固定好的印片上：在印片的最左侧孔中（即离毛玻璃面最近的一端）滴加一种检测试剂（FDI、DFAI、DFAII或多克隆抗体标记物），从阳性印片开始到阴性印片结束。在印片的中间孔中滴加另外一种不同的检测试剂（FDI,DFAI,DFAII或多克隆抗体标记物），包括阳性印片和阴性印片。FDI和DFAII在同一次检测中不能搭配使用，因为它们包括相同的抗狂犬病单克隆抗体。在印片最右侧的孔中滴加第二种检测试剂（中间孔）的特异性对照试剂，包括阳性印片和阴性印片。将滴加检测试剂的印片放在湿盒内，37度孵育30分钟，以防染色过程中检测试剂的干燥去除印片上多余的检测试剂，用PBS温和的冲洗印片，然后将印片在PBS液中浸泡3-5分钟（每个实验样本和对照样本的印片都应该放在单独的容器中浸泡，避免印片间发生交叉污染）。弃掉废旧的PBS液，将印片置于新的PBS缓冲液中继续浸泡3-5分钟。注：无需蒸馏水冲洗。将印片倒置在纸巾上去除多余的液体（不能在纸巾上按压印片）。在盖玻片加封片剂之前，将印片放在纸巾上顺次排开，风干。用1ml配有0.45um低分子量蛋白结合滤器的注射器在盖玻片上滴加少量20%的甘油-tris缓冲液（pH9.0）封片剂。将印片倒置放在盖玻片上，轻轻按压印片的背面，用吸水纸吸去多余的封片剂。按之前所描述方法在荧光显微镜下观察印片染色结果。结果解释:如果阳性和阴性对照结果无误，那么确证性直接免疫荧光检测结果是有效的。如果两种不同的狂犬病毒特异性诊断试剂和特异性阴性对照试剂的确证性检测结果都是阴性，则狂犬病毒抗原检测结果判定为阴性；再确证性检测中，如果两种不同的狂犬病毒特异性诊断试剂检测仍然存在稀疏的抗原分布并且显示出特异性的染色,而对照试剂没有出现特异性染色时，狂犬病毒抗原检测结果判定为阳性；如果第一种检测试剂结果为阴性，而第二种检测试剂结果为阳性，并且针对于第二种检测试剂的特异性试剂对照也是阴性，则这个样本可判定为可疑阳性，但是这个样本应该被送到参比试验室进行证实；如果第一种检测试剂结果为阴性，而第二种检测试剂显示出非特异性染色,并且针对第二种检测试剂的特异性对照试剂检测时也显示出非特异性染色,这个结果可以判定成阴性；如果特异性对照荧光片染色结果和狂犬病特异性染色结果很难区别,则检测结果不具有诊断性。可能是因为非特异性荧光覆盖住了特异性荧光。在这种情况下，可以选择其它检测方法，如病毒分离、RT-PCR等,还可以咨询参比试验室。暴露患者应该根据当地的流行病学特点以及咬人动物患有狂犬病的疑似程度进行暴露后的免疫接种。新的地理区域或者罕见宿主动物中狂犬病的诊断需要另外一个实验室进行确证性检测。另外,非典型包涵体形态的观察、稀疏的抗原分布、不一致的检测结果或其它预料之外的结果都需要第二个实验室进行确证性检测。抗体滴度测定目的：确定常规检测试剂（抗体）的最适工作稀释度材料：阳性和阴性对照：丙酮固定的脑组织印片检测试剂：FDI，DFAI，DFAII，DFAIII和山羊来源的多克隆抗体操作步骤：通过倍比稀释法（如1:10,1:20,1:40,……）确定检测试剂的工作稀释度，每个稀释度的试剂至少和两个阳性和阴性对照（脑组织印片）反应，反应结果至少由两名技术人员进行判定。当苹果绿荧光为++++，且背景荧光最弱时的稀释度是检测试剂的终点稀释度。在步骤1中的终点稀释度附近，通过有限稀释法确定检测试剂的更精确的工作稀释度，每个稀释度的试剂至少和两个阳性和阴性对照（脑组织印片）反应。例如：如果终点稀释度为1:80时，对检测试剂以1:70、1:80、1:90、1:100和1:120进行再次检验。检验结果至少由两名技术人员进行判定。当苹果绿荧光为++++，并且抗原检出率为100%时的稀释度是试剂的终点稀释度。两步检验后，检测试剂工作稀释度比一步检验后更低。例如，如果在稀释度1:110时观察到的抗原量或者荧光强度减少，那么检测试剂的工作稀释度将可能是1:90。注：因为不同的狂犬病毒样本在抗原递呈、抗体亲和力和亲合力方面是不同的，病毒包涵体在用不同试剂检测时具有明显不同的结果，所以检测结果应该经过验证，检测试剂应该和另一株狂犬病毒变异株的脑组织印片进行反应。虽然单一来源的阳性对照足以用于常规检测，但是准确的试剂评价需要对多个变异株进行观察。为了达到这种目的，用于检测试剂滴度测定的对照材料应该来源于自然感染狂犬病毒变异株的动物，和最常见的地方性变异株相比，这些变异株具有遗传多样性。比如，美国东部的实验室可能会利用检测试剂，通过脑组织印片检测法来确认狂犬病毒感染的浣熊，并通过与阳性的蝙蝠标本比较再次验证检测试剂的工作稀释度。自然感染的动物组织比鼠源的病毒感染组织更适合作为对照材料。如果某个地区没有足够的对照组织，可以从其他地区或者参比实验室获得。对照材料应该分装保存于-40度或者更低，以避免反复冻融导致降解。鼠神经瘤细胞（MNA）培养步骤目的：维持MNA细胞传代，用于狂犬病毒分离或扩增。注：因为鼠神经瘤细胞是活细胞，所以关于细胞培养的所有步骤必须使用无菌技术操作。MNA细胞的操作者必须熟悉细胞的生长方式和形态，能够使用显微镜对单层培养细胞进行观察。MNA细胞是对非实验室适应的狂犬病毒最为敏感的细胞，可以从下面公司购买：DiagnosticHYBRIDS,Athens,OH(Cat#62-T075)。另外一种可供替代的相似的细胞培养系（CCL131）可以从下面公司购买：AmericanTypeCellCollection,Rockville,MD.。MNA细胞在偏酸性培养基中生长旺盛，如Eagle’sMEM培养基：含有2x维生素、2x谷氨酰胺和10%胎牛血清、青霉素(100units/ml)、链霉素(100µg/ml)、两性霉素B(0.25µg/ml)、碳酸氢钠(0.75mg/ml)。培养基的配方可以从GIBCO实验室(InvitrogenCorp,GrandIsland,NY)获得。胎牛血清（FBS）来自Hyclone(Logan,UT)或者AtlasBiologics(FortCollins,CO)。每一批胎牛血清在使用之前都应该对狂犬病毒抑制因子进行检测。MNA细胞培养所使用的物质：Eagle’s10xMEM(11430-022)100x维生素(11120-052)7.5%碳酸氢钠(25080-094)胎牛血清(HycloneSH30070.03,AtlasF-0500A,56°C灭活30分钟)100x抗生素和抗真菌溶液(15240-062)100x谷氨酰胺(25030-081)0.01MPBS（磷酸盐缓冲液）pH7.4(不含Mg和Ca离子)鼠神经瘤细胞75cm2细胞培养瓶25cm2细胞培养瓶10x胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（15400-054用PBS稀释至1x）台盼蓝0.4%(15250-061)15ml尖底离心管血细胞计数器无菌玻璃移液管0.22µm硝酸纤维素或者醋酸纤维素薄膜过滤器无菌移液管(25ml,10ml,5ml)消毒烧杯仪器设备：生物安全柜（层流式）恒温培养箱（37°C、0.5%CO2、加湿）冰箱-20ºC冰箱离心机（具有防止气溶胶扩散的转子）1xMEM的配制（基础培养基）：在1L容器中加入740ml无菌蒸馏水（细胞培养级），100ml含有Earl盐的10xEagleMEM以及20ml100x维生素配制而成将MEM分装成足够小份后放置于4°C保存，供一周之用。1xMEM10的配制（工作培养基）：每周配制100mlMEM10：在86ml基础培养基中加入10ml热失活的胎牛血清、1ml双抗溶液、2ml100x谷氨酰胺和1ml7.5%的碳酸氢钠；使用前，用0.22µm的滤器过滤除菌。这种培养基适用于在旋紧盖的培养瓶中进行细胞培养。注意：在玻片或者培养板上培养MNA细胞时应该在37°C、0.5%CO2和90-94%湿度的环境中培养。冻存细胞的复苏步骤：取一管冻存细胞迅速置于37°C水浴中，直至细胞溶解。迅速将细胞吸出，转移到平衡至37°C的4ml灭活胎牛血清(FBS)中。将上述FBS混悬的细胞转移到含有平衡至37°C的4mlMEM10的15ml尖底离心管中。将细胞悬液转移到25cm2组织培养瓶，并在37°C孵育。24小时后，用MEM10生长培养基替换培养瓶中的培养基，37°C继续孵育2-3天。培养基的更新可以减少细胞冻存液中存在的DMSO。细胞培养过程中非常重要的是更换培养液或者用胰蛋白酶消化后传代，即使细胞并没有完全铺满单层。操作遵守胰蛋白酶消化和传代培养手册。开始传代时，传代比例可以比较低，如1：1或者1：2，几周后可以增加到1：5。MNA细胞的胰酶消化和传代培养方法：用倒置显微镜观察培养瓶中的细胞，培养基的颜色应该是橙色(如果介于鲜红色和紫色之间，说明pH偏碱性，最有可能是因为孵箱中CO2浓度过高或者培养瓶的盖子未盖紧所致，而如果是浅黄色则可能是由于细菌污染所致)。如果培养基的颜色介于橙色和黄色之间，并且超过70%的细胞发生融合，细胞需要进行传代培养。吸出MEM10培养基，并将MEM10培养基和移液管弃置于消毒烧杯中。非常小心的沿着单层细胞对侧面的培养瓶壁加入5mlPBS（pH7.4，不含Mg++和Ca++)。摇动培养瓶使PBS轻轻冲洗单层细胞。移除PBS弃置于消毒烧杯中。以同样的方法再次加入5mlPBS并重复第4步的操作。移除PBS弃置于消毒烧杯中。加入2ml1x胰蛋白酶，完全可以覆盖住单层细胞。2-5分钟后观察单层细胞裂解现象。用手掌拍击培养瓶底，使细胞脱落。加入8mlMEM10，或者每次4ml，分两次加入，并将细胞悬液移到15ml离心管中，用移液管混匀(用下面介绍的细胞计数法确定准确的细胞数量)。使用血细胞计数器进行细胞计数后，使用培养基调整细胞悬液体积，并在25cm2培养瓶中加入总体积为7ml、细胞计数为1.0x106的细胞，或者在75cm2培养瓶中加入总体积为25ml、细胞计数为3.0x106的细胞。注：如果MNA细胞生长良好，可以每3-4天按照1：5的传代比例进行传代培养（通常是周一和周五）。按照这种方法，75cm2培养瓶中经过胰酶消化的细胞在MEM10培养基中悬浮，总体积为10ml。传代时，每一个新的75cm2培养瓶中加入2ml细胞悬液和23mlMEM10培养基。使用血细胞计数器进行细胞计数目的：确定细胞悬液中有活力细胞的准确数量。操作步骤：准备血细胞计数器。依次使用水和酒精清洁血细胞计数器和盖玻片的所有表面，用不含棉绒的纸巾彻底擦干。将盖玻片平放于细胞计数器的中间突出面。在0.5ml台盼蓝染液中加入0.5mlMNA细胞悬液，充分混匀（混合物即为1:2稀释的细胞悬液）。开始计数之前，使台盼蓝-细胞悬液静置至少5分钟，但不要长于15分钟。用毛细吸管或0.5ml注射器吸取混合液注满一侧细胞池，注意不要让液体溢出。在显微镜下用10×物镜对细胞进行计数。在四个1mm3的大方格中（图1中以A至D标记），计数没有染色的细胞数目，因为存活的细胞不会吸收台盼蓝，但死细胞却可以吸收台盼蓝。注意：位于顶端边线和左边边线上的细胞不在计数范围之内，但位于底边边线和右边边线的细胞则应该包含在计数之内。如果存在细胞聚团，每一个单个细胞都应该分别计数。但是，如果聚团较多或者面积很大，那么计数将不可靠。图1.细胞计数器的分格图7.计算细胞数目计算四个大方格内细胞总数。为了得到更准确的结果，要计算两个细胞池（总共八个大方格）中的细胞数目。使用下面的公式计算每毫升细胞悬液中的细胞数目。细胞/ml＝总细胞数×细胞计数器转换系数×稀释系数方格的数目细胞计数器转换系数：SpenserBright-Line,0.1mm深=10,000Fuchs-Rosenthal,0.2mm深=5,000原理：转换系数10,000是基于每一网格的体积得来的。每一个网格的体积是0.1mm3（长宽均为1mm、深0.1mm）。1mm（长）×1mm（宽）×0.1mm（深）＝0.1mm31mm3＝10×0.1mm31cm3＝1000×1mm31cm3约为1ml因此，1ml细胞悬液中所含有的细胞总数是0.1mm3中细胞数目10,000倍。例如：如果细胞总数＝200方格数量＝4细胞计数器深度＝0.1稀释系数＝2那么，200/4×10,000×2＝50×10,000×2＝1,000,000细胞/ml稀释细胞悬液至目标浓度：细胞悬液的稀释公式：CIVI＝CFVFCI＝浓度（初始浓度，细胞/ml）VI＝体积（初始体积）CF＝目标浓度（终浓度）VF＝目标体积（终体积）例1：CI＝2,500,000细胞/mlVI＝初始体积（未知，ml）CF＝150,000细胞/mlVF＝50ml2,500,000×VI＝150,000×50VI＝7,500,000/2,500,000VI＝3ml因此，3ml的初始悬液与47ml的培养基混合，得到50ml浓度为150,000细胞/ml的稀释后细胞悬液。例2：CI＝1,500,000细胞/mlVI＝初始体积（未知，ml）CF＝目标浓度1,500,000/mlVF＝目标体积2ml1,500,000×VI＝1,500,000×2VI＝1,500,000×2/1,500,000VI＝3,000,000/1,500,000VI＝2ml因此，要得到浓度为1,500,000细胞/ml的细胞悬液，需要2ml的初始悬液在鼠神经瘤（MNA）细胞中分离狂犬病毒目的：从未知的脑悬液中分离狂犬病毒，作为DFA检测之外的另一种确证性检测。扩增病毒用于抗原分型和其他分析。狂犬病毒分离所需材料消毒烧杯MEM10培养基（每份样本10ml）0.01MPBS（PH7.4、无Mg++和Ca++）MNA细胞悬液（浓度约4×106细胞/1.6ml）未知的脑组织样本已知的狂犬病毒悬液25cm2组织培养瓶15ml聚丙烯离心管2ml带螺帽带密封圈的聚丙烯离心管培养皿（150mm×20mm）纸巾无菌移液管1ml、5ml、10ml无菌吸管抗狂犬病毒抗体（商业化检测试剂）（需要两种，FDI/DFAII/DFAIII之一和DFAⅠ/多克隆抗体之一）0.01MPBSPH7.520%甘油-Tris封固液丙酮聚丙烯玻片架仪器设备：生物安全柜（二级，层流式）加湿型37℃恒温CO2（0.5%）培养箱离心机（具有防止气溶胶扩散的转子）操作步骤所有操作都必须在生物安全柜（BSC）中完成；将每份未知脑组织样本的脑干和小脑分装，然后在MEM10中匀浆化，制作成20％（质量体积比）的悬液，然后500xG离心10分钟使其澄清；在15ml离心管中加入1.6ml含有4×106MNA细胞的MEM10培养液，然后加入0.4ml的脑组织悬液上清，用无菌移液管混匀细胞悬液，37℃中培养60分钟。期间，将离心管侧放以防止细胞形成沉淀。对未感染细胞（对照）、未知脑组织样本悬液上清加细胞，以及已知狂犬病毒（阳性对照）加细胞重复本操作；每15分钟摇动一次离心管以混匀细胞悬液，增加接种物与细胞的接触；为每一份样本标记一个25cm2组织培养瓶，3个大的培养皿和12个（4孔）聚四氟乙烯树脂覆盖表面的带孔载玻片，标记内容为样本编号、传代次数（p1）、日期和你名字缩写；将载玻片平放于大培养皿内折叠的湿纸巾上；孵育60分钟后，在含有样本和MNA细胞悬液的15ml离心管中加入8mlMEM10；用无菌移液管重悬接种的细胞；在25cm2组织培养瓶中加入6ml细胞悬液；在置于培养皿中的12个（4孔）载玻片上滴加剩余的4ml悬液。烧瓶里和载玻片上的细胞置于0.5%CO2增湿的37℃恒温培养箱中培养。对未感染细胞悬液（对照）、未知脑组织样本悬液上清加细胞，以及已知狂犬病毒（阳性对照）加细胞重复本操作；孵育48小时后，将其中4个印片用PBS冲洗，然后在-20℃丙酮中固定10分钟。通过DFA方法，利用两种狂犬病检测试剂（FDI/DFAⅡ/DFAⅢ之一，以及DFAⅠ或多克隆抗体之一）进行狂犬病毒抗原检测。除了在冲洗细胞培养孔时不要太激烈以外，其他操作按照标准的DFA进行；在印片上盖上盖玻片，在荧光显微镜下仔细观察细胞里存在的狂犬病毒抗原；在MNA细胞培养中产生的狂犬病毒抗原呈现出4+染色强度，大小和形状不一的胞浆内包涵体。如果能观察到狂犬病毒感染的细胞，用单克隆抗体对病毒进行特征性检测；同11步，在接种后的72和96小时将另外4个印片在-20℃丙酮中固定10分钟，然后用DFA检测狂犬病毒感染的细胞；如果细胞培养为阴性或者感染的细胞数量不足以进行抗原分型，培养3-5天后，对MNA细胞进行传代培养。接种的细胞培养物用胰酶消化并传代培养：从MNA细胞培养瓶中用移液管吸取培养基，同移液管一起弃于消毒烧杯中；在MNA细胞培养瓶中小心加入5ml的0.01MPH7.4的PBS（无Mg++和Ca++）。用PBS冲洗单层细胞和培养瓶侧面，用5ml移液管吸取PBS并弃于消毒烧杯中；加5mlPBS，重复步骤2；加2ml的1×胰蛋白酶-EDTA，2-5分钟后检查单层细胞的脱落现象；用手掌用力敲击瓶子的底部使细胞脱落；如前所述，为每一份样本标记1个25cm2组织培养瓶、3个培养皿和12个4孔聚四氟乙烯树脂覆盖表面的带孔载玻片（确保标记新的传代代次数）；将载玻片平放于大培养皿内折叠的湿纸巾上；所有细胞从瓶壁上脱落后，加8mlMEM10，然后将细胞转移到15ml离心管中；用无菌移液管重悬细胞；在标记的25cm2组织培养瓶中加入6ml细胞悬液。在置于培养皿中的12个（4孔）载玻片上滴加剩余的4ml悬液。烧瓶里和载玻片上的细胞置于0.5%CO2增湿的37℃恒温培养箱中培养。对所有细胞，包括未感染细胞（对照）、未知脑组织样本悬液上清加细胞，以及已知狂犬病毒（阳性对照）加细胞进行传代培养；分别培养48、72、96小时后，将其中4个印片用PBS冲洗，然后在-20℃丙酮中固定10分钟。按照标准的DFA操作方法，利用两种狂犬病检测试剂（FDI/DFAⅡ/DFAⅢ之一，以及DFAⅠ或多克隆抗体之一）进行狂犬病毒抗原检测。如果未检测到狂犬病毒抗原，继续对另外3个印片进行检测。如果检测到病毒抗原，利用单克隆抗体进行病毒分型用盖玻片盖上载玻片并用荧光显微镜进行读数。结果解释：•如果分离到狂犬病毒，报告结果为阳性。•如果在MNA细胞中传代2次后分离不到狂犬病毒，报告结果为阴性。注：如果检测到稀疏的病毒抗原或结果可疑，有必要进行第三次细胞传代。狂犬病样本的单克隆抗体分型目的:利用7种狂犬病毒单抗对阳性狂犬病样本进行抗原分型，鉴定病毒变异株；对样本的脑组织印片或感染鼠神经瘤细胞的不同结果进行观察和分析。试剂:鼠源单抗C1,C2,C4,C10,C15,C18,andCR54（Millipore）。为避免混淆，以上单抗以数字顺序标记(C1-1,C2-2,C4-3,C10-4,C15-5,C18-6,CR54-7)；FITC标记羊抗鼠抗体(Millipore，Cat#5008)；PBS,pH7.4-7.6；20%甘油-Tris盐缓冲液,pH9.0。材料:未知样本:2个(2组丙酮固定的4孔脑组织印片)已知样本:8组，每组10株变异株20ul量程移液器或毛细吸管20ul枪头微孔板盖不锈钢托盘洗瓶盖玻片塑料玻片架玻片盒塑料烧杯(1000ml)1:256季铵化合物溶液装有20%封固液的1ml注射器，配有0.45µm滤膜仪器设备:荧光显微镜37°C恒温培养箱-20°C冰箱（存放可燃物）操作步骤:间接免疫荧光抗体试验(IFA)分两步反应,第一步先与一抗（抗狂犬病毒单克隆抗体）结合，第二步与抗鼠免疫荧光抗体反应。第一步反应-与一抗结合将印片平放在不锈钢托盘里的湿纸巾上，在载玻片毛玻璃端标记试验者名字缩写。取每种稀释后的单抗20µl滴加在对应的载玻片小孔中，用枪头轻轻铺平溶液以覆盖组织印记。注意：每孔都更换新枪头，用过的枪头或毛细吸管不能再用于吸取抗体溶液。用微孔板盖覆盖印片，以防抗体溶液干燥，然后37°C孵育30min。孵育后，手持印片在盛有1:256QAC消毒剂的烧杯内浸洗一次，然后用PBS分别轻轻冲洗每个孔，操作应仔细，避免孔间交叉污染。将玻片架上的每一张印片在PBS缓冲液中浸洗两次，每次3-5分钟。将载玻片轻轻翻转放置于纸巾上，以加速干燥。将载玻片平放在不锈钢托盘里的湿纸巾上，进行下一步反应。第二步反应-与二抗结合在印片每孔中滴加1滴羊抗鼠抗体(MilliporeCat#5008)。用微孔板盖覆盖载玻片，以避免抗体溶液干燥。将印片放入湿盒中，37°C恒温孵育30min。从培养箱取出后，用PBS缓慢冲洗印片。印片插入玻片架，用PBS浸洗两次，每次5min。印片正面朝下放置于纸巾上，以除去多余水份(注意不要按压印片来吸干水份)。然后将印片正面向上置于托盘里的纸巾上晾干。配有0.45µm滤膜的1ml注射器内装入20%甘油-Tris封固液，在盖玻片上对应印片小孔的位置滴加一滴封固液。将印片翻转盖在盖玻片上，用纸巾吸取玻片周围多余的封固液。观察分析结果:在荧光显微镜下，使用200或400倍放大倍数观察印片，以期获得狂犬病毒特异性荧光染色。与其他试验参与者共享彼此印片，可以获得更多经验。观察结果分为阳性(+)、阴性(-)、弱阳性(w)或+/-。注意观察每种抗体反应后的荧光强度和病毒颗粒的数量。需要比较同一样本与不同抗体以及同一抗体与不同样本反应的荧光变化情况。注意：并不是所有抗体与不同狂犬病毒变异株的反应结果都相同，也并不是所有抗体与同一样本的反应结果都相同。如果一张印片上有大量病毒颗粒，那么这个样本的所有阳性孔都应该具有可比性。发生下面这种情况的机会是很少的：一个阳性孔中含有大量荧光染色的病毒抗原，而一个弱阳性孔中只含有非常少的荧光染色的病毒抗原。出现弱阳性情况的原因可能是carryover、抗体干燥过度或者非特异性染色，需要认真观察判断。阳性印片中抗原量少的样本需要仔细观察，确保荧光的特异性。弱阳性样本中的阴性孔也需要仔细观察，避免漏检。如果样本因免疫荧光抗体反应十分微弱而无法进行分型，可以先通过小鼠或神经瘤细胞分离病毒，然后再进行抗原分型。也可以利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对弱阳性样本进行基因分型。单克隆抗体反应结果可以反映狂犬病毒在不同储存宿主类型中的变异。注意：每个学员都有机会观察具有代表性的已分型毒株的印片，并对未知样本进行抗原分型。C1C2C4C10C15C18CR541234567中南部臭鼬-1-+++ⅤⅤ中北部臭鼬+++++--德克萨斯州狐狸+++++--德克萨斯州家犬+++++--亚利桑那州狐狸+++-+--北极/新英格兰红狐-1+++---浣熊-++++Ⅴ+无尾蝙蝠++++---红蝙蝠*-1+++---大棕蝙蝠+++----注意：不是所有毒株都可以利用这些单抗分型；确定哪些毒株具有相同的单抗反应类型。V=常规变异1=观察到的变异结果*灰白蝙蝠与红蝙蝠单抗反应类型相似RT-PCR反转录：为每一组样本准备一管RTRX混合液（Boehringer-Manheim改进配方，见下），加入2.0ul(约50units)反转录酶和2.0ul(约80units)RNA酶抑制剂。1.引物稀释：简并引物稀释至10μM（储存浓度为40uM），特异引物稀释至5μM（储存浓度为20μM）。引物：_____________水：___________浓度：__________2.在0.5ml干净PCR管中加入2μl引物（10μM简并引物或5μM特异引物）。3.每个PCR管中加入5μl混旋后的RNA，瞬时离心。4.94°C变性1分钟，冰浴5分钟。5.每管中加入14μlRT反应混和液（由RTRX、反转录酶和RNA酶抑制剂组成），瞬时离心。（RT反应混和液：71.6ulRTRX+2ul反转录酶+2ulRNA酶抑制剂，可供5.4个反应使用）6.将PCR仪预热至42°C，反应混和液在42°C作用90分钟后保存于4°C。（RT反应总体积为20ul）RTRX混合液5.4Reactions=1个反应管20个反应管40个反应管水39.2ul784.0ul1568.0ul5X反转录缓冲液21.6ul432.0ul864.0ul（RocheAppliedScience公司的AMV反转录酶）dNTPs10.8ul216.0ul432.0ul(RocheAppliedScience公司，货号11581295001)(分装成71.6ul/份，保存于500ul离心管中，储存于-20°C)反转录酶和RNA酶抑制剂要在每次反应前加入（在每一份RTRX分装管中分别加入2ul反转录酶和RNA酶抑制剂，供5.4个反应使用）。反转录酶AMV2.0ul（）RNA酶抑制剂2.0ul（RocheAppliedScience03335399001）PCR：1.准备PCR反应混和液（5个反应），简并引物浓度为40uM，特异引物浓度为20uM。PCR反应混和液配方（5.4个反应）：H2O（无RNA酶和DNA酶）372.6ul.1MTrispH8.343.2ulTaq(5u/ul)2.7ul引物15.4ul引物26.75ul2.瞬时离心反转录反应液3.每个反转录反应管中加入80ulPCR反应混和液。PCR仪预热至94°C4.瞬时离心后置于预热至94°C的PCR仪中，进行40个PCR扩增反应（94°C1min，94°C30s，37°C30s，72°C90s，GOTO2REP39，72°C延伸7min）将PCR反应产物暂时储存于4°C，然后进行电泳鉴定（大于400bp的片段使用2%的琼脂糖凝胶电泳，小于400bp的片段使用4%的琼脂糖凝胶电泳），鉴定阳性者进行序列测定后储存于-20°C。.用于反转录和PCR反应的引物：序列(5'–3’)名称ACGCTTAACGAMAAA001ATGTAACACCTCTACAATGGATGTAACACCTCTACAATGGA21gN55F(21glong)GARAGAAGATTCTTCAGRGA1066NFDGGAGAA(A/G)GAACTTCA(A/G)GAITA1087INFDEGTTGTTTA(A/G)AAA(C/T)TCAGC(G/A)AA1312NBDEGTTGACGAAGATCTTGCTCAT304GTCTCTTCAGCCATCTCN8Ba基因组位置以Pasteur株(Genbank#M13215,M21634)为标准；bN=核蛋白编码基因F=正向引物B=反向引物。PCR反应产物纯化用于序列测定：使用WizardPCRPurificationKit（PCR纯化试剂盒）1.标记反应管，加100μlDirectPurificationBuffer2.加入全部的PCR反应液，混匀，瞬时离心3.混匀PurificationResin，并加1ml到每个反应管中4.将3ml注射器的内芯拔出，在注射器桶接上mini-column5.将混合液吸入注射器桶中，插入注射器内芯，将混合液推过mini-column6.先把注射器桶从mini-column拔下，再把注射器内芯拔出，然后再把注射器桶和mini-column接上，加入2ml80%异丙醇。插入注射器内芯，将液体推过mini-column7.将mini-column放入干净的1.5ml离心管中，10000g离心2min8.在colomn的滤膜中央加入50ul水，静置2min，充分溶解DNA9.10000g离心2min，收集滤过液保存于-20°C，弃掉columnRT-PCR用于狂犬病诊断：优良实验室规范（Goodlaboratorypractice，GLP）包括定期对试剂的特异性和灵敏度进行的确证试验以及狂犬病荧光抗体检测步骤。RT-PCR比病毒分离更加敏感，并且PCR结果可以在24小时之内获得，所以RT-PCR在对荧光抗体检测时出现的异常情况可以进行确证。RT-PCR没有被推荐替代狂犬病荧光抗体检测。几乎所有狂犬病诊断样本都来自狂犬病毒感染末期的动物，脑组织中含有高拷贝数的狂犬病毒。使用标准的荧光抗体（FA）检测不缺乏敏感性，而且也没有必要进行更加敏感的诊断操作。另外，RT-PCR与脑组织的荧光抗体染色相比花费相对要高，并且PCR的高度敏感性会使假阳性的概率增加。在进行尸体剖检和RNA提取时应该格外小心，以避免强阳性脑组织样本和阴性样本之间的交叉污染。用于RNA提取的样本应该使用无菌一次性手术刀从未接触过外界环境的脑干或者小脑内部切取。在RNA提取和PCR扩增的所有操作步骤中，都应该以阴性脑组织样本作为样本处理的阴性对照。RNA提取敏感性的阳性对照应该是病毒感染的脑组织稀释于正常脑组织后获得的含有约10个感染单位狂犬病毒的混合组织。为了验证从FA检测阴性或者弱阳性样本中得到的PCR产物的特异性，必须进行杂交试验或者核苷酸序列分析。使用表1中引物的不同组合，我们成功地扩增出并且分析了狂犬病毒RNA的特征，这些样本都是通过直接免疫荧光（DFA）诊断出的阳性脑组织。通过步骤1，通常可以得到长度为1468bp的PCR产物，这种方法的敏感性约为1个感染单位的狂犬病毒（在鼠神经瘤细胞中培养两天后分离鉴定）。每100ulFA检测强阳性的20%的新鲜脑组织悬液通常含有1000到10000个病毒感染单位，并且PCR可以得到一条强阳性条带。如果FA检测属于强阳性，但是PCR反应为阴性或者非常弱，可能是由于序列变异、反转录或PCR引物不识别、样本中酶抑制剂的存在或者在样本分解或溶解过程中病毒RNA降解所致。步骤2使用简并引物对这样的样本进行更短片段RNA的扩增，这种PCR方法比病毒分离鉴定的敏感性增加了100到1000倍。另外，还要为检测样本设立模板对照，如果样本中无法扩增出核糖体RNA、B-actin或者葡萄糖-6-磷酸脱氢酶mRNA，说明样本存在降解现象，从而得到假阴性结果。巢式PCR可以进一步增加反应敏感型（大约比步骤2增加10倍），但是敏感性的增加对于脑组织样本FA检测结果的确证并不是必须的，并且巢式或者半巢式PCR增加了样本之间的交叉污染和假阳性结果。经验证明，引物21g、10g和304是有效的（因为我们不知道狂犬病毒基因组的真实序列，但是这些引物成功的扩增出了狂犬病毒基因组序列）。尽管这些引物是通过狂犬病毒基因组相对保守区域设计的，但是引物和模板的错配情况通过一些成功扩增的样本进行了验证。在有些情况下，我们希望引物和模板的错配可以通过降低退火温度和增加病毒感染脑组织中RNA模板的量来弥补。任何一个PCR阴性而FA阳性结果都应该报告给美国疾病预防控制中心（CDC）狂犬病实验室（404-639-1050）。简并引物通过已知序列进行设计，并且可以特异性的识别美国所有已知的狂犬病毒变异株。PCR阴性结果也要报告给CDC。步骤1：引物21G（或者相似引物10g）用于基因组反转录（直接从自然感染的动物脑组织中提取的RNA）。这些引物对应于核蛋白编码基因3’端起始蛋氨酸密码子附近。引物21g以蛋氨酸密码子ATG作为其3’端，而ATG位于引物10g的-9位。引物21g/10g和304或相似引物1312NBDEG是有效扩增引物。引物304识别磷酸化蛋白起始蛋氨酸密码子附近序列。引物1312NBDEG是根据目前美国国内已知狂犬病毒变异株保守序列设计的扩增引物。步骤2：引物1087NFDEG用于反转录。引物1312NBDEG或304用作反转录引物。引物1087NFDEG和1312NBDEG识别目的片断起始和末端附近序列。PCR产物的长度是133bp或377bp。RT-PCR产物用于分子特征研究：CDC所收集的核苷酸序列信息反映了核蛋白羧基末端320bp序列，并且包括核蛋白和磷酸化蛋白之间的非翻译区。这些核苷酸序列是利用引物304对PCR产物进行直接循环测序得到的（Smithetal.,JID,1992）。狂犬病毒不同变异株的全长的核蛋白编码基因序列可以通过Genbank获得，或者向CDC索取。限制性酶切也可以用于鉴定常见的狂犬病毒变异株。限制性核酸内切酶DdeI和HinfI识别核蛋白基因上多个位点。DRIT（直接快速免疫组化试验）简介：狂犬病病毒能引起包括人在内的所有温血动物的急性脑炎，最后以死亡告终。尽管所有的温血动物都对狂犬病病毒易感，但只有一小部分动物是该病的重要宿主。在美国，狂犬病病毒的一些变异体已经在一些陆栖哺乳动物检测到，这些动物包括浣熊、臭鼬、狐狸和山狗。除了这些陆栖宿主外，一些食虫蝙蝠也是狂犬病的宿主。狂犬病病毒由感染的宿主传给未感染动物。文献已经记载了多种传播途径，其中包括粘膜污染（例如眼，鼻，口），气溶胶传播和角膜移植术感染。狂犬病毒传播最普遍的方式是通过感染性宿主的咬伤进行传播（感染性宿主唾液中含有狂犬病毒）。初次感染后，病毒进入潜伏期，这期间宿主体内不容易检测到该病毒。潜伏期可能会持续几天至几个月。摄取病毒到外周神经这一过程对进行性感染的发生十分重要。狂犬病病毒被摄取到外周神经后，继而被运送到中枢神经系统（CNS）。在最初感染部位病毒通过感觉神经和传感神经完成摄取和运输。潜伏期是指从暴露后到出现临床症状这段时间。潜伏期为几天至几年不等，但典型的潜伏期为1至3个月。病毒在中枢神经系统中的传播速度很快。病毒感染脑组织后将以离心传播方式分布到外周神经。病毒在中枢神经内通过病毒复制和子代病毒在细胞间传播完成感染性扩增。这种离心式传播病毒方式可能导致各种神经支配的组织含有病毒，包括唾液腺。在脑组织感染期间，明显行为变化也会随狂犬病的发展而得以体现。直接免疫荧光抗体实验（dFA）是诊断狂犬病最常用的一种方法。根据国家狂犬病病毒动物诊断执行程序标准规定，DRIT是一种验证dFA方法的标尺。此外，RIT可以用于加强疑似野生动物的野外监测，特别是对国家、地区、洲和地方口服免疫程序的支持作用。RIT不用于公共卫生监测，如果人或兽医暴露或者怀疑暴露，洲立公共卫生机构或其他政府机构会立即组织开展相应的诊断检测。安全性：所有参与狂犬病检测的人员须接受用常规血清学实验和促升免疫法进行的暴露前免疫。未免疫人员不得进入实验室或者狂犬病操作区域。所有的组织必须按照医用废物处理，所有和狂犬病动物或样本处理有关的活动都应按生物安全规则处理，以避免直接接触潜在感染组织或液体。操作患狂犬病动物和狂犬病动物组织的人员存在感染狂犬病的危险，他们可能通过意外注射、被狂犬病毒污染材料感染粘膜或者暴露于狂犬病病毒感染材料的气溶胶中而感染。所有组织和载玻片的处理必须严格遵守以下规定，即处理过程中不能产生雾化液体和空中传播颗粒。从实验动物体安全分离脑组织过程中，隔离防护十分必要。至少，野外尸体解剖过程中的隔离防护应该包括眼睛防护，如防护镜，面罩和外科手术手套。在集中处理动物的场所，个人防护设施应该包括：加厚橡皮手套，实验室长大衣，防水的围裙、长靴、手术口罩，防护袖子和面罩。不需要通风橱和生物安全柜，但他们采取了额外的防护措施避免气味、体外寄生虫和骨片对工作人员的感染。脑干的采集：从上颚骨联合处做一个前侧正中切口一直延伸到喉头，一个距离大约几厘米的切口。分离两侧舌的肌组织连接，去除喉、气管和食管，暴露脊柱腹侧面和相连的肌组织。触摸鉴定寰枕关节并解剖暴露出位于寰枕关节腹侧面的强韧结缔组织。尽管强韧，但是结缔组织很薄并且直接覆在脊索表面。用手术刀片的尖端小心地在结缔组织上穿一小洞，沿着关节的两侧向下滑动，同时屈曲关节以获得较好的通路。最后从暴露的脑干组织中获得最适于狂犬病检测的中枢神经组织样本。样本放在带有螺旋帽的管形瓶中，最好不易碎，也可以放在其它合适容器中。应该充分考虑到样本信息的充足性（如种类，单独识别号码，日期，动物位置等）。如果样本不立即检测必须放在冰箱中保存。样本在检测之前保存和运输都应冷冻。为避免样本的交叉污染，处理每个样本时都须更换一次性手套。在尸体剖检、分离和准备载玻片过程中所用到的仪器都必须有序排列。实验涉及不到的仪器应封闭保存。仅用于处理单独样本的仪器暴露在外。保存试样3个月。典型的阳性样本应做成次级小样做对照。所有的阳性脑样本应送往CDC做流行病学分型，由于其他原因，应同时附带10%鉴定好的阴性样本。样本的腐败和变质是每个样本送达实验室或检测过程条件的质量鉴定。观测结果将记录在RIT结果表中。良好：最佳脑干，新鲜，没有腐败中等：有轻微腐败但可辨认是脑干，可能在周围有少许变色，但在样本中间有稳定组织。较差：实质绿色，变色，液化，腐败或者解剖学形态不可辨认。实质绿色，液化，干燥或者解剖学形态不可辨认，这些表明这是不合格样本。实质组织的缺失在染色、洗涤或染色载玻片上细菌存在度等方面也能表明样本变质。如果在含腐败组织样本中获得阴性结果，那么检测报告中只能表明在这样的样本条件下不能排除样本中含有狂犬病病毒的可能。这样的病料不能判定是阴性结果，不然会被误认为是阴性诊断结果。阳性的诊断结果亦如此。不确定结果的样本和所有的阳性样本都将送到亚特兰大CDC做进一步鉴定和分型。仪器和试剂：仪器和辅助材料：1.带有20x和40x物镜的光学显微镜2.组织-Tek玻片染色试剂盒3.玻片架（要求可同时盛放24个载玻片）4.注射器（管径25mm，滤膜孔径0.45um）5.8mL玻璃瓶6.10cc注射器7.200ultip头和50-200ul移液器8.盖玻片（24x60）9.白色磨砂载玻片10.15mL离心管11.普通枪头(1-200ul)12.吸球13.移液管(1.0ml)14.移液管(5.0ml)15.移液管(10.0ml)16.组织培养板盖试剂:除非特殊说明外，所有的试剂都可以在室温下保存。10%福尔马林缓冲液磷酸盐缓冲液（PBS）3%的过氧化氢一抗：鼠源抗狂犬病毒的生物素标记单克隆抗体（50mL，由CDC提供，可直接用，4℃链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶（可直接用，4℃显色底物：AEC（3-氨基-9-乙基咔唑）二甲基甲酰胺醋酸盐缓冲液(0.1M,pH5.2)苏木精染料（蒸馏水按1：2比例稀释）封固液20ml吐温80，聚乙二醇去离子水染色碟的准备：IIIIIIIVVVIVIIVIIIIXX福尔马林TPBS3%H2O2TPBSTPBSdH2O苏木精dH2OdH2OdH2O试剂更换：I.福尔马林–用两次以后换掉或一周换一次。II.TPBS–每次实验更换一次。III.3%过氧化氢–每次实验更换一次。IV.TPBS–每次实验更换一次。V.TPBS–每次实验更换一次。VI.去离子水/蒸馏水(dH2O)–每次实验更换一次。VII.苏木精–一周更换一次VIII.dH2O–每次实验更换一次。IX.dH2O–每次实验更换一次。X.dH2O–每次实验更换一次。染色试剂的准备：1.10%福尔马林缓冲液；备用2.含有1%吐温80的磷酸盐缓冲液(TPBS)3.TPBS(含有1%吐温80的PBS溶液)=990mlPBS溶液+10ml吐温80。晃动溶液直至吐温80完全溶解。4.3%过氧化氢；备用5.TPBS6.TPBS7.去离子水/蒸馏水(dH2O)；备用8.苏木精：用去离子水1:2稀释（250ml溶液=125ml苏木精+125ml去离子水)9.去离子水/蒸馏水(dH2O)10.去离子水/蒸馏水(dH2O)11.去离子水/蒸馏水(dH2O)DRIT实验方法：狂犬病诊断的抗生物素蛋白链菌素-生物素过氧化酶染色技术对可疑中枢神经组织制作常规印片于标记的载玻片上，包括标准阳性对照和阴性对照。在室温下将载玻片风干5分钟。在室温下将载玻片浸润到10%福尔马林溶液（DishI）中，作用10分钟。将载玻片取出，放在TPBS溶液（DishII）中浸润清洗几次，以除去多余的固定剂。(TPBS：含吐温80为1%的PBS溶液)。在3%过氧化氢溶液（DishIII）中浸润载玻片10分钟。在TPBS溶液（DishIV）中浸润清洗载玻片，以除去多余的过氧化氢。将载玻片移入下一个冲洗槽（DishV）中（浸润之后，甩去多余的缓冲液，并用滤纸从载玻片的一侧将其表面吸干）。一次只操作一张载玻片，而保持其他的载玻片浸润在TPBS溶液中。在湿盒内孵育载玻片（例如：将载玻片置于湿纸巾上，其上覆盖96孔板的盖子或其他简单的盖子），在室温下将其与生物素标记的抗狂犬病单克隆抗体反应十分钟（滴加足够的抗体使其完全覆盖印片）。孵育之后甩掉多余的结合物，用TPBS（DishV）浸润冲洗载玻片（甩掉多余的TPBS并从载玻片的边缘将其表面吸干）。这一清洗缓冲液可用于step10。在湿盒内将载玻片与链霉菌抗生物素蛋白—过氧化酶复合物于室温共同孵育10分钟（滴加足够的复合物使其完全覆盖印片）。孵育之后甩掉多余的液体。用TPBS（DishV）浸润冲洗载玻片（甩掉多余的TPBS并从载玻片边缘将表面吸干）。在湿盒内将载玻片与过氧化酶底物（AEC）于室温下共同孵育10分钟（滴加足够的底物使其完全覆盖印片），AEC于使用前稀释到工作浓度，孵育之后甩掉多余的底物。用去离子水或蒸馏水（DishVI）浸润冲洗载玻片。用Gills苏木精（用去离子水稀释为1：2）（DishVII）复染2分钟。立即用去离子水或蒸馏水（DishVIII）浸润冲洗载玻片以去除上面的染色剂.再次用干净的去离子水(DishIX)浸润冲洗以确保除去多余的染色剂。将载玻片转移到干净的蒸馏水中（DishX），用水溶性的封固剂封闭载玻片和盖玻片（一次只操作一张载玻片，甩掉多余的去离子水或蒸馏水并从载玻片的边缘将其表面吸干）。在封固之前不要让载玻片在空气中风干。如果有多个载玻片染色，可以在封固之前置于去离子水或蒸馏水之中。用光学显微镜观察载玻片，用20倍的物镜扫描视野。然后用40倍高倍镜观察（在蓝色的二乙基溴乙酰胺背景下，狂犬病毒抗体表现为红色的包涵体状）。记录结果。显色底物的准备：A.制备储存液：试剂：1.氨基乙基咔唑（AEC）底物2.N，N，二甲基甲酰胺器皿：1.5ml玻璃吸管2.8ml广口瓶方法：将一颗20mg的3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）片剂放入盛有5毫升二甲基甲酰胺的玻璃广口瓶内（标示AEC储存液和日期）。AEC储存液在4oC冰箱中可放置1至2个月。B.稀释储存液至工作浓度（每次实验前新鲜配置）试剂：1.醋酸盐缓冲液，0.1M,pH5.22.AEC储存液3.3%双氧水器皿:1ml耐热玻璃移液管10ml塑料移液管移液器(200ul)移液器枪头(200ul)0.45um滤过注射器10cc注射器15ml离心管(2个)稀释方法：a.用10ml塑料移液管加7ml醋酸盐缓冲液于15ml离心管中。b.用1ml耐热玻璃移液管加入0.5ml上述AEC储存液。c.加0.075ml(75ul)3%双氧水。用10ml滤过注射器(0.45um)过滤混合物于单独的15ml离心管。这种混合物不稳定，一旦配制只能稳定保存2-3小时。结果的观察和记录：在200X或>200X的放大倍数下，如果观察40个视野没有发现包涵体，该脑组织样本即可被认定为阴性。检测结果：染色强度/抗原分布:狂犬病毒在被感染动物的脑组织细胞浆中会产生不同形状的包涵体（见图A、B、C，13页）。在单个显微镜视野下可以看到许多数目不等的圆形或椭圆形、成群或连成串状的包涵体。当用生物抗体特殊染色后，底物（3-氨基-9-乙基咔唑）被氧化成玫瑰红色的终产物。苏木精复染可使组织和胞核产生蓝色的背景。3-氨基-9-乙基咔唑对光敏感，会慢慢退色，因此建议保存在阴暗处。用于检测载玻片染色强度或抗原分布的观测结果记录在RIT结果表中。（见14页）染色强度分为++++、+++、++、+四个等级。在所有检测实验中，阳性对照最理想的染色强度是++++级。如果样品处理不理想，狂犬病阳性样本也会出现+++级染色强度。值得注意的是，++和+级这两个比较弱的染色强度，如果在没有明确的证据下是不能作为狂犬病毒诊断依据的。染色强度的减弱可能是由于病毒抗原的变异，或者由于抗体和炎症组织、人工分解组织的非特异性结合造成。抗原的分布：对于每一个脑组织样本的检测，染色强度级别取决于抗原量：++++，在印片的每一个区域里都可以观察到大量的不同大小和形状的包涵体。+++,几乎在每一个显微镜视野里都可以观察到不同大小和形状的包涵体，虽然每个视野中的数目各不相同，但是大多数视野中都含有数目众多的包涵体。++，在10%到50%的视野中可以观察到不同大小和形状的包涵体，而且每个视野中的数目并不多。+，在不到10%的视野中观察到不同大小和形状的包涵体，而且每个视野中的数目很少（通常每个视野只有一个或者两个包涵体）。检测结果的解释：如果有足够的适用于狂犬病诊断的组织样本，那么根据检测组和对照组染色的观察方式不同，动物的检测结果可以报告为狂犬病阳性或者阴性（完全检测）或者无法诊断（不确定检测）。完全检测/结果报告：检测结果的报告建立在下面的实验观察结果之上。对照实验：阳性对照载玻片上的抗原显色强度为++++，抗原分布为+++到++++。阴性对照载玻片上不显色。检测对象：在制作荧光片时，应保证组织标本的质量。标本必须是完全阴性（荧光片上没有特异性染色）或者完全阳性（用脑干和脊髓标本制作的荧光片，其显色强度至少是+++到++++，抗原分布为++到++++）。参考图片：BA BAA.阴性脑组织印片B.阳性反应（检测狂犬病毒核蛋白）C.狂犬病毒感染后典型的细胞相关胞浆内包涵体特点D.阳性反应：总放大倍数400XRabiesLabManualREPARATIONOFDFASLIDESFROMBRAINMATERIALPURPOSE:Tocorrectlyidentifythepartsofthebrainrequiredfortestingbythestandardprotocol.Todissectandmakebrainimpressions.Sampling:Adiagnostictestforrabiesrequirestheexaminationofacompletecross-sectionofthebrainstemandthecerebellum(includingvermis,rightandleftlobes).Ifthecerebellumisnotavailable,adiagnosiscanbemadebyexaminationofthebrainstemandthehippocampi(rightandleft).MATERIALS:ContainerswithbrainsDogorRaccoonMouse(sameprocedurewouldbeusedforbatbrains)SkunkorMongooseScalpels(Disposable)Forceps(Disposable)StoragetinsforbrainsPapertowelsSlides,Tefloncoated3wellor2wellSlideholders,polypropylenePlasticbackedbenchpadsPlasticbeakerofdisinfectantAcetoneMarkerPencil(towriteonfrostedendofslide)PetridishesSharpscontainerfordiscardingdisposablescalpelsEQUIPMENT:Biologicalsafetycabinet(ClassII)-20ºC,Freezer(flammablestorage)PROCEDURE:Labeltheslideswiththeanimalidentification(inthiscase,abbreviationforspecies),partofthebrain(i.e.brainstemandcerebellum),andyourinitialsusingapencil.Ifthebrainsizeislarge,itmaybenecessarytomakemorethanoneslideperareaofthebrain.Workwithonespecimenatatime.PlacethebraininaPetridishforeasyaccess.A.Locateandidentifythepartsofthebrain.Locatethebrainstem.Ifnecessary,youmayhavetoinvertthebrain.Locatethecerebellum.Theexteriorhasatightlyconvolutedsurfaceofthreelobedareas.Locatethe(rightandleft)hippocampi.Dissectionisrequiredtolocatethesetissuesfromintactbrains.Makemidlinecutsdowneachofthecerebralhemispheres.Thehippocampiarethewhite,glisteningcylindricaltissueswhichprotrudeoutofeachventricleofthecerebrum.B.Obtaintissuesectionsfortouchimpressions.Cutacross-sectionofthebrainstemandplaceitonapapertowel.Cutacross-sectionofthecerebellumandplaceitonapapertowel.Cutacross-sectionofthe(rightandleft)hippocampiandplacethemonapapertowel.Ifnecessarydividethetissuesectionsintomultiplepieces,sothatthetissueimpressionswillfitintotheslidewells.4.Makebrainimpressionsbygentlytouchingtheslideagainstthecutsurfaceofthetissue.Makeduplicateimpressionsofeachofthetissuesonthelabeledslide(minimally1-brainstemand1-cerebellum).Slidesareavailabletopracticemakingimpressionsfromthehippocampi,butthesewillnotbetested.Removeanyexcessbraintissuefromtheslidesbyblottingseveraltimesonapa