蛋白质的结构2课件

（五）鉴定1．纯度鉴定基本手段：电泳分析，超离心法：单条带。N端测定：n亚基蛋白有n个N端aa。选用手段：沉降分析、溶解度分析、结晶分析（能结晶的一般比较纯，具有活性）还有恒溶度法分析化学组成法测定最低分子量SDS法凝胶过滤法渗透压法扩散系数法沉降系数法和沉降平衡法2蛋白质的分子量大小测定如肌红蛋白含0.335%的铁，Fe分子量55.8最小M＝×100＝×100＝16700Fe分子量Fe(%)55.80.3351）根据分子组成测定最低分子量血红蛋白含0.335%的铁，Fe分子量55.8血红蛋白的实际分子量是66800（＝16700×4）SDS（十二烷基硫酸钠）－－－sodiumdodecylsulfate使用去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）和还原剂（通常为巯基乙醇）的样品处理液对蛋白质样品进行处理（一般煮沸3～5分钟），通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也将解离为单亚基。同时还原剂可以切断蛋白质中的任何一个二硫键（使二硫键还原）。经过这样处理的样品中的肽链都是处于无二硫键连接的，分离的状态。SDS是一种阴离子去污剂，带有很多负电荷。与蛋白质结合以后，使蛋白质分子带有足够的负电荷，远远超过了蛋白质分子原有的电荷，蛋白质分子原有的电荷就变得无足轻重了。SDS是一种变性剂，与蛋白质结合，改变了蛋白质单体分子的形状，均变成长椭圆棒状。所以在电场上移动的速度完全取决于蛋白质分子的大小。3）沉降分析法沉降速度：指离心时，蛋白质分子在单位时间内下沉的距离。沉降常数（沉降系数）：当沉降界面以恒速移动时，单位离心场中的沉降速度。S：沉降常数v：沉降速度（cm/sec）w：离心机转头的角速度（弧度/sec）x：蛋白质界面中点离旋转中心的距离，以cm计。沉降系数:把10-13秒作为一个单位，称为斯维得贝格单位，或沉降系数单位，用S（大写）表示。瑞典的蛋白质化学家T.Svedberg1S=10-133．等电点的测定

4．生物活性的测定不同的蛋白质有不同的生物功能，也就有不同的生物活性测定的方法。（六）含量测定总蛋白含量分析：凯氏定氮法、Folin-酚法（Lowry法）、双缩脲法、考马斯亮蓝法、紫外吸收法。特定蛋白组分的含量分析：酶和激素等：酶活性或激素活性表示其它蛋白：抗原抗体反应(westernblot)说明双向电泳分离蛋白质的技术原理及其在蛋白质组学研究中的重要意义西北大学05年双向电泳（two-dimensionalelectrophoresis）

如果将等电聚焦电泳与SDS结合起来，就是分辨率更高的一种双向电泳了。双向电泳后的凝胶经染色，蛋白呈现二维分布图，水平方向反映出蛋白在pI上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等电点相同而分子量不同的蛋白质分开。

某种溶液中含有三种三肽：Tyr-Arg-Ser,Glu-Met-Phe和Asp-Pro-Lys,α-COOH基团的pKa为3.8;α-NH3基团的pKa为8.5。在哪种pH（2.0,6.0或13.0）下，通过电泳分离这三种多肽的效果最好？合成的多肽多聚谷氨酸（（Glu）n），当处在pH3.0以下时，在水溶液中形成α螺旋，而在pH5.0以上时却为伸展的形态。

a）试解释该现象。

b）在哪种pH条件下多聚赖氨酸（Lys）会形成α-螺旋？答：（a）Glu侧链的pKa约为4.1，当pH值远远低于4.1（大约3左右）时，几乎所有的多聚谷氨酸侧链为不带电荷的状态，多肽链能够形成α-螺旋。在pH值为5或更高时，几乎所有的侧链都带负电荷，邻近电荷之间的静电排斥力阻止螺旋的形成，因此使同聚物呈现出一种伸展的构象。

（b）Lys侧链的pK为10.5，当pH值远远高于10.5时，多聚赖氨酸大多数侧链为不带电荷的状态，该多肽可能形成一种α-螺旋构象，在较低的pH值时带有许多正电荷的分子可能会呈现出一种伸展的构象。氨基酸的定量分析表明牛血清白蛋白含有0.58％的色氨酸（色氨酸的分子量为204）。

（a）试计算牛血清白蛋白的最小分子量（假设每个蛋白分子只含有一个色氨酸残基）。

（b）凝胶过滤测得的牛血清白蛋白的分子量为70，000，试问血清白蛋白分子含有几个色氨酸残基？5、蛋白质变性是由于（）

A、一级结构改变

B、空间构象破坏

C、辅基脱落

D、蛋白质水解6、必需氨基酸是对（）而言的。

A、植物

B、动物

C、动物和植物

D、人和动物7、在下列所有氨基酸溶液中，不引起偏振光旋转的氨基酸是（）

A、丙氨酸

B、亮氨酸

C、甘氨酸

D、丝氨酸8、天然蛋白质中含有的20种氨基酸的结构（）

A、全部是L－型

B、全部是D型

C、部分是L－型，部分是D－型

D、除甘氨酸外都是L－型

9、在生理pH情况下，下列氨基酸中哪个带净负电荷？（）

A、Pro

B、Lys

C、His

D、Glu10、天然蛋白质中不存在的氨基酸是（）

A、半胱氨酸

B、瓜氨酸

C、丝氨酸

D、蛋氨酸11、破坏α－螺旋结构的氨基酸残基之一是：（）

A、亮氨酸

B、丙氨酸

C、脯氨酸

D、谷氨酸12、当蛋白质处于等电点时，可使蛋白质分子的（）

A、稳定性增加

B、表面净电荷不变

C、表面净电荷增加

D、溶解度最小13、蛋白质分子中-S-S-断裂的方法是（）

A、加尿素

B、透析法

C、加过甲酸

D、加重金属盐8、镰刀型红细胞贫血病是一种先天性遗传病，其病因是由于血红蛋白的代谢发生障碍。（）

9、在蛋白质和多肽中，只有一种连接氨基酸残基的共价键，即肽键。（）

10、从热力学上讲蛋白质分子最稳定的构象是自由能最低时的构象。（）

11、天然氨基酸都有一个不对称α-碳原子。（）

12、变性后的蛋白质其分子量也发生改变。（）

13、蛋白质在等电点时净电荷为零，溶解度最小。（）

1、试比较较Gly、Pro与其它常见氨基酸结构的异同，它们对多肽链二级结构的形成有何影响？

2、为什么说蛋白质水溶液是一种稳定的亲水胶体？

3、试举例说明蛋白质结构与功能的关系（包括一级结构、高级结构与功能的关系）。

4、聚赖氨酸（polyLys）在pH7时呈无规则线团，在pH10时则呈α-螺旋；聚谷氨酸（polyGlu）在pH7时呈无规则线团，在pH3时则呈α-螺旋，为什么？

5、已知某蛋