酶的非水相催化精选课件

观念的改变有关酶的催化理论是基于酶在水溶液中的催化反应建立起来的。近年来，进行了非水介质的酶结构与功能、酶作用机制、酶作用动力学的研究，建立起非水酶学（non-aqueousenzymology)。观念的改变有关酶的催化理论是基于酶在水溶液中的催化反应建立起1观念的改变新酶促反应体系的发现,拓宽了酶催化反应的应用范围,使酶法合成逐步发展成为与化学法合成相互补充的合成方法;Margolin等研究了在无水吡啶中以枯草杆菌蛋白酶为催化剂的选择性酰化反应该反应可以得到1位选择性酰化产物;传统的化学法是无法区分这些二级羟基的,显示了酶法合成的优越性.观念的改变新酶促反应体系的发现,拓宽了酶催化反应的应用范围,2非水溶剂（有机介质）中酶催化的研究20世纪初，Bourquelot等人，将微量乙醇、丙酮类有机溶剂加到酶的水溶液中，酶有活性，但比水溶液中低得多1966年以来，Dostoli和Siegel分别报道胰凝乳蛋白酶和辣根过氧化物酶在几种非极性有机溶剂中具有催化活力1975-1983年，Buckland和Martinek等探讨了微生物细胞、游离酶和固定化酶在有机溶剂中合成脂和类固醇及缁醇转化1984年Klibanov在《Science》上发表关于酶在有机介质中催化条件和特点的综述，标志着该领域的研究取得突破性进展非水溶剂（有机介质）中酶催化的研究20世纪初，Bourque3酶在有机介质中的催化的确立1984年美国KlibanovA.M.在Science上发表了一篇关于酶在有机介质中催化条件和特点的综述，在仅含微量水的有机介质中成功酶促合成了酯、肽、手性醇等许多有机化合物。KlibanovA.M.结论：只要条件合适，酶可在非生物体系的疏水介质中催化天然或非天然的疏水性底物和产物的转化，酶可在水与有机剂互溶体系、水与有机剂量组成的双液相体系、仅含微量水或几乎无水的有机剂中表现出催化活性。酶在有机介质中的催化的确立1984年美国KlibanovA4为什么酶在有机溶剂中表现出催化活性？通过酶在水相和有机相中的结构比较，证实了在有机相中酶能够保持其整体结构的完整性，至少是酶活性部位与水溶液中的结构是相同的。不同介质中酶活性中心的完整性相差不大，但酶活力却相差4个数量级。因此认为酶分子结构的动态变化很可能是主要因素.北口博司认为酶分子的“紧密”和“开启”两种状态处于一种可动平衡中，表现出一定柔性。有机溶剂中酶分子和水合作用、蛋白质柔性和酶活力之间和关系比过去的认识要复杂得多。酶结合水酶水或有机剂为什么酶在有机溶剂中表现出催化活性？通过酶在水相和有机相中的5第一节酶非水相催化的研究概况受非水介质的影响，其催化特性与在水相中不同酶的非水相催化类型主要包括:一、有机介质的酶催化；二、气相介质的酶催化；三、超临界流体介质中的酶催化；四、离子液介质中的酶催化go第一节酶非水相催化的研究概况受非水介质的影响，其催化特性与6有机介质的酶催化指酶在含有一定水的有机溶剂中进行催化反应;适用范围:底物或产物或其一为疏水性物质的酶催化作用;原因:酶在有机相中能保持结构的完整;特性:酶的底物特异性、立体选择性、区域选择性、键选择性、热稳定性等有所改变；应用：多肽、酯类、甾体转化、功能高分子合成、手性药物拆分的研究。有机介质的酶催化指酶在含有一定水的有机溶剂中进行催化反应;7如多酚氧化酶催化酚类物质的氧化反应：水果、蔬菜的褐变就是由于果蔬类中含酚类物质和多酚氧化酶，破损时与氧气接触，发生上述反应而变为褐色。因此，在水相中无法得到邻醌类化合物或邻酚类物质；但在氯仿中酶催化反应生成的邻醌类化合物不易发生聚合，从而可得到邻醌类化合物。因此研究非水相酶催化反应很有必要。如多酚氧化酶催化酚类物质的氧化反应：水果、蔬菜的褐变就是由于8气相介质的酶催化指酶在气相介质中进行催化反应；适用范围：底物是气体或能转化为气体的物质；特性：气体介质密度低，扩散容易；与在水相中明显不同；气相介质的酶催化指酶在气相介质中进行催化反应；9有优于液相反应的优点：某些酶在液相中使用受到一定的限制，如酶和辅酶的操作不稳定性，底物及产物的不溶性和酶的活性被产物抑制等，而气相中的反应就可以克服这些缺点，而且气相中的酶促反应更利于易挥发性产品的生产；Hwang等研究了固定化醇氧化酶在气相中的催化反应生物酶用于气相催化不适用于糖氨基酸等不易挥发的底物但它将来可用于某些易挥发产品的工业生产以及有害气体的分析和处理Back有优于液相反应的优点：某些酶在液相中使用受到一定的限制，如酶10超临界流体介质中的酶催化酶在超临界流体中进行催化反应；超临界流体指温度和压力超过临界点的流体；supercritical状态，简称SC状态；

由于黏度、介电常数、扩散系数和溶解能力都与密度有关，因此可以方便地通过调节压力来控制超临界流体的物理化学性质。与常用的有机溶剂相比，超临界流体特别是SCCO２、SCH2O还是一种环境友好的溶剂。要求：超临界流体对酶结构无破坏；具良好化学稳定性；温度不可太高太低；压力不可太高；易获得等。常用的超临界流体有：CO2,SO2C2H4,C2H6C3H8C4H10

等。超临界流体介质中的酶催化酶在超临界流体中进行催化反应；11指酶在离子液中进行催化作用；酶在有机溶剂中活力低的原因在有机介质中酶所处的pH环境与酶在冻干或吸附到载体上之前所使用的缓冲液pH值相同，称为pH-imprinting;适用范围：底物是气体或能转化为气体的物质；①有机溶剂极性小，疏水性强，疏水性底物难于进入必需水层；1、不同酶具不同结构和特性，同一种酶由于来源、处理法不同特性亦有差别；生物柴油的燃点是柴油的两倍，因此使用、处理、运输和储藏都极其安全；意义:酶催化酯合成可合成手性化合物,且酶的立体选择性主要是选择立体异构的醇.如果用化学方法聚合，需要将有些羟基保护起来，避免副反应，聚合后，再脱保护，反应过程复杂，还有异构体产生，酶法聚合则不必保护基团，反应条件温和。酶分子处在反胶束内，稳定性好；1、不同酶具不同结构和特性，同一种酶由于来源、处理法不同特性亦有差别；3、另注意酶的稳定性、底物专一性,对映体选择性、区域选择性、键选择性等例：Rubion报道P.有机相的固定化载体与方法的选择与在水相中的不同，最重要的是要满足酶在有机相反应中的微观环境，有利于酶的分散和稳定；因此在非水相酶反应体系中存在着最佳含水量,该最佳含水量不仅取决于酶的种类也与所选用的有机溶剂有关.20世纪初，Bourquelot等人，将微量乙醇、丙酮类有机溶剂加到酶的水溶液中，酶有活性，但比水溶液中低得多液体燃料的不足已严重威胁到我国的能源与经济安全；例4：蛋白质工程和抗体酶技术有机溶剂中酶含水量>最适水量，酶构象过于“柔性”，因变构而失活；有机溶剂中酶含水量<最适水量，酶构象过于“刚性”而失活；优点：1)与水相比较，脂溶性反应物和产物可溶于超临界CO２中，而酶作为蛋白质不溶解，有利于三者的分离；2)产品回收时，不需要处理大量的稀水溶液，可解决环境污染问题；3)与有机溶剂体系相比，CO２无毒，不燃烧、廉价、无有机溶剂残留之虞；4)CO２超临界体系具有气体的高扩散系数、低粘度和低表面张力使底物向酶的传质速度加快从而使反应速度提高，且在临界点附近，溶解能力和介电常数对温度和压力敏感，故反应速度提高。亦可以控制反应速率和反应平衡；5)可简化产物的分离，有可能将反应和分离过程耦合。已对10多种酶反应进行了研究，主要是酯化反应、酯交换反应、酯水解反应和氧化反应。反应条件温和，反应温度低于50℃Back指酶在离子液中进行催化作用；优点：Back12离子液介质中的酶催化指酶在离子液中进行催化作用；离子液Ionicliquids(ILs)是有机阳离子、有机阴离子在室温下呈液态低熔点盐类，挥发性好，稳定性好；特性：酶在其中有良好的稳定性、区域选择性、立体选择性、键选择性。离子液介质中的酶催化指酶在离子液中进行催化作用；13总结在酶非水相催化中研究最多的是有机溶剂;1984.Kilibanov指出酶可在水与有机溶剂互溶体系、或组成的两相体系、或微水体系中进行催化；包括水解酶、氧化还原酶、醛缩酶等十几种酶均可在有机剂中催化；非水酶学与非水介质中酶催化应用取得了显著效果。总结在酶非水相催化中研究最多的是有机溶剂;14第二节

有机介质中水和有机溶剂

对酶催化反应的影响go第二节

有机介质中水和有机溶剂

对酶催化反应的影响go151、微水介质体系；2、与水溶性有机溶剂组成的均一体系；3、与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系；4、（正）胶束体系；5、反胶束体系。一、有机介质反应体系1、微水介质体系；一、有机介质反应体系161、微水介质体系是有机溶剂和微量水组成的反应体系;微量水主要是酶分子结合水,对维持酶分子空间构象和催化活性至关重要;另一部分水分配在有机溶剂中;酶以冻干粉或固定化酶的形式悬浮于有机介质中;是常见的有机反应体系.1、微水介质体系是有机溶剂和微量水组成的反应体系;172、与水溶性有机溶剂组成的均一体系由水与极性较大的有机溶剂互混组成；水与有机剂含量均较大；适用的酶较少；辣根过氧化酶（HRP）应用：催化酚类或芳香胺类聚合成聚酚或聚胺类物，在环保黏合剂、导电聚物、发光聚合物材料中有重要作用。2、与水溶性有机溶剂组成的均一体系由水与极性较大的有机溶剂互183、与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系由水和疏水性较强的有机溶剂组成两相或多相体系；游离酶、亲水性底物溶于水相，疏水性底物或产物溶于有机相；固定化酶在界面；催化反应在两相界面进行；适于底物或产物属于疏水化合物的反应。3、与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系由水和疏水性较强的194、（正）胶束体系大量水溶液中含少量与水不溶的有机溶剂，加入表面活性剂形成水包油微小液滴；表面活性剂极性端朝外,非极性端朝内,有机溶剂包在液滴内部;酶在水溶液中,疏水底物或产物在胶束内,反应在胶束界面进行.水相有机相酶4、（正）胶束体系大量水溶液中含少量与水不溶的有机溶剂，加入205、反相胶束体系反相胶束:在与水不互溶的在量有机溶剂中,加入表面活性剂后形成的油包水的微小水滴；1997年首次报道酶在反相胶束中具有活性(已发现40多种酶)；酶分子处在反胶束内，稳定性好；反胶束与生物膜有相似之处，适于研究生物膜表面酶的结构、催化特性、动力学特性。水相有机相酶5、反相胶束体系反相胶束:在与水不互溶的在量有机溶剂中,加21不同类型的酶在反相胶束中的排布模型不同类型的酶在反相胶束中的排布模型22立体选择系数越大，酶催化的对映体选择性越强1997年首次报道酶在反相胶束中具有活性(已发现40多种酶)；有优于液相反应的优点：某些酶在液相中使用受到一定的限制，如酶和辅酶的操作不稳定性，底物及产物的不溶性和酶的活性被产物抑制等，而气相中的反应就可以克服这些缺点，而且气相中的酶促反应更利于易挥发性产品的生产；意义：可在不需基团保护下合成氨基醇脂；利用酶与配体的相互作用，诱导改变酶的构象，制备具有结合该配体及其类似物能力的“新酶”；第五节

有机介质中酶催化的应用2≤lgP≤5利用酶催化获得高的立体选择性，化学催化提供高产率，特性合成手性聚合物是一条很有应用潜力的新途径。2、利用嗜热菌蛋白酶生产天苯肽；有的酶分子则保持完整；反应后期，此低水合盐结合反应产生的水变为高水合盐，保持了体系的水活度。3、5－羟色胺拮抗物和摄取抑制剂类手性药物过氧化物酶聚合酚类、胺类聚合5．在各种替代燃油中，只有生物柴油全部达到美国“清洁空气法”所规定的健康影响检测的要求。大量水溶液中含少量与水不溶的有机溶剂，加入表面活性剂形成水包油微小液滴；1994年以来，手性药物世界销售额以年20％以上的速度增长。底物脱离溶剂束缚能力差有优于液相反应的优点：某些酶在液相中使用受到一定的限制，如酶和辅酶的操作不稳定性，底物及产物的不溶性和酶的活性被产物抑制等，而气相中的反应就可以克服这些缺点，而且气相中的酶促反应更利于易挥发性产品的生产；极性较弱的有机溶剂中,疏水性较弱的底物易反应;一、有机介质的酶催化；二、水对有机介质中酶催化的影响立体选择系数越大，酶催化的对映体选择性越强二、水对有机介质中23水的影响水在酶催化反应中发挥着双重作用:一方面,水分子直接或间接地通过氢键疏水键及范德华力等非共价键相互作用来维持酶的催化活性所必需的构象,与酶分子紧密结合的一层左右的水分子对酶的催化活性是至关重要的,称之为必需水,不同酶与必需水结合的紧密程度及所结合的必需水数量是不同的;水的影响水在酶催化反应中发挥着双重作用:24水的影响另一方面水是导致酶的热失活的重要因素,有水存在时随着温度的升高酶分子会发生以下变化而失活:(1)形成不规则结构;(2)二硫键受到破坏;(3)天冬酰胺和谷氨酰胺水解变为相应的天冬氨酸和谷氨酸;(4)天冬氨酸肽键发生水解.因此在非水相酶反应体系中存在着最佳含水量,该最佳含水量不仅取决于酶的种类也与所选用的有机溶剂有关.水的影响另一方面水是导致酶的热失活的重要因素,有水存在时随着251、水对酶分子空间构象的影响无水下酶空间构象被破坏,故需一层水化层;必需水:维持酶分子完整空间构象所必需的最低水量;不同的酶所需求的必需水的量差别较大;每分子凝乳蛋白酶只需50分子的水，每分子多酚氧化酶却需3.5×102个水分子原因:必需水是维持酶分子结构中氢键、盐键等副键所必需的。1、水对酶分子空间构象的影响无水下酶空间构象被破坏,故需一层26结合水含量(%)酶周围水分子个数作用0~70~60有助于蛋白质侧链残基的离子化7~2560~2207%水分子在其他极性部位形成簇，25%肽键的氨基被水合，蛋白质结构基本不变，酶活不变25~38220~300肽键羧基为主的极性部位完全水合，酶活随含水量增加而增加。>38>300整个酶分子被一层单分子水层包围酶活力是水溶液中的１/10。结合水含量(%)酶周围水分子个数作用0~7272.水对酶催化反应速度的影响

典型的非水酶体系中水含量通常只占0.01%，但其微小差距会导致酶催化活力的较大改变。水影响蛋白质结构的完整性、活性位点的极性和稳定性。2.水对酶催化反应速度的影响典型的非水酶体系中水含量通常只28酶的非水相催化精选课件29有机溶剂中酶含水量<最适水量，酶构象过于“刚性”而失活；有机溶剂中酶含水量>最适水量，酶构象过于“柔性”，因变构而失活；最适水量：蛋白质结构的动力学刚性和热力学稳定性之间的最佳点平衡点，酶活性最大，保证酶的极性部位水合，表现酶活力所必需同一种酶，反应系统的最适水量与有机溶剂的种类、酶的纯度、固定化酶的载体性质核修饰性质有关有机溶剂中酶含水量<最适水量，酶构象过于“刚性”而失活；30有机介质中含两类水：结合水、游离水；在结合水不变的条件下，体系含水量的变化对酶催化活性影响不大；然而在一些体系中，溶剂和底物性质对酶活力也有直接或间接影响；为了排除溶剂对最适含水量的影响，Halling建议用水活度（aw）描述有机介质中酶催化活力与水的关系：水活度：体系中水的逸度与纯水逸度之比；用体系中水蒸汽压与相同条件下纯水蒸汽压之比表示；

Aw=P/PoP：一定条件下体系中水的蒸汽压

Po:相同条件下纯水的蒸汽压水活度与溶剂极性大小无关，最适含水量与溶剂极性成正比，故采用水活度作参数更确切；3.水活度（activityofwater)有机介质中含两类水：结合水、游离水；3.水活度（activi31三有机溶剂对有机介质中酶催化的影响三有机溶剂对有机介质中酶催化的影响32有机溶剂影响有机溶剂主要通过以下三种途径发生作用:一是有机溶剂与酶直接发生作用通过干扰氢键和疏水键等改变酶的构象从而导致酶的活性被抑制或酶的失活;二是有机溶剂和能扩散的底物或反应产物相互作用影响正常反应的进行;三是有机溶剂还可以直接和酶分子周围的水相互作用有机溶剂影响有机溶剂主要通过以下三种途径发生作用:331.有机溶剂对酶结构与功能的影响在水溶液中酶分子均一地溶解在水溶液中，较好地保持其构象；有机溶剂中酶分子不能直接溶解，因此根据酶分子特性与有机溶剂特性不同，其空间结构的保持也有不同。有些酶在有机溶剂作用下，其结构受到破坏；有的酶分子则保持完整；1.有机溶剂对酶结构与功能的影响在水溶液中酶分子均一地溶解34（1）由于酶分子与溶剂的直接接触，蛋白质分子表面结构发生不可忽视的变化；（2）通过减少整个活性中心的数量，溶剂对酶的活性中心产生影响，活性中心数目丧失的多少取决于溶剂中的疏水性大小。Why？溶剂与底物竞争酶的活性中心结合位点，溶剂为非极性，影响更明显，溶剂分子能渗透入酶的活性中心，降低活性中心的极性，增加酶与底物的静电斥力。（1）由于酶分子与溶剂的直接接触，蛋白质分子表面结构发生不可35（1）有机溶剂对结合水的影响一些相对亲水性的有机溶剂能够夺取酶表面的必需水而导致酶失活。酶失水的情况与溶剂的介电常数和疏水性参数有关。由于酶与溶剂竞争水分子，体系的最适含水量与酶的用量及底物浓度有关。2.有机溶剂对酶活性的影响（1）有机溶剂对结合水的影响一些相对亲水性的有机溶剂能够夺取36酶一般不溶于有机剂中，双亲分子或非共价修饰酶分子表面可增加表面疏水性使酶均一溶于有机剂中提高酶催化效率与稳定性。有机溶剂中的酶能够“记忆”在冷冻干燥或丙酮沉淀前所在缓冲液中的PH，pH记忆，pH印记;包括水解酶、氧化还原酶、醛缩酶等十几种酶均可在有机剂中催化；生物柴油的优点主要有：

1.非线性光学材料是激光技术的重要物质基础，在激光倍频、混频、参量放大与振荡、集成光学、光信息处理与光信号控制、光电子计算机等方面有重要应用；水在酶催化反应中发挥着双重作用:蛋白酶肽合成合成多肽2、利用嗜热菌蛋白酶生产天苯肽；原因：在有机溶剂中酶分子表面的必需水只要在特定的PH和离子强度下，酶分子活性中心周围的基因才能处于最佳的离子化状态是有机溶剂和微量水组成的反应体系;不同的有机介质，酶的底物专一性也不一样；因此研究非水相酶催化反应很有必要。意义：可在不需基团保护下合成氨基醇脂；例4：蛋白质工程和抗体酶技术①N-乙酰-L丝氨酸乙酯原因：可能是有机介质中缺少引起酶变性的水分子；1%以下，而在乙酸乙酯和微水组成的两相系统中，合成率可达100%。已对10多种酶反应进行了研究，主要是酯化反应、酯交换反应、酯水解反应和氧化反应。有优于液相反应的优点：某些酶在液相中使用受到一定的限制，如酶和辅酶的操作不稳定性，底物及产物的不溶性和酶的活性被产物抑制等，而气相中的反应就可以克服这些缺点，而且气相中的酶促反应更利于易挥发性产品的生产；例：Rubion报道P.（2）溶剂属性(极性)与酶活力的定量关系酶在不同的有机溶剂中活力差别很大；研究最多的是酶活力与溶剂极性参数lgP之间的关系；P：指溶剂在正辛烷与水两相中的分配系数，lgP越大，极性越小；Laane的实验发现：lgP<2的极性溶剂中，由于溶剂极性强，易夺取酶分子表面水层而降低酶的活力。lgP>4，酶具有较高活力，此类溶剂较理想。2<lgP<4，酶活力中等。酶一般不溶于有机剂中，双亲分子或非共价修饰酶分子表面可增加表37３、溶剂对底物和产物分配的影响溶剂能直接或间接地与底物和产物相互作用。溶剂能改变酶分子必需水层中底物或产物的浓度。①有机溶剂极性小，疏水性强，疏水性底物难于进入必需水层；②有机溶剂极性过强，亲水性强，疏水性底物在有机溶剂中溶解度太低；故选择2≦lgp≦5的有机溶剂作为有机介质为宜。Yang等发现：溶剂对底物和产物的影响主要体现在底物和产物溶剂化上，从而影响反应动力学和热力学平衡。３、溶剂对底物和产物分配的影响溶剂能直接或间接地与底物和产物38第三节

酶在有机介质中的催化特性有机溶剂的存在,改变了疏水相互作用的精细平衡,从而影响到酶的结合部位.有机溶剂会改变底物存在状态.结果影响酶的稳定性和酶的底物特异性,立体选择性,区域选择性和化学键选择性.第三节

酶在有机介质中的催化特性有机溶剂的存在,改变了疏水39一、底物专一性有机介质中酶活性中心结合部位与底物的结合状态发生改变,致使酶的底物特异性发生改变;水溶液中底物与酶活性中心结合靠疏水作用;有机介质中有机剂与底物的疏水作用更强;①N-乙酰-L丝氨酸乙酯②N-乙酰-L-苯丙氨酸乙酯疏水性:②﹥①介质水辛烷蛋白酶②﹥①①﹥②水解速度底物一、底物专一性有机介质中酶活性中心结合部位与底物的结合状态发40底物专一性(续)不同的有机介质，酶的底物专一性也不一样；极性较强的有机溶剂中,疏水性较强的底物易反应;极性较弱的有机溶剂中,疏水性较弱的底物易反应;①N-乙酰-L丝氨酸乙酯②N-乙酰-L-苯丙氨酸乙酯疏水性:②﹥①二氯甲烷吡啶枯草杆菌蛋白酶①﹥②+丙醇(极性较强)底物介质反应速度②﹥①底物专一性(续)不同的有机介质，酶的底物专一性也不一样；①N41二、对映体选择性（enantioselectivity)又称立体选择或立体异构专一性，是酶在对称的外消旋化合物中识别一种异构体的能力大小指标；立体选择系数越大，酶催化的对映体选择性越强立体选择系数：二、对映体选择性（enantioselectivity)又称42有机溶剂中酶对底物的对映体选择性由于介质的亲(疏)水性的变化而发生改变。酶在水溶液中立体选择性强，疏水性强的有机溶剂中的酶的立体选择性差。这种选择性是由底物的两种对映体把水分子从酶分子疏水结合位置换出来的能力不同；介质的疏水性加大，L型底物置换水的过程在热力学上不利。原因有机溶剂中酶对底物的对映体选择性由于介质的亲(疏)水性的变化43溶剂的几何形状也影响酶的对映体选择性，如Ottolina报道一些脂肪酶、蛋白酶在（R）-香芹酮及（S）-香芹酮中立体选择性不同；对映体选择性意义：蛋白酶在水溶液中对L-氨基酸起作用，而在有机介质中可用D-氨基酸为底物合成手性药物，有重要应用。溶剂的几何形状也影响酶的对映体选择性，如Ottolina报道44三、区域选择性（regioselectivity）

酶能够选择性地催化底物分子中某个区域的基团优先发生反应；用区域选择系数Krs的大小衡量。与立体选择系数相似，用1、2代替构型；反应的位置选择因子：

K1，2=（kcat/Km)1/（kcat/Km)2例：1,4-二丁酰基-2-辛基苯丁醇脂肪酶转脂反应+甲苯乙腈K4，120.5三、区域选择性（regioselectivity）酶能够选45（kcat/Km

）1/（kcat/Km

）2与溶剂的疏水性相关

例：Rubion报道P.cepacia脂肪酶脂直接反应，K1，2与溶剂的疏水性常数lgP有较好的相关性abc疏水介质亲水介质（kcat/Km）1/（kcat/Km）2与溶剂的疏水性46蛋白酶肽合成合成多肽其他种类酶（如酯酶、过氧化物酶、醇脱氢酶等）也能进行拆分反应，但因这些酶不易获得，价格昂贵或需要辅酶而较少研究。是有机溶剂和微量水组成的反应体系;七、pH值和离子强度的控制多酚氧化酶氧化芳香化合物羟基化1997年首次报道酶在反相胶束中具有活性(已发现40多种酶)；有机介质中含两类水：结合水、游离水；非线性光学材料：酶法合成的聚酚类物具有较高的三阶非线性光学系数X（3）1986年Klibanov小组首先开展了有机相中酶结合成糖酯的研究。有机溶剂中的酶能够“记忆”在冷冻干燥或丙酮沉淀前所在缓冲液中的PH，pH记忆，pH印记;羟基化酶氧化甾体转化有优于液相反应的优点：某些酶在液相中使用受到一定的限制，如酶和辅酶的操作不稳定性，底物及产物的不溶性和酶的活性被产物抑制等，而气相中的反应就可以克服这些缺点，而且气相中的酶促反应更利于易挥发性产品的生产；胆固醇氧化酶氧化胆固醇测定3、与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系；酶在不同的有机溶剂中活力差别很大；微量水主要是酶分子结合水,对维持酶分子空间构象和催化活性至关重要;酶催化合成可生物降解高分子其他种类酶（如酯酶、过氧化物酶、醇脱氢酶等）也能进行拆分反应，但因这些酶不易获得，价格昂贵或需要辅酶而较少研究。①有机溶剂极性小，疏水性强，疏水性底物难于进入必需水层；由水和疏水性较强的有机溶剂组成两相或多相体系；——辣根过氧化物酶催化酚及芳香胺类物质的聚合3特性:酶的底物特异性、立体选择性、区域选择性、键选择性、热稳定性等有所改变；四、键选择性（chemoselectivity)即同一个底物分子中有2种以上化学键可与酶反应，酶对其一优先反应；6-氨基-1-已醇黑曲霉脂肪酶毛霉脂肪酶羟基酰化氨基酰化占优意义：可在不需基团保护下合成氨基醇脂；蛋白酶肽合成合成多肽四、键选择性（47Tawaki等人发现反应介质对某些氨基醇的丁酰化的化学键选择性（O-酰化与N-酰化）有很大影响；化合物与丁酸三氯化乙酯的酰化反应在叔丁醇中和在1，2－二氯乙烷中的酰化程度不同；酰化度不同Tawaki等人发现反应介质对某些氨基醇的丁酰化的化学键选择48五、热力学稳定性有机溶剂中酶的热稳定性和储存稳定性都比水溶液中高；有机溶剂中酶的热稳定性还与介质中水含量有关；原因：可能是有机介质中缺少引起酶变性的水分子；Klibanov和Volkin认为：由于有机溶剂中缺少使酶热失活的水分子，由水引起的蛋白质热失活的全过程难以进行。五、热力学稳定性有机溶剂中酶的热稳定性和储存稳定性都比水溶49酶的非水相催化精选课件50六.pH值特性有机溶剂中的酶能够“记忆”在冷冻干燥或丙酮沉淀前所在缓冲液中的PH，pH记忆，pH印记;现象：脂肪酶催化三丁酸甘油与正庚醇的转酯反应，酶的反应速度与其冷冻干燥前水溶液的的PH密切相关，反应的最适PH接近于水溶液中的最适PH原因：在有机溶剂中酶分子表面的必需水只要在特定的PH和离子强度下，酶分子活性中心周围的基因才能处于最佳的离子化状态检测：根据缓冲液中磷原子的核磁共振谱的变化核利用分子探针技术，可以检测酶从缓冲液中冷冻干燥或有机溶剂沉淀后，转入吸水有机溶剂中的PH六.pH值特性有机溶剂中的酶能够“记忆”在冷冻干燥或丙酮沉淀51在有机介质中酶所处的pH环境与酶在冻干或吸附到载体上之前所使用的缓冲液pH值相同，称为pH-imprinting;当酶分子从水溶液转移到有机介质时，原有的解离状态不变，被保持在有机介质中；有机介质中酶催化反应的最适ph通常与在水溶液的pH接近；但有些有机溶剂中酶的最PH与水溶液中相差较大，还与缓冲液种类和离子强度有关;可用有机相缓冲液(疏水性酸与对应盐或疏水性碱与对应盐）控制酶的解离状态，消除酶pH印记特性的影响；在有机介质中酶所处的pH环境与酶在冻干或吸附到载体上之前所使52第四节

有机介质中酶催化反应的

条件及其控制酶在有机介质中的催化反应受各种因素影响，主要有酶、底物、有机溶剂种类、水含量、温度、pH值和离子强度等。第四节

有机介质中酶催化反应的

条件及其控制酶在有机介质53一、有机介质中酶催化反应的类型1、合成反应(link)2、转移反应(link)3、醇解反应(link)4、氨解反应(link)5、异构反应(link)6、氧化还原反应(link)7、裂合反应(link)go一、有机介质中酶催化反应的类型1、合成反应(link)go541、合成反应有机介质中水含量极微，可催化水解反应的逆反应；（1）脂肪酶或酯酶催化有机酸和醇进行酯的合成反应：意义:酶催化酯合成可合成手性化合物,且酶的立体选择性主要是选择立体异构的醇.1、合成反应有机介质中水含量极微，可催化水解反应的逆反应；意55（2）蛋白酶可在有机介质中催化氨基酸进行合成反应，生成多肽back（2）蛋白酶可在有机介质中催化氨基酸进行合成反应，生成多肽b56又称立体选择或立体异构专一性，是酶在对称的外消旋化合物中识别一种异构体的能力大小指标；超临界流体介质中的酶催化HRP可催化酚类物质与天然的树脂材料木质素混聚形成酚树脂。要求：超临界流体对酶结构无破坏；（2）蛋白酶可在有机介质中催化氨基酸进行合成反应，生成多肽三、超临界流体介质中的酶催化；生物柴油可生物降解，无毒性，对环境无害，并可以从可再生资源中提取。非线性光学材料是激光技术的重要物质基础，在激光倍频、混频、参量放大与振荡、集成光学、光信息处理与光信号控制、光电子计算机等方面有重要应用；用动物和植物油脂和甲醇或乙醇等低碳醇在酸碱下高温（230～250℃）催化转酯反应,生成相应的脂肪酸甲酯或乙酯，在经洗涤干燥即得生物柴油,生产设备与一般制油设备相同,后处理复杂，废酸碱二次污染；有优于液相反应的优点：某些酶在液相中使用受到一定的限制，如酶和辅酶的操作不稳定性，底物及产物的不溶性和酶的活性被产物抑制等，而气相中的反应就可以克服这些缺点，而且气相中的酶促反应更利于易挥发性产品的生产；同一种酶，反应系统的最适水量与有机溶剂的种类、酶的纯度、固定化酶的载体性质核修饰性质有关三、超临界流体介质中的酶催化；适用范围:底物或产物或其一为疏水性物质的酶催化作用;1、水对酶分子空间构象的影响已对10多种酶反应进行了研究，主要是酯化反应、酯交换反应、酯水解反应和氧化反应。HRP在催化合成聚合物方面是一种应用较多，潜力较大的酶，HRP能够以过氧化氢为电子受体，专一地催化酚及苯胺类物质的过氧化反应。枯草杆菌蛋白酶经6个定点突变，在二甲基甲酰胺中稳定性提高50倍；溶剂能改变酶分子必需水层中底物或产物的浓度。水在酶催化反应中发挥着双重作用:由水和疏水性较强的有机溶剂组成两相或多相体系；酶分子处在反胶束内，稳定性好；①有机溶剂极性小，疏水性强，疏水性底物难于进入必需水层；2、转移反应如脂肪酸催化酯与有机酸反应生成另一种酯与有机酸,即转酯反应：back又称立体选择或立体异构专一性，是酶在对称的外消旋化合物中识别573、醇解反应假单胞脂肪酶催化酸酐醇生成二酸单酯化合物即酸酐水解反应,例:back3、醇解反应假单胞脂肪酶催化酸酐醇生成二酸单酯化合物即酸酐水584、氨解反应如脂肪酶催化酯类进行不对称氨解反应：R-苯丙氨酸甲酯酰胺叔丁醇4、氨解反应如脂肪酶催化酯类进行不对称氨解反应：R-苯丙氨酸59环氧化合物氨解back环氧化合物氨解back605、异构反应如消旋酶催化一种异构体为另一种异构体例back5、异构反应如消旋酶催化一种异构体为另一种异构体例back616、氧化还原反应（1）单加氧(link)（2）双加氧(link)（3）催化醛类或酮类还原成醇类(link)back6、氧化还原反应（1）单加氧(link)（2）双加氧(lin62（1）单加氧back（1）单加氧back63（2）双加氧（2）双加氧64（3）催化醛类或酮类还原成醇类（3）催化醛类或酮类还原成醇类657、裂合反应如醇腈酶催化醛与氢氰酸的反应back7、裂合反应如醇腈酶催化醛与氢氰酸的反应back66二、酶的选择1、不同酶具不同结构和特性，同一种酶由于来源、处理法不同特性亦有差别；2、酶反应速度与酶浓度成正比；3、另注意酶的稳定性、底物专一性,对映体选择性、区域选择性、键选择性等二、酶的选择1、不同酶具不同结构和特性，同一种酶由于来源、处67例1：印迹酶利用酶与配体的相互作用，诱导改变酶的构象，制备具有结合该配体及其类似物能力的“新酶”；Klibonov等根据酶在有机溶剂中具有“刚性”的特点，发展此修饰酶技术；方法：枯草杆菌蛋白酶从含配体N-AC-TyrNH2（竞争性抑制剂）的缓冲液中沉淀，干燥，除配体后放入无水有机剂中，配体印迹酶活性比无配体时冷冻干燥的酶高100倍；印迹酶在水中的活性与未迹酶相同；控制好“印迹酶”在有机剂中最适含水量，可用生物印迹法调节控制酶在有机剂中的催化活性和选择性。例1：印迹酶利用酶与配体的相互作用，诱导改变酶的构象，制备具68例2：化学修饰酶原理：酶一般不溶于有机剂中，双亲分子或非共价修饰酶分子表面可增加表面疏水性使酶均一溶于有机剂中提高酶催化效率与稳定性。例：稻田佑二用单氧甲基聚乙二醇共价修饰脂肪酶、过氧化酶等蛋白质表面自由氨基，修饰酶能均一溶于苯和氯仿等有机剂中。例2：化学修饰酶原理：693、利用芳香醛脱氢酶生产香兰素；酶在冷冻干燥过程中，pH状态有变化；可通过调节缓冲液pH和离子强度的方法调节有机介质中酶催化的pH值和离子强度；亦可以控制反应速率和反应平衡；方法有：多孔玻璃、硅藻土等吸附，载体表面共价交联；酶催化合成可生物降解高分子印迹酶在水中的活性与未迹酶相同；Why？溶剂与底物竞争酶的活性中心结合位点，溶剂为非极性，影响更明显，溶剂分子能渗透入酶的活性中心，降低活性中心的极性，增加酶与底物的静电斥力。利用酶与配体的相互作用，诱导改变酶的构象，制备具有结合该配体及其类似物能力的“新酶”；酶一般不溶于有机剂中，双亲分子或非共价修饰酶分子表面可增加表面疏水性使酶均一溶于有机剂中提高酶催化效率与稳定性。利用酶与配体的相互作用，诱导改变酶的构象，制备具有结合该配体及其类似物能力的“新酶”；其他种类酶（如酯酶、过氧化物酶、醇脱氢酶等）也能进行拆分反应，但因这些酶不易获得，价格昂贵或需要辅酶而较少研究。通过酶在水相和有机相中的结构比较，证实了在有机相中酶能够保持其整体结构的完整性，至少是酶活性部位与水溶液中的结构是相同的。水对酶催化反应速度的影响可用有机相缓冲液(疏水性酸与对应盐或疏水性碱与对应盐）控制酶的解离状态，消除酶pH印记特性的影响；三是有机溶剂还可以直接和酶分子周围的水相互作用当酶分子从水溶液转移到有机介质时，原有的解离状态不变，被保持在有机介质中；酶法合成改性天然多糖的主要途径大多是在聚酯链上引入糖基，以增强聚合物的生物可降解性能。溶剂能直接或间接地与底物和产物相互作用。1986年Klibanov小组首先开展了有机相中酶结合成糖酯的研究。岗火田惠雄等用二烷基型脂质以分子膜形式包囊酶表面，制成可溶于有机剂的酶-脂质复合体。酶酯质分子3、利用芳香醛脱氢酶生产香兰素；岗火田惠雄等用二烷基型脂质以70例3：固定化酶冷冻干燥的酶粉在反应中常发生聚集，导致催化率降低；酶固定化后，增大酶与底物接触的表面积，一定程度上提高了酶在有机剂中的扩散效果和热力学稳定性；方法有：多孔玻璃、硅藻土等吸附，载体表面共价交联；有机相的固定化载体与方法的选择与在水相中的不同，最重要的是要满足酶在有机相反应中的微观环境，有利于酶的分散和稳定；酶活力与载体亲水性成反比。定向固定化酶技术，使酶活性中心背向载体，消除了底物结合的空间障碍。例3：固定化酶冷冻干燥的酶粉在反应中常发生聚集，导致催化率降71例4：蛋白质工程和抗体酶技术枯草杆菌蛋白酶经6个定点突变，在二甲基甲酰胺中稳定性提高50倍；Janda用脂肪酶水解反应的底物的过渡态类似物诱导，制备了具脂肪酶活性的两种单抗，对R型和S型具明显的对映体选择性。back例4：蛋白质工程和抗体酶技术枯草杆菌蛋白酶经6个定点突变，在72三、底物的选择和浓度控制1、有机剂与水中酶的底物专一性不同；2、底物浓度对酶催化速度有明显的影响；3、有机介质中要考虑底物在有机溶剂和必需水层中的分配情况；4、高浓度底物会对反应产生不利影响。back三、底物的选择和浓度控制1、有机剂与水中酶的底物专一性不同；73四、有机溶剂的选择1、有机剂的极性要选择恰当：极性过强,夺取较多酶表面水分子,使疏水性底物溶解度降低;极性过弱,底物难以进入必需水层;故取中间:2≤lgP≤5四、有机溶剂的选择1、有机剂的极性要选择恰当：74有机溶剂的选择（续）2、与水混溶的有机介质其含量对酶催化有影响。与水混溶的二氧六环介质,辣根过氧化酶(HRP)催化对苯基苯酚的聚合反应,随着二氧六环的含量增加,酶催化得到的聚合物的分子量也增加,80%时最大。二氧六环含量/%聚合物相对分子质量有机溶剂的选择（续）2、与水混溶的有机介质其含量对酶催化有影75有机溶剂的选择（续）虽然溶剂对酶活和选择性影响机制不十分清楚，但改变溶剂确能调节酶活性与选择性，改变酶动力学特性和稳定性。Klibanov称之为“溶剂工程”，是蛋白质工程辅助方法，即不改变蛋白质本身，改变介质来改变酶特性。有机溶剂的选择（续）虽然溶剂对酶活和选择性影响机制不十分清楚76五、含水量的控制当其它因素不变时，系统含水量对酶活性有影响，只有在最适含水量时酶才有最高活力；1、有最适水含量，且随溶剂极性增大（lgP减小）而增大；1水含量反应速度21341-已烷2-四氯甲烷3-甲苯4-苯五、含水量的控制当其它因素不变时，系统含水量对酶活性有影响，77含水量的控制（续）2、水活度变化不大，故更确切反应水的影响，一般在0.5-0.6。水活度反应速度21341-已烷2-四氯甲烷3-甲苯4-苯含水量的控制（续）2、水活度变化不大，故更确切反应水的影响，78含水量的控制（续）水活度的控制：向干燥的反应器中直接加入某种高水合盐可获得恒定的水活度；Kvittingen在研究已烷中脂肪酶催化丁酸丁酯合成反应中，以Na2SO4·10H2O/Na2SO4及Na2HPO4·12H2O/Na2HPO4·7H2O水合盐对作水缓冲剂，控制水活度；原理：高水合盐在初始阶段释放结合水到体系中，供给酶必需水，本身变为低水合盐；反应后期，此低水合盐结合反应产生的水变为高水合盐，保持了体系的水活度。back含水量的控制（续）水活度的控制：向干燥的反应器中直接加入某种79六、温度的控制1、微水有机介质中含水量低，酶的热稳定性增强，其最适温度高于水溶液中催化的最适温度；2、温度低，酶的立体选择性高。Lam和Keinan的实验结果支持此结论；back六、温度的控制1、微水有机介质中含水量低，酶的热稳定性增强，80七、pH值和离子强度的控制酶在有机介质中的最适PH值通常与在水溶液中催化的最适pH相同或接近；可通过调节缓冲液pH和离子强度的方法调节有机介质中酶催化的pH值和离子强度；酶在冷冻干燥过程中，pH状态有变化；希令（hilling)发现缓冲液对冷冻干燥过程中pH值和酶活力有影响，故加入一定量的蔗糖、甘露醇等冷冻干燥保护剂；在酶液冻干之前或催化过程采取保护措施；加有机相缓冲液可对有机介质中酶反应的pH调节。back七、pH值和离子强度的控制酶在有机介质中的最适PH值通常与在81酶在有机溶剂中活力低的原因非水介质中酶活力比水相低几个数量级，要提高有机剂中酶活力最有效办法是在酶脱水过程中防止酶失活，另一种是改善酶在非水介质中刚性构象

原因

说明

解决方法扩散限制不少人认为如此增加搅拌速度，降低酶颗粒封闭活性中心降低几分之一酶活结晶酶构象改变冷冻干燥脱水过程造成使用保护剂底物脱离溶剂束缚能力差疏水底物严重选择溶剂过渡态不稳定化过渡态暴露于溶剂选择溶剂构象柔性降低无水溶剂尤为严重使水活度最适化；水合溶剂亚最适pH值降低99%酶活从酶最适pH脱水；使用有机相缓冲液酶在有机溶剂中活力低的原因非水介质中酶活力比水相低几个数量级82第五节

有机介质中酶催化的应用第五节

有机介质中酶催化的应用83

酶催化反应应用脂肪酶肽合成青霉素G前体肽合成酯合成醇与有机酸合成酯类聚合二酯的选择性聚合蛋白酶肽合成合成多肽酰基化糖类的酰基化羟基化酶氧化甾体转化过氧化物酶聚合酚类、胺类聚合多酚氧化酶氧化芳香化合物羟基化胆固醇氧化酶氧化胆固醇测定醇脱氢酶酯化有机硅醇的酯化酶非水相催化应用酶催化反应应用脂肪酶84一、手性药物的拆分手性化合物指化学组成相同而立体结构互为对映体的两种异构化合物；手性药物指只含单一对映体的药物；已经发现很多手性药物的对映体具有不同的药理作用。过去手性药物多较是以消旋体形式出售。1961年欧洲出现了孕妇服用多消旋体的“反应停”后，产生多起畸形胎事件。1992年美国食品与药物管理局（FDA）明确要求含手性因素的化学药物，必须说明其二个对映体在体内的不同生理活性，药理作用和药物代谢动力学情况。1994年以来，手性药物世界销售额以年20％以上的速度增长。目前，世界上批准上市约61种。一、手性药物的拆分手性化合物指化学组成相同而立体结构互为对映85化学药物分类化学药物分类86手性药物两种对映体的药理作用药物名称有效对映体作用另一种对映体作用普萘洛尔S构型，治疗心脏病，-受体阻断剂R构型，钠通道阻滞剂青霉素胺S构型，消炎、解热、镇痛R构型，突变剂反应停S构型，镇静剂R构型，致畸胎手性药物两种对映体的药理作用药物名称有效对映体作871、手性药物两种对映体的药效差异（1）一种有疗效，另一种很弱；（2）一种有效，另一种有不良反应；（3）两种相反；（4）两种各有不同药效；（5）两种消旋体作用具互补性分5种类型：1、手性药物两种对映体的药效差异（1）一种有疗效，另一种很弱882、酶在手性化合物拆分方面的应用酶催化在单一对映体手性药物的开发中潜力颇大。

1、β－阻断剂类手性药物2、非甾体抗炎剂类手性药物

3、5－羟色胺拮抗物和摄取抑制剂类手性药物脂肪酶在拆分中起重要作用。其他种类酶（如酯酶、过氧化物酶、醇脱氢酶等）也能进行拆分反应，但因这些酶不易获得，价格昂贵或需要辅酶而较少研究。back2、酶在手性化合物拆分方面的应用酶催化在单一对映体手性药物的892、温度低，酶的立体选择性高。1、不同酶具不同结构和特性，同一种酶由于来源、处理法不同特性亦有差别；酶分子处在反胶束内，稳定性好；可通过调节缓冲液pH和离子强度的方法调节有机介质中酶催化的pH值和离子强度；现象：脂肪酶催化三丁酸甘油与正庚醇的转酯反应，酶的反应速度与其冷冻干燥前水溶液的的PH密切相关，反应的最适PH接近于水溶液中的最适PH二是有机溶剂和能扩散的底物或反应产物相互作用影响正常反应的进行;①有机溶剂极性小，疏水性强，疏水性底物难于进入必需水层；意义：可在不需基团保护下合成氨基醇脂；催化青霉素前体等多肽的合成特性：酶在其中有良好的稳定性、区域选择性、立体选择性、键选择性。酶在有机介质中的最适PH值通常与在水溶液中催化的最适pH相同或接近；Klibanov称之为“溶剂工程”，是蛋白质工程辅助方法，即不改变蛋白质本身，改变介质来改变酶特性。液体燃料的不足已严重威胁到我国的能源与经济安全；（4）两种各有不同药效；与常用的有机溶剂相比，超临界流体特别是SCCO２、SCH2O还是一种环境友好的溶剂。2<lgP<4，酶活力中等。②N-乙酰-L-苯丙氨酸乙酯1、不同酶具不同结构和特性，同一种酶由于来源、处理法不同特性亦有差别；手性药物指只含单一对映体的药物；二、手性高分子聚合物的制备随着具有光、电、磁性聚合物的发现，旋光性聚合物正受青睐。旋光性聚合物广泛存在于自然界中，多由蛋白质、核酸、多糖等构成。利用酶催化获得高的立体选择性，化学催化提供高产率，特性合成手性聚合物是一条很有应用潜力的新途径。旋光性聚合物与具有相应结构的非旋光聚合物相比，在分子识别和组装上具明显区别，在熔点、溶解性、结晶特性上有较大差异，在光、电、磁上也有差异。利用水解酶可合成多种手性聚合物；2、温度低，酶的立体选择性高。二、手性高分子聚合物的制备随着90酶催化合成可生物降解高分子可生物降解高分子是指在一定条件下能被生物体侵蚀或代谢而降解的材料，应用广泛：领域应用领域应用医疗外科手术缝合线；伤口涂料；人造血管；药物释放体系；骨骼替代品工业无污染可生物降解包装材料；除锈剂、抗真菌载体农业农用地膜；肥料、杀虫剂除草剂释放体系酶催化合成可生物降解高分子可生物降解高分子是指在一定条件下能91糖和类固醇的选择性酰化糖酯作为一种生物功能分子和化工原料具有重要价值。1991年Planehon发现一些糖酯衍生物具有抗肿瘤作用。对糖的多羟基位置选择性酯化是有机合成化学中的难题，利用生物催化剂的高度选择性易于解决。1986年Klibanov小组首先开展了有机相中酶结合成糖酯的研究。利用糖的特殊的分子结构合成糖基聚酯或高交联度的聚酯是研究热点之一酰基对于糖酯的合成至关重要。聚糖酯类可生物降解高分子的酶促合成糖和类固醇的选择性酰化糖酯作为一种生物功能分子和化工原料具有92酶法合成改性天然多糖的主要途径大多是在聚酯链上引入糖基，以增强聚合物的生物可降解性能。如果用化学方法聚合，需要将有些羟基保护起来，避免副反应，聚合后，再脱保护，反应过程复杂，还有异构体产生，酶法聚合则不必保护基团，反应条件温和。back酶法合成改性天然多糖的主要途径大多是在聚酯链上引入糖基，以增93三、酚树脂的合成辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）能以H2O2为电子受体，专一催化酚及苯胺类物质的过氧化反应；酚树脂通常是在甲醛存在下缩合酚类物质而获得的。辣根过氧化物酶（HRP）催化产生的酚类聚合物无甲醛污染。HRP可催化酚类物质与天然的树脂材料木质素混聚形成酚树脂。始阶段，酶催化酚类物氧化成酚氧自由基；然后是自由基聚合阶段；单体自由基与二体自由基发生传递，使聚合物链增长——辣根过氧化物酶催化酚类物质的合成1三、酚树脂的合成辣根过氧化物酶（horseradishp94四、导电有机聚合物的合成1977美国，Macdiarmid打破聚合物系绝缘体观念，获得碘掺杂的聚乙炔；酶法合成的聚酚胺类物质具有π电子共轭结构，通过掺杂表现出一定的导电性。有机酶合成用于研制有机导电聚合物，如聚苯胺，抗雷电袭击、抗静电、抗磁干扰、雷达微波吸收。HRP在催化合成聚合物方面是一种应用较多，潜力较大的酶，HRP能够以过氧化氢为电子受体，专一地催化酚及苯胺类物质的过氧化反应。——辣根过氧化物酶催化酚及芳香胺类物质的聚合2四、导电有机聚合物的合成1977美国，Macdiarmid打95五、发光有机聚合物的合成非线性光学材料是激光技术的重要物质基础，在激光倍频、混频、参量放大与振荡、集成光学、光信息处理与光信号控制、光电子计算机等方面有重要应用；有机非线性光学材料其倍频效应较无机材料高几百上千倍；前者光学效应缘于非定域电子体系，激发响应时间较无机材料快1000倍；非线性光学材料：酶法合成的聚酚类物具有较高的三阶非线性光学系数X（3）非定域电子共轭聚合物：HRP催化聚合的产物可以产生一些发光较好的聚全物，有可能在发光二极管方面有所应用。——辣根过氧化物酶催化酚及芳香胺类物质的聚合3back五、发光有机聚合物的合成非线性光学材料是激光技术的重要物质基96六、食品添加剂的生产1、利用脂肪酶或酯酶催化生成酯类；2、利用嗜热菌蛋白酶生产天苯肽；3、利用芳香醛脱氢酶生产香兰素；back六、食品添加剂的生产1、利用脂肪酶或酯酶催化生成酯类；bac97生成酯类利用脂肪酶将甘油三酯水解成单酯，是食品乳化剂。back生成酯类利用脂肪酶将甘油三酯水解成单酯，是食品乳化剂。bac98天苯肽天苯肽是二肽甲酯，是食品甜味剂，甜度是蔗糖的150~200倍；通过嗜热菌蛋白酶在有机介质中合成back天苯肽天苯肽是二肽甲酯，是食品甜味剂，甜度是蔗糖的150~299七、生物柴油的生产石油短缺；传统能源的日益枯竭需要开发可再生能源；环境保护与汽车工业的发展需要清洁油料；液体燃料的不足已严重威胁到我国的能源与经济安全；生物柴油是动物、植物或微生物油脂与小分子醇类经酯交换反应而得的脂肪酸酯类物可代替柴油；生物柴油可生物降解，无毒性，对环境无害，并可以从可再生资源中提取。意义七、生物柴油的生产石油短缺；意义100生物柴油的优点主要有：

1.可使用于任何柴油引擎；

2.在所有替代燃油中，生物柴油的英热量单位最高(在1号柴油和2号柴油之间)；

3.生物柴油的燃点是柴油的两倍，因此使用、处理、运输和储藏都极其安全；

4.在所有的燃油中，生物柴油的能量衡算最高。在生产生物柴油的过程中，每消耗一个单位的矿物能量就能获得3.2个单位的能量；

5．在各种替代燃油中，只有生物柴油全部达到美国“清洁空气法”所规定的健康影响检测的要求。检测表明，使用生物柴油可降低90%的空气毒性。美国加利福尼亚一个大学所作的研究表明，与使用柴油相比，使用生物柴油可降低94%的患癌率。

生物柴油的优点主要有：

1.可使用于任何柴油引擎；

101生物柴油制造方法(续)用动物和植物油脂和甲醇或乙醇等低碳醇在酸碱下高温（230～250℃）催化转酯反应,生成相应的脂肪酸甲酯或乙酯，在经洗涤干燥即得生物柴油,生产设备与一般制油设备相同,后处理复杂，废酸碱二次污染；化学法生物柴油制造方法(续)用动物和植物油脂和甲醇或乙醇等低碳醇在102生物柴油制造方法生物柴油制造方法103八、多肽的合成（1）-胰蛋白酶催化N-乙酰色氨酸与亮氨酸合成肽的反应，在水溶液中合成率在0.1%以下，而在乙酸乙酯和微水组成的两相系统中，合成率可达100%。（2）嗜热菌蛋白酶有机介质中催化L-天冬氨酸与D-丙氨酸缩合成天丙二肽（3）脂肪酶催化青霉素前体等多肽的合成八、多肽的合成（1）-胰蛋白酶104九、甾体转化甾体在水中溶解度低，反应受限制；在有机相与水两相中大提高转化率；如：可的松转化为氢化可的松的酶促反应，在水-乙酸丁酯或水-乙酸乙酯组成的系统中，转化率达100%和90%。back九、甾体转化甾体在水中溶解度低，反应受限制；back105观念的改变有关酶的催化理论是基于酶在水溶液中的催化反应建立起来的。近年来，进行了非水介质的酶结构与功能、酶作用机制、酶作用动力学的研究，建立起非水酶学（non-aqueousenzymology)。观念的改变有关酶的催化理论是基于酶在水溶液中的催化反应建立起1065、反相胶束体系反相胶束:在与水不互溶的在量有机溶剂中,加入表面活性剂后形成的油包水的微小水滴；1997年首次报道酶在反相胶束中具有活性(已发现40多种酶)；酶分子处在反胶束内，稳定性好；反胶束与生物膜有相似之处，适于研究生物膜表面酶的结构、催化特性、动力学特性。水相有机相酶5、反相胶束体系反相胶束:在与水不互溶的在量有机溶剂中,加107不同类型的酶在反相胶束中的排布模型不同类型的酶在反相胶束中的排布模型108五、热力学稳定性有机溶剂中酶的热稳定性和储存稳定性都比水溶液中高；有机溶剂中酶的热稳定性还与介质中水含量有关；原因：可能是有机介质中缺少引起酶变性的水分子；Klibanov和Volkin认为：由于有机溶剂中缺少使酶热失活的水分子，由水引起的蛋白质热失活的全过程难以进行。五、热力学稳定性有机溶剂中酶的热稳定性和储存稳定性都比水溶109二、酶的选择1、不同酶具不同结构和特性，同一种酶由于来源、处理法不同特性亦有差别；2、酶反应速度与酶浓度成正比；3、另注意酶的稳定性、底物专一性,对映体选择性、区域选择性、键选择性等二、酶的选择1、不同酶具不同结构和特性，同一种酶由于来源、处1101、手性药物两种对映体的药效差异（1）一种有疗效，另一种很弱；（2）一种有效，另一种有不良反应；（3）两种相反；（4）两种各有不同药效；（5）两种消旋体作用具互补性分5种类型：1、手性药物两种对映体的药效差异（1）一种有疗效，另一种很弱1112、酶在手性化合物拆分方面的应用酶催化在单一对映体手性药物的开发中潜力颇大。

1、β－阻断剂类手性药物2、非甾体抗炎剂类手性药物

3、5－羟色胺拮抗物和摄取抑制剂类手性药物脂肪酶在拆分中起重要作用。其他种类酶（如酯酶、过氧化物酶、醇脱氢酶等）也能进行拆分反应，但因这些酶不易获得，价格昂贵或需要辅酶而较少研究。back2、酶在手性化合物拆分方面的应用酶催化在单一对映体手性药物的112酶催化合成可生物降解高分子可生物降解高分子是指在一定条件下能被生物体侵蚀或代谢而降解的材料，应用广泛：领域应用领域应用医疗外科手术缝合线；伤口涂料；人造血管；药物释放体系；骨骼替代品工业无污染可生物降解包装材料；除锈剂、抗真菌载体农业农用地膜；肥料、杀虫剂除草剂释放体系酶催化合成可生物降解高分子可生物降解高分子是指在一定条件下能113观念的改变有关酶的催化理论是基于酶在水溶液中的催化反应建立起来的。近年来，进行了非水介质的酶结构与功能、酶作用机制、酶作用动力学的研究，建立起非水酶学（non-aqueousenzymology)。观念的改变有关酶的催化理论是基于酶在水溶液中的催化反应建立起114观念的改变新酶促反应体系的发现,拓宽了酶催化反应的应用范围,使酶法合成逐步发展成为与化学法合成相互补充的合成方法;Margolin等研究了在无水吡啶中以枯草杆菌蛋白酶为催化剂的选择性酰化反应该反应可以得到1位选择性酰化产物;传统的化学法是无法区分这些二级羟基的,显示了酶法合成的优越性.观念的改变新酶促反应体系的发现,拓宽了酶催化反应的应用范围,115非水溶剂（有机介质）中酶催化的研究20世纪初，Bourquelot等人，将微量乙醇、丙酮类有机溶剂加到酶的水溶液中，酶有活性，但比水溶液中低得多1966年以来，Dostoli和Siegel分别报道胰凝乳蛋白酶和辣根过氧化物酶在几种非极性有机溶剂中具有催化活力1975-1983年，Buckland和Martinek等探讨了微生物细胞、游离酶和固定化酶在有机溶剂中合成脂和类固醇及缁醇转化1984年Klibanov在《Science》上发表关于酶在有机介质中催化条件和特点的综述，标志着该领域的研究取得突破性进展非水溶剂（有机介质）中酶催化的研究20世纪初，Bourque116酶在有机介质中的催化的确立1984年美国KlibanovA.M.在Science上发表了一篇关于酶在有机介质中催化条件和特点的综述，在仅含微量水的有机介质中成功酶促合成了酯、肽、手性醇等许多有机化合物。KlibanovA.M.结论：只要条件合适，酶可在非生物体系的疏水介质中催化天然或非天然的疏水性底物和产物的转化，酶可在水与有机剂互溶体系、水与有机剂量组成的双液相体系、仅含微量水或几乎无水的有机剂中表现出催化活性。酶在有机介质中的催化的确立1984年美国KlibanovA117为什么酶在有机溶剂中表现出催化活性？通过酶在水相和有机相中的结构比较，证实了在有机相中酶能够保持其整体结构的完整性，至少是酶活性部位与水溶液中的结构是相同的。不同介质中酶活性中心的完整性相差不大，但酶活力却相差4个数量级。因此认为酶分子结构的动态变化很可能是主要因素.北口博司认为酶分子的“紧密”和“开启”两种状态处于一种可动平衡中，表现出一定柔性。有机溶剂中酶分子和水合作用、蛋白质柔性和酶活力之间和关系比过去的认识要复杂得多。酶结合水酶水或有机剂为什么酶在有机溶剂中表现出催化活性？通过酶在水相和有机相中的118第一节酶非水相催化的研究概况受非水介质的影响，其催化特性与在水相中不同酶的非水相催化类型主要包括:一、有机介质的酶催化；二、气相介质的酶催化；三、超临界流体介质中的酶催化；四、离子液介质中的酶催化go第一节酶非水相催化的研究概况受非水介质的影响，其催化特性与119有机介质的酶催化指酶在含有一定水的有机溶剂中进行催化反应;适用范围:底物或产物或其一为疏水性物质的酶催化作用;原因:酶在有机相中能保持结构的完整;特性:酶的底物特异性、立体选择性、区域选择性、键选择性、热稳定性等有所改变；应用：多肽、酯类、甾体转化、功能高分子合成、手性药物拆分的研究。有机介质的酶催化指酶在含有一定水的有机溶剂中进行催化反应;120如多酚氧化酶催化酚类物质的氧化反应：水果、蔬菜的褐变就是由于果蔬类中含酚类物质和多酚氧化酶，破损时与氧气接触，发生上述反应而变为褐色。因此，在水相中无法得到邻醌类化合物或邻酚类物质；但在氯仿中酶催化反应生成的邻醌类化合物不易发生聚合，从而可得到邻醌类化合物。因此研究非水相酶催化反应很有必要。如多酚氧化酶催化酚类物质的氧化反应：水果、蔬菜的褐变就是由于121气相介质的酶催化指酶在气相介质中进行催化反应；适用范围：底物是气体或能转化为气体的物质；特性：气体介质密度低，扩散容易；与在水相中明显不同；气相介质的酶催化指酶在气相介质中进行催化反应；122有优于液相反应的优点：某些酶在液相中使用受到一定的限制，如酶和辅酶的操作不稳定性，底物及产物的不溶性和酶的活性被产物抑制等，而气相中的反应就可以克服这些缺点，而且气相中的酶促反应更利于易挥发性产品的生产；Hwang等研究了固定化醇氧化酶在气相中的催化反应生物酶用于气相催化不适用于糖氨基酸等不易挥发的底物但它将来可用于某些易挥发产品的工业生产以及有害气体的分析和处理Back有优于液相反应的优点：某些酶在液相中使用受到一定的限制，如酶123超临界流体介质中的酶催化酶在超临界流体中进行催化反应；超临界流体指温度和压力超过临界点的流体；supercritical状态，简称SC状态；

由于黏度、介电常数、扩散系数和溶解能力都与密度有关，因此可以方便地通过调节压力来控制超临界流体的物理化学性质。与常用的有机溶剂相比，超临界流体特别是SCCO２、SCH2O还是一种环境友好的溶剂。要求：超临界流体对酶结构无破坏；具良好化学稳定性；温度不可太高太低；压力不可太高；易获得等。常用的超临界流体有：CO2,SO2C2H4,C2H6C3H8C4H10

等。超临界流体介质中的酶催化酶在超临界流体中进行催化反应；124指酶在离子液中进行催化作用；酶在有机溶剂中活力低的原因在有机介质中酶所处的pH环境与酶在冻干或吸附到载体上之前所使用的缓冲液pH值相同，称为pH-imprinting;适用范围：底物是气体或能转化为气体的物质；①有机溶剂极性小，疏水性强，疏水性底物难于进入必需水层；1、不同酶具不同结构和特性，同一种酶由于来源、处理法不同特性亦有差别；生物柴油的燃点是柴油的两倍，因此使用、处理、运输和储藏都极其安全；意义:酶催化酯合成可合成手性化合物,且酶的立体选择性主要是选择立体异构的醇.如果用化学方法聚合，需要将有些羟基保护起来，避免副反应，聚合后，再脱保护，反应过程复杂，还有异构体产生，酶法聚合则不必保护基团，反应条件温和。酶分子处在反胶束内，稳定性好；1、不同酶具不同结构和特性，同一种酶由于来源、处理法不同特性亦有差别；3、另注意酶的稳定性、底物专一性,对映体选择性、区域选择性、键选择性等例：Rubion报道P.有机相的固定化载体与方法的选择与在水相中的不同，最重要的是要满足酶在有机相反应中的微观环境，有利于酶的分散和稳定；因此在非水相酶反应体系中存在着最佳含水量,该最佳含水量不仅取决于酶的种类也与所选用的有机溶剂有关.20世纪初，Bourquelot等人，将微量乙醇、丙酮类有机溶剂加到酶的水溶液中，酶有活性，但比水溶液中低得多液体燃料的不足已严重威胁到我国的能源与经济安全；例4：蛋白质工程和抗体酶技术有机溶剂中酶含水量>最适水量，酶构象过于“柔性”，因变构而失活；有机溶剂中酶含水量<最适水量，酶构象过于“刚性”而失活；优点：1)与水相比较，脂溶性反应物和产物可溶于超临界CO２中，而酶作为蛋白质不溶解，有利于三者的分离；2)产品回收时，不需要处理大量的稀水溶液，可解决环境污染问题；3)与有机溶剂体系相比，CO２无毒，不燃烧、廉价、无有机溶剂残留之虞；4)CO２超临界体系具有气体的高扩散系数、低粘度