第十八章基因诊断与基因治疗课件

第十八章

基因诊断与基因治疗

(genediagnosisandtherapy)

11本章主要内容

基因诊断基因治疗2本章主要内容基因诊断2

一.基因诊断概念

利用分子生物学方法，直接检测基因结构及其表达水平是否异常，从而对疾病作出诊断,为治疗提供依据。第一节基因诊断3第一节二.基因诊断特点：

针对性强，特异性高检测灵敏度和精确性高实用性强，诊断范围广

4二.基因诊断特点：4三.基因诊断常用技术方法

核酸分子杂交技术聚合酶链反应（PCR）技术生物芯片基因测序5三.基因诊断常用技术方法（一）核酸分子杂交技术

核酸分子杂交

是指一条单链核酸分子（DNA或RNA）通过碱基互补与另一条单链核酸分子形成稳定双链的过程。

基本原理：

碱基互补、变性和复性

DNA与DNA杂交：

A=T、G≡C;

DNA与RNA杂交:

A=U、G≡C;

变性：

升高温度至94℃左右，使核酸双链解开为两条单链；

复性：

缓慢降低温度（52℃左右），变性的两条单链重新形成互补双链。

碱基互补6（一）核酸分子杂交技术碱基互补6hybridizationDNA:DNA5’ATGCCGAT3’TACGGCDNA:RNA5’ATGCGTA3’UACGCAURNA:RNA5’AUGCUACG3’UACGAUGC7hybridization

利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理，可以用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针，与待测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同源核酸序列的存在。

核酸探针

是指带有标记的、并已知碱基序列的DNA或RNA片段，能与待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同源序列。

探针标记物

有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、荧光素等）两大类。8利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理，可

1.核酸分子杂交的分类液相杂交

待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中进行杂交反应；固相杂交

待测核酸样本先结合到固相支持物上，再与溶液中的特异性探针进行杂交反应。

常用固相杂交支持物：

硝酸纤维素膜、尼龙膜等－－－91.核酸分子杂交的分类92.核酸分子杂交（固相杂交）操作程序制备待测核酸样品分离、变性、转移、固化DNA片段杂交加入标记核酸探针检测杂交信号标记核酸探针预杂交制备核酸探针漂洗去除未参与杂交的标记探针102.核酸分子杂交（固相杂交）操作程序制备待测核酸样品分离、变

3.常用固相核酸杂交方法

Southern印迹杂交法（Southernblotting）Northern印迹杂交法（Northernblotting）斑点杂交或狭缝杂交法（Spot/Slotblothybridization）菌落杂交（colonyhybridization）夹心杂交法（sandwichhybridization）原位杂交（hybridizationinsitu）113.常用固相核酸杂交方法11

(1)Southern印迹杂交法限制性内切酶酶切

检测杂交信号

提取DNA

Southern法可用于检测特异的DNA序列片段,进行基因定位、分子量测定等。12(1)Southern印迹杂交法（2）Northern印迹杂交法

（其基本过程类似于上述Southern法）

提取RNA样本→RNA变性→琼脂糖凝胶电泳分离→转移至膜→探针（标记DNA或RNA）与之杂交→显影或显色→检测信号。

Northern法可用于检测组织细胞中总RNA或mRNA

13（2）Northern印迹杂交法13（3）斑点杂交或狭缝杂交法

基本过程：

将变性的DNA或RNA直接点到固相支持滤膜上→用标记探针与之杂交→自显影或显色反应→检测杂交信号→分析结果。

优点：简便、快速、灵敏、样本用量少；

缺点：特异性不高，有一定比例的假阳性。

用途：检测样本中存在的微量DNA或RNA1414（4）菌落杂交

该法可从大量细菌中筛选含特异的DNA序列及基因工程重组体。15（4）菌落杂交15（5）夹心杂交法

ABREREABAB固相支持物片段B捕捉探针

片断A检测探针

本法优点：

特异性强，对样本纯度要求不高，定量较准确。16（5）夹心杂交法ABREREABAB固相支持物片段B捕捉探（6）原位杂交

将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而检测特异的DNA或RNA序列。

细胞原位杂交

组织切片原位杂交

DNA-DNARNA-DNA

三类杂交

RNA-RNA

该法优点：

不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态。有17（6）原位杂交有17（二）聚合酶链反应（PCR）技术

PCR是利用体内DNA复制的原理和DNA变性与复性的性质，在体外对目的基因DNA进行大量扩增的技术。

1.

PCR基本原理：

PCR技术在模板DNA、dNTP、Mg2+、合适Buf.等条件下，用耐热的Taq聚合酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引物，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸3个步骤的反复循环（2530次）过程，使目的DNA呈指数扩增。18（二）聚合酶链反应（PCR）技术PCR是利用体

PCR技术原理示意图（94℃左右）（52℃左右）（72℃左右）19PCR技术原理示意图（94℃左右（1）DNA模板的热变性

将待扩增DNA加热到940C左右，使双链DNA解开成为单链，并游离于反应体系中作为模板。（2）模板与引物的结合（退火或复性）

将体系温度降至合适温度（520C左右），使加入的引物与模板DNA两端（3ˊ端）碱基序列互补结合。20（1）DNA模板的热变性20（3）引物延伸

将体系温度升到720C左右，Taq聚合酶催化dNTP按碱基互补原则连接在DNA引物3ˊ端，使链延伸，形成两条与模板互补的新链。

以上为1次PCR循环（变性、复性和延伸）

（新合成的链可作为下一轮循环的模板）

按照上述（变性、复性和延伸）3个步骤反复循环，PCR产物呈指数扩增。

模板DNA扩增倍数T=2n

(n:循环次数)。21（3）引物延伸212.PCR各要素及其作用（1）模板PCR模板可以是DNA或RNA。以线性DNA模板为佳，量适中，一般为102105个拷贝；

RNA作为模板时，需要：RNAcDNAPCR,称此为RT-PCR.

（2）耐热DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)

是从耐热细菌体内提取的一种DNA聚合酶，可在95℃稳定30分钟。从而保证PCR在[94℃变性→52℃退火→72℃延伸]循环30次过程中不变性失活。逆转录222.PCR各要素及其作用逆转录22（3）引物

引物是根据已知序列的模板DNA待扩增区两端而设计的一对寡核苷酸小片断，长度一般为1530个碱基。引物是保证PCR扩增产物的大小和特异性的关键因素，其设计与合成对PCR的成功至关重要。引物设计原则如下：23（3）引物23

引物设计应符合以下基本原则：

①长度适宜，一般为1530个碱基；②G+C含量，一般为40％60％；③4种碱基应随机性分布；④引物自身不应存在互补序列；⑤两个引物之间不应有多于4个碱基的互补；⑥引物3ˊ端不应有任何修饰；⑦引物5ˊ可以修饰。24引物设计应符合以下基本原则：24（4）缓冲溶液与Mg2+

PCR技术常用1050mmol/LTris-HCl、Ph8.38.88、偏碱缓冲液；并含有一定量的Mg2+浓度；（5）dNTP浓度

PCR一般用50200μmol/L的dNTP；并且4种dNTP浓度应相等；25（4）缓冲溶液与Mg2+25（6）参数

变性温度与时间

一般选择：940C，30秒退火温度与时间

取决于引物长度、浓度和G+C含量，一般选择：Tm-5℃延伸温度与时间

一般选择：70℃75℃循环次数

取决于模板浓度，一般循环：30次26（6）参数26

PCR操作

各种PCR反应的操作基本相同，只是根据引物与靶序列不同，选择不同的反应体系和循环参数。将PCR反应管置于DNA自动化热循环仪上，输入各种循环参数，使DNA扩增在热循环仪上很方便地完成。

PCR技术优点

特异性强、灵敏度高、操作简便、省时，对样本质量要求不高，能快速、特异地扩增任何DNA片断。

PCR缺点

由于高灵敏度，使易出现假阴性或假阳性结果。

27

3.PCR产物分析（1）凝胶电泳分析法

可用琼脂糖（Agrose）或聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳检测PCR扩增产物的大小。同时应以标准DNA分子量作平行对照，凝胶中加入溴化乙锭，电泳后，紫外检测仪下观察结果并拍照。

（在待检靶序列拷贝数多、且仅扩增出一条带时，用此法即可满足检测要求。）283.PCR产物分析28（2）点杂交分析法

该法有2种：①将扩增产物直接固定在膜上，每一个探针制备一张膜，然后用不同的特异探针进行杂交；②将不同的探针固定在膜上，再用有标记的PCR产物与之杂交。

本法有助于检测突变DNA类型，用于人类遗传病诊断和某些基因的分析。

(当扩增产物时多条带时，用此法更合适。)29（2）点杂交分析法29

(三)基因芯片

将大量序列已知的基因片段以微阵列方式固定在一芯片上做成高密度的点阵排列，与标记样品进行杂交，然后用计算机分析杂交信号。30(三)基因芯片30

(四)基因测序即，DNA碱基序列分析，这是最确切、最直接的基因诊断方法。目前常用的方法为Maxam-Gilbert建立的化学裂解法和Sanger建立的双脱氧末端终止法。

31

四.基因诊断的临床应用(一)遗传病的基因诊断(二)肿瘤的基因诊断(三)感染性疾病的基因诊断32四.基因诊断的临床应用(一)遗传病的基因

举例：

——镰刀状红细胞贫血

β－珠蛋白基因的第六个密码子A→T↓

表达产物：谷氨酸→缬氨酸

一个碱基突变→缺失1个MstⅡ内切酶位点

正常人：1.1kb患者：1.3kb33举例：33

5’3’

5’3’

1.1kb

1.3kb

MstII酶切位点（CCTNATG）正常基因突变基因1.3kb1.1kb0.2kb123

1、正常人2、突变携带者3、患者34

第二节基因治疗

基因治疗的概念基因治疗的总体策略基因治疗的基本程序基因治疗的现状与展望35第二节基因治疗35一、基因治疗概念

狭义概念

用具有正常功能的基因去置换或增补患者体内有缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的。

广义概念

将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。

36一、基因治疗概念36二、基因治疗的总体策略

基因矫正

基因置换

基因增补

基因失活

“自杀基因”的应用免疫基因治疗耐药基因治疗

37二、基因治疗的总体策略37（一）基因矫正（genecorrection）

对于致病基因中的异常碱基进行精确修复，使其恢复正常功能。

（二）基因置换(genereplacement)

用正常基因在原位替换致病基因，使细胞DNA完全恢复正常状态。

38（一）基因矫正（genecorrection）38（三）基因增补*(geneaugmentation)

将正常基因导入患者体细胞内，使其整合到染色体中一起表达，以补偿缺陷基因的功能（但致病基因未去除）。（四）基因失活(geneinactivation)

指将特定的反义核酸导入细胞，通过碱基互补作用与mRNA结合，阻断肿瘤细胞中基因的异常表达，以抗肿瘤、抗病毒。

反义RNA:

干扰mRNA的互补RNA;

反义DNA:

干扰DNA的互补DNA.39（三）基因增补*(geneaugmentation)39（五）“自杀基因”的应用自杀基因(suicidegene)

这种基因导入受体细胞后可产生一种酶，它可将原无细胞毒性或低毒药物前体转化为细胞毒物质，将细胞自身杀死，这种基因被称为“自杀基因”。如果将自杀基因导入肿瘤细胞，则可将肿瘤细胞杀死。但对正常细胞则无伤害作用。

40（五）“自杀基因”的应用40（六）免疫基因治疗将某些细胞因子（IL-2、GM-CSF等）基因导入肿瘤患者体内，以增强患者的抵抗力。（七）耐药基因治疗在肿瘤化疗过程中，把产生抗药物毒性的基因导入患者体内，从而使患者能耐受更大剂量的化疗。41（六）免疫基因治疗41

三、基因治疗的基本程序（一）治疗性基因的获得

在了解疾病发生的分子机制基础上，选择对疾病有治疗作用的特定基因。

如，对单基因缺陷遗传病，可用野生型（非突变）基因即可用于治疗；对于肿瘤，最好选择某些与该类肿瘤密切相关的癌基因或抑癌基因用于基因治疗。

治疗性基因获得的方法很多：

用酶切或探针杂交法从基因组DNA文库获得，从cDNA文库获取，PCR扩增，人工合成等。42三、基因治疗的基本程序42（二）基因载体的选择

基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移入患者体内、并能调控其适度表达。

常用的载体有两类：病毒载体和非病毒载体。

病毒载体：逆转录病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体等；

非病毒载体：

与病毒载体的主要区别在于：采用理化方法将治疗基因转移入患者体内。43（二）基因载体的选择43（三）靶细胞的选择

基因治疗的受体细胞有生殖细胞和体细胞两大类。

对生殖细胞进行基因治疗，可使该生殖细胞分化发育成长的个体及其后代均具有正常基因，理论上讲是根治遗传病的理想方法。但由于涉及安全性和伦理学问题，目前基因治疗中禁止使用生殖细胞作为靶细胞，只限于使用体细胞。

44（三）靶细胞的选择44

人类基因治疗中，将治疗基因导入靶细胞有两种途径。

一种为直接体内疗法（invivo）：即，将治疗基因直接导入体内有关组织细胞；

另一种为间接体内疗法（exvivo）：即，在体外先将治疗基因导入培养的靶细胞内，再将已获得表达外源基因的遗传修饰细胞回输入病人体内，达到治疗目的。45人类基因治疗中，将治疗基因导入靶细胞有两种45

治疗基因导入受体细胞的方法

化学方法物理方法膜融合法病毒载体法质粒DNA直接转移法（四）基因转移方法

磷酸钙法DEAE－葡聚糖法

电穿孔法粒子轰击法（基因枪法）46

(五)转导细胞的选择鉴定标记基因技术基因缺陷型受体细胞技术基因共转染技术分子杂交技术外源基因表达鉴定(六)回输体内将治疗性基因修饰的细胞以不同方式回输体内。47(五)转导细

四、基因治疗的应用与展望

(一)基因治疗应满足的条件：1、单基因缺陷疾病2、仅限体细胞的基因治疗3、靶细胞易获取、培养、及回输体内。4、治疗效果应胜过对病人的危害。5、表达水平无需调控且无副作用。6、需经动物实验验证安全可行。48四、基因治疗的应用与展望48

（二）基因治疗有待解决的问题1、难以获得真正有治疗作用的基因。2、外源基因的表达难以在体内精确调控。3、体细胞经体外培养后，其生物学特性会有改变。4、过多的外源蛋白对机体带来可能的影响。5、随机整合潜在的威胁。

49（二）基因治疗有待解决的问题49

基因诊断与基因治疗（课堂练习）1.核酸分子杂交主要内容有制备核酸样本B.制备与标记特异探针C.核酸样本的分离、变性、转移和固定预杂交、杂交和漂洗E.检测杂交信号下列是常用核酸杂交方法的用途，错误的是Southern印迹杂交法可用于检测特异RNA序列片断Southern印迹杂交法可用于检测特异DNA序列片断Northern印迹杂交法可用于检测DNA或RNANorthern印迹杂交法可用于检测RNA原位杂交法可用于检测组织细胞中的DNA或RNA50基因诊断与基因治疗（课堂练习）503.以下是关于PCR技术的叙述，错误是PCR技术进行体外DNA扩增，其过程不同于体内DNA复制过程需要目的DNA两条链为模板需Taq酶代替DNA聚合酶需RNA引物代替DNA引物PCR经过DNA变性、复性和延伸3个步骤的反复循环基因诊断常用技术有核酸分子杂交B.聚合酶链反应基因芯片D.基因测序E.以上都可以513.以下是关于PCR技术的叙述，错误是51

52

Eggsarecoaxedtomatureinaculturedish.Eachhasaremnanteggcellcalledthepolarbodyandcumuluscellsfromtheovaryclingingtoit.53EggsarecoaxedtomatureinaWhileaneggisheldstillwithapipette,aneedleisusedtodrillthroughthezonapellucida,removingaplug.54WhileaneggisheldstillAfterejectingthezonaplug,theneedleisinsertedbackintheeggthroughtheholetowithdrawanddiscardthepolarbodyandtheegg'sgeneticmaterial.55AfterejectingthezonaplugAcumuluscellfromanothereggistakenupintotheneedle.Cellscalledfibroblasts(ortheirnuclei)canalsobeusedinthisstep.56AcumuluscellfromanotherThecumuluscellisinjecteddeepintotheeggthathasbeenstrippedofitsgeneticmaterial.57ThecumuluscellisinjectedTheinjectedeggisexposedtoamixtureofchemicalsandgrowthfactorsdesignedtoactivateittodivide.58TheinjectedeggisexposedAfterroughly24hours,theactivatedeggbeginsdividing.

Thecellscontaingeneticmaterialonlyfromtheinjectedcumuluscell.59Afterroughly24hours,theBythefourthorfifthday,ahollowballofroughly100cellshasformed.Itholdsaclumpofcellscalledtheinnercellmassthatcontainsstemcells.

60Bythefourthorfifthday,Theblastocystisbrokenopen,andtheinnercellmassisgrowninaculturedishtoyieldstemcells.61TheblastocystisbrokenopeThestemcells,inturn,canbecoaxedtogrowintoavarietyofcellsthatmightonedaybeinjectedintopatients.--

62Thestemcells,inturn,can

第十八章

基因诊断与基因治疗

(genediagnosisandtherapy)

631本章主要内容

基因诊断基因治疗64本章主要内容基因诊断2

一.基因诊断概念

利用分子生物学方法，直接检测基因结构及其表达水平是否异常，从而对疾病作出诊断,为治疗提供依据。第一节基因诊断65第一节二.基因诊断特点：

针对性强，特异性高检测灵敏度和精确性高实用性强，诊断范围广

66二.基因诊断特点：4三.基因诊断常用技术方法

核酸分子杂交技术聚合酶链反应（PCR）技术生物芯片基因测序67三.基因诊断常用技术方法（一）核酸分子杂交技术

核酸分子杂交

是指一条单链核酸分子（DNA或RNA）通过碱基互补与另一条单链核酸分子形成稳定双链的过程。

基本原理：

碱基互补、变性和复性

DNA与DNA杂交：

A=T、G≡C;

DNA与RNA杂交:

A=U、G≡C;

变性：

升高温度至94℃左右，使核酸双链解开为两条单链；

复性：

缓慢降低温度（52℃左右），变性的两条单链重新形成互补双链。

碱基互补68（一）核酸分子杂交技术碱基互补6hybridizationDNA:DNA5’ATGCCGAT3’TACGGCDNA:RNA5’ATGCGTA3’UACGCAURNA:RNA5’AUGCUACG3’UACGAUGC69hybridization

利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理，可以用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针，与待测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同源核酸序列的存在。

核酸探针

是指带有标记的、并已知碱基序列的DNA或RNA片段，能与待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同源序列。

探针标记物

有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、荧光素等）两大类。70利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理，可

1.核酸分子杂交的分类液相杂交

待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中进行杂交反应；固相杂交

待测核酸样本先结合到固相支持物上，再与溶液中的特异性探针进行杂交反应。

常用固相杂交支持物：

硝酸纤维素膜、尼龙膜等－－－711.核酸分子杂交的分类92.核酸分子杂交（固相杂交）操作程序制备待测核酸样品分离、变性、转移、固化DNA片段杂交加入标记核酸探针检测杂交信号标记核酸探针预杂交制备核酸探针漂洗去除未参与杂交的标记探针722.核酸分子杂交（固相杂交）操作程序制备待测核酸样品分离、变

3.常用固相核酸杂交方法

Southern印迹杂交法（Southernblotting）Northern印迹杂交法（Northernblotting）斑点杂交或狭缝杂交法（Spot/Slotblothybridization）菌落杂交（colonyhybridization）夹心杂交法（sandwichhybridization）原位杂交（hybridizationinsitu）733.常用固相核酸杂交方法11

(1)Southern印迹杂交法限制性内切酶酶切

检测杂交信号

提取DNA

Southern法可用于检测特异的DNA序列片段,进行基因定位、分子量测定等。74(1)Southern印迹杂交法（2）Northern印迹杂交法

（其基本过程类似于上述Southern法）

提取RNA样本→RNA变性→琼脂糖凝胶电泳分离→转移至膜→探针（标记DNA或RNA）与之杂交→显影或显色→检测信号。

Northern法可用于检测组织细胞中总RNA或mRNA

75（2）Northern印迹杂交法13（3）斑点杂交或狭缝杂交法

基本过程：

将变性的DNA或RNA直接点到固相支持滤膜上→用标记探针与之杂交→自显影或显色反应→检测杂交信号→分析结果。

优点：简便、快速、灵敏、样本用量少；

缺点：特异性不高，有一定比例的假阳性。

用途：检测样本中存在的微量DNA或RNA7614（4）菌落杂交

该法可从大量细菌中筛选含特异的DNA序列及基因工程重组体。77（4）菌落杂交15（5）夹心杂交法

ABREREABAB固相支持物片段B捕捉探针

片断A检测探针

本法优点：

特异性强，对样本纯度要求不高，定量较准确。78（5）夹心杂交法ABREREABAB固相支持物片段B捕捉探（6）原位杂交

将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而检测特异的DNA或RNA序列。

细胞原位杂交

组织切片原位杂交

DNA-DNARNA-DNA

三类杂交

RNA-RNA

该法优点：

不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态。有79（6）原位杂交有17（二）聚合酶链反应（PCR）技术

PCR是利用体内DNA复制的原理和DNA变性与复性的性质，在体外对目的基因DNA进行大量扩增的技术。

1.

PCR基本原理：

PCR技术在模板DNA、dNTP、Mg2+、合适Buf.等条件下，用耐热的Taq聚合酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引物，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸3个步骤的反复循环（2530次）过程，使目的DNA呈指数扩增。80（二）聚合酶链反应（PCR）技术PCR是利用体

PCR技术原理示意图（94℃左右）（52℃左右）（72℃左右）81PCR技术原理示意图（94℃左右（1）DNA模板的热变性

将待扩增DNA加热到940C左右，使双链DNA解开成为单链，并游离于反应体系中作为模板。（2）模板与引物的结合（退火或复性）

将体系温度降至合适温度（520C左右），使加入的引物与模板DNA两端（3ˊ端）碱基序列互补结合。82（1）DNA模板的热变性20（3）引物延伸

将体系温度升到720C左右，Taq聚合酶催化dNTP按碱基互补原则连接在DNA引物3ˊ端，使链延伸，形成两条与模板互补的新链。

以上为1次PCR循环（变性、复性和延伸）

（新合成的链可作为下一轮循环的模板）

按照上述（变性、复性和延伸）3个步骤反复循环，PCR产物呈指数扩增。

模板DNA扩增倍数T=2n

(n:循环次数)。83（3）引物延伸212.PCR各要素及其作用（1）模板PCR模板可以是DNA或RNA。以线性DNA模板为佳，量适中，一般为102105个拷贝；

RNA作为模板时，需要：RNAcDNAPCR,称此为RT-PCR.

（2）耐热DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)

是从耐热细菌体内提取的一种DNA聚合酶，可在95℃稳定30分钟。从而保证PCR在[94℃变性→52℃退火→72℃延伸]循环30次过程中不变性失活。逆转录842.PCR各要素及其作用逆转录22（3）引物

引物是根据已知序列的模板DNA待扩增区两端而设计的一对寡核苷酸小片断，长度一般为1530个碱基。引物是保证PCR扩增产物的大小和特异性的关键因素，其设计与合成对PCR的成功至关重要。引物设计原则如下：85（3）引物23

引物设计应符合以下基本原则：

①长度适宜，一般为1530个碱基；②G+C含量，一般为40％60％；③4种碱基应随机性分布；④引物自身不应存在互补序列；⑤两个引物之间不应有多于4个碱基的互补；⑥引物3ˊ端不应有任何修饰；⑦引物5ˊ可以修饰。86引物设计应符合以下基本原则：24（4）缓冲溶液与Mg2+

PCR技术常用1050mmol/LTris-HCl、Ph8.38.88、偏碱缓冲液；并含有一定量的Mg2+浓度；（5）dNTP浓度

PCR一般用50200μmol/L的dNTP；并且4种dNTP浓度应相等；87（4）缓冲溶液与Mg2+25（6）参数

变性温度与时间

一般选择：940C，30秒退火温度与时间

取决于引物长度、浓度和G+C含量，一般选择：Tm-5℃延伸温度与时间

一般选择：70℃75℃循环次数

取决于模板浓度，一般循环：30次88（6）参数26

PCR操作

各种PCR反应的操作基本相同，只是根据引物与靶序列不同，选择不同的反应体系和循环参数。将PCR反应管置于DNA自动化热循环仪上，输入各种循环参数，使DNA扩增在热循环仪上很方便地完成。

PCR技术优点

特异性强、灵敏度高、操作简便、省时，对样本质量要求不高，能快速、特异地扩增任何DNA片断。

PCR缺点

由于高灵敏度，使易出现假阴性或假阳性结果。

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3.PCR产物分析（1）凝胶电泳分析法

可用琼脂糖（Agrose）或聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳检测PCR扩增产物的大小。同时应以标准DNA分子量作平行对照，凝胶中加入溴化乙锭，电泳后，紫外检测仪下观察结果并拍照。

（在待检靶序列拷贝数多、且仅扩增出一条带时，用此法即可满足检测要求。）903.PCR产物分析28（2）点杂交分析法

该法有2种：①将扩增产物直接固定在膜上，每一个探针制备一张膜，然后用不同的特异探针进行杂交；②将不同的探针固定在膜上，再用有标记的PCR产物与之杂交。

本法有助于检测突变DNA类型，用于人类遗传病诊断和某些基因的分析。

(当扩增产物时多条带时，用此法更合适。)91（2）点杂交分析法29

(三)基因芯片

将大量序列已知的基因片段以微阵列方式固定在一芯片上做成高密度的点阵排列，与标记样品进行杂交，然后用计算机分析杂交信号。92(三)基因芯片30

(四)基因测序即，DNA碱基序列分析，这是最确切、最直接的基因诊断方法。目前常用的方法为Maxam-Gilbert建立的化学裂解法和Sanger建立的双脱氧末端终止法。

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四.基因诊断的临床应用(一)遗传病的基因诊断(二)肿瘤的基因诊断(三)感染性疾病的基因诊断94四.基因诊断的临床应用(一)遗传病的基因

举例：

——镰刀状红细胞贫血

β－珠蛋白基因的第六个密码子A→T↓

表达产物：谷氨酸→缬氨酸

一个碱基突变→缺失1个MstⅡ内切酶位点

正常人：1.1kb患者：1.3kb95举例：33

5’3’

5’3’

1.1kb

1.3kb

MstII酶切位点（CCTNATG）正常基因突变基因1.3kb1.1kb0.2kb123

1、正常人2、突变携带者3、患者96

第二节基因治疗

基因治疗的概念基因治疗的总体策略基因治疗的基本程序基因治疗的现状与展望97第二节基因治疗35一、基因治疗概念

狭义概念

用具有正常功能的基因去置换或增补患者体内有缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的。

广义概念

将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。

98一、基因治疗概念36二、基因治疗的总体策略

基因矫正

基因置换

基因增补

基因失活

“自杀基因”的应用免疫基因治疗耐药基因治疗

99二、基因治疗的总体策略37（一）基因矫正（genecorrection）

对于致病基因中的异常碱基进行精确修复，使其恢复正常功能。

（二）基因置换(genereplacement)

用正常基因在原位替换致病基因，使细胞DNA完全恢复正常状态。

100（一）基因矫正（genecorrection）38（三）基因增补*(geneaugmentation)

将正常基因导入患者体细胞内，使其整合到染色体中一起表达，以补偿缺陷基因的功能（但致病基因未去除）。（四）基因失活(geneinactivation)

指将特定的反义核酸导入细胞，通过碱基互补作用与mRNA结合，阻断肿瘤细胞中基因的异常表达，以抗肿瘤、抗病毒。

反义RNA:

干扰mRNA的互补RNA;

反义DNA:

干扰DNA的互补DNA.101（三）基因增补*(geneaugmentation)39（五）“自杀基因”的应用自杀基因(suicidegene)

这种基因导入受体细胞后可产生一种酶，它可将原无细胞毒性或低毒药物前体转化为细胞毒物质，将细胞自身杀死，这种基因被称为“自杀基因”。如果将自杀基因导入肿瘤细胞，则可将肿瘤细胞杀死。但对正常细胞则无伤害作用。

102（五）“自杀基因”的应用40（六）免疫基因治疗将某些细胞因子（IL-2、GM-CSF等）基因导入肿瘤患者体内，以增强患者的抵抗力。（七）耐药基因治疗在肿瘤化疗过程中，把产生抗药物毒性的基因导入患者体内，从而使患者能耐受更大剂量的化疗。103（六）免疫基因治疗41

三、基因治疗的基本程序（一）治疗性基因的获得

在了解疾病发生的分子机制基础上，选择对疾病有治疗作用的特定基因。

如，对单基因缺陷遗传病，可用野生型（非突变）基因即可用于治疗；对于肿瘤，最好选择某些与该类肿瘤密切相关的癌基因或抑癌基因用于基因治疗。

治疗性基因获得的方法很多：

用酶切或探针杂交法从基因组DNA文库获得，从cDNA文库获取，PCR扩增，人工合成等。104三、基因治疗的基本程序42（二）基因载体的选择

基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移入患者体内、并能调控其适度表达。

常用的载体有两类：病毒载体和非病毒载体。

病毒载体：逆转录病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体等；

非病毒载体：

与病毒载体的主要区别在于：采用理化方法将治疗基因转移入患者体内。105（二）基因载体的选择43（三）靶细胞的选择

基因治疗的受体细胞有生殖细胞和体细胞两大类。

对生殖细胞进行基因治疗，可使该生殖细胞分化发育成长的个体及其后代均具有正常基因，理论上讲是根治遗传病的理想方法。但由于涉及安全性和伦理学问题，目前基因治疗中禁止使用生殖细胞作为靶细胞，只限于使用体细胞。

106（三）靶细胞的选择44

人类基因治疗中，将治疗基因导入靶细胞有两种途径。

一种为直接体内疗法（invivo）：即，将治疗基因直接导入体内有关组织细胞；

另一种为间接体内疗法（exvivo）：即，在体外先将治疗基因导入培养的靶细胞内，再将已获得表达外源基因的遗传修饰细胞回输入病人体内，达到治疗目的。107人类基因治疗中，将治疗基因导入靶细胞有两种45

治疗基因导入受体细胞的方法

化学方法物理方法膜融合法病毒载体法质粒DNA直接转移法（四）基因转移方法

磷酸钙法DEAE－葡聚糖法

电穿孔法粒子轰击法（基因枪法）108

(五)转导细胞的选择鉴定标记基因技术基因缺陷型受体细胞技术基因共转染技术分子杂交技术外源基因表达鉴定(六)回输体内将治疗性基因修饰的细胞以不同方式回输体内。109(五)转导细

四、基因治疗的应用与展望

(一)基因治疗应满足的条件：1、单基因缺陷疾病2、仅限体细胞的基因治疗3、靶细胞易获取、培养、及回输体内。4、治疗效果应胜过对病人的危害。5、表达水平无需调控且无副作用。6、需经动物实验验证安全可行。110四、基因治疗的应用与展望48

（二）基因治疗有待解决的问题1、难以获得真正有治疗作用的基因。2、外源基因的表达难以在体内精确调控。3、体细胞经体外培养后，其生物学特性会有改变。4、过多的外源蛋白对机体带来可能的影响。