新型冠状病毒标本采集和实验室检测技术

新型冠状病毒标本采集和实验室检测技术（第五版）指导本市各级各类医疗机构、各区疾病预防控制中心开展新型冠状病毒肺炎病例的标本采集和核酸检测，特制定本技术指南。本指南不包括新型冠状病毒分离和血清学等检测。一、标本采集（一）采集对象新型冠状病毒肺炎疑似病例和聚集性病例，需要进行新型冠状病毒感染诊断或鉴别诊断者，或其他需要进一步筛查检测的环境或生物材料。（二）标本采集要求1.从事新型冠状病毒检测标本采集的技术人员应经过生物安全培训（培训合格）和具备相应的实验技能。在标本采集过程中，采样人员的个人防护装备要求：N95及以上防护口罩、护目镜、连体防护服、双层乳胶手套、防水鞋套；如果接触了患者血液、体液、分泌物或排泄物，应及时更换外层乳胶手套。2.住院病例的标本由所在医疗机构负责采集。3.出现症状的密切接触者标本由其就诊的医疗机构负责采集。4.根据实验室检测工作的需要，可结合病程及研究需求多次采样。（三）标本采集种类每个病例必须采集急性期呼吸道标本，同时采集上、下呼吸道标本；应优先采集下呼吸道标本（如支气管或肺泡灌洗液，肺组织活检标本等），可根据临床表现与采集样本的时间间隔决定采集；重症病例优先采集下呼吸道标本（如支气管或肺泡灌洗液等）；出现眼部症状的病例，需采集眼结膜拭子标本；出现腹泻症状的病例，需留取粪便标本；采集发病初期第一份血清和血浆（最好在发病后7天内）和发病后第3～4周第二份血清和血浆。死亡病例依据《传染病病人或疑似传染病病人尸体解剖查验规定》（中华人民共和国卫健委第43号令）中的相关规定采集尸体标本，没有条件进行尸体解剖的，可采集呼吸道灌洗液或经皮穿刺采集肺组织标本。其他研究材料依据设计需求采集。标本种类：1.上呼吸道标本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液。2.下呼吸道标本：包括深咳痰液、呼吸道吸取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、肺组织活检标本。3.血清和血浆标本：每一病例都应尽量采集急性期、恢复期的非抗凝血和抗凝血，分离血清和血浆。第一份非抗凝血和抗凝血应尽早（最好在发病后7天内）采集，第二份非抗凝血和抗凝血应在发病后第3～4周采集。采集量要求5ml，建议使用真空采血管，抗凝血使用含有EDTA抗凝剂的真空采血管。血清标本不进行核酸检测。4.眼结膜标本：出现眼部感染症状的病例需采集眼结膜拭子标本。5.粪便标本：出现腹泻症状的患者需采集粪便标本约10克，如果不便于留取便标本，可采集肛拭子。（四）标本采集方法1.咽拭子：用两根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，稍用力来回擦拭至少各3次，将拭子头浸入含3ml病毒采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。2.鼻拭子：将一根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。取另一根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法采集另一侧鼻孔。上述两根拭子浸入同一含3ml病毒采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。3.鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液或从气管抽取呼吸道分泌物。将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出，收集抽取的粘液，并用3ml采样液冲洗收集器1次（亦可用小儿导尿管接在50ml注射器上来替代收集器）。4.深咳痰液：要求病人深咳后，将咳出的痰液收集于含3ml采样液的50ml螺口塑料管中。如果痰液未收集于采样液中，可在检测前，加入2-3ml的病毒采样液，或加入痰液等体积的痰消化液。也可以用痰液体积的含1g/L蛋白酶K的磷酸盐缓冲液将痰液液化。痰消化液储存液配方：二硫苏糖醇0.1g，氯化钠0.78g，氯化磷0.02g，磷酸二氢钠0.112g，磷酸二氢钾0.02g，水7.5ml，调节pH7.4±0.2，室温储存。临用前将储存液以去离子水稀释至100ml。5.支气管灌洗液：将收集器头部从鼻孔或气管插口处插入气管（约30cm深处），注入5ml生理盐水，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的粘液，并用采样液冲洗收集器1次（亦可用小儿导尿管接在50ml注射器上来替代收集）。6.肺泡灌洗液：局部麻醉后将纤维支气管镜通过口或鼻经过咽部插入右肺中叶或左肺舌段的支管，将其顶端契入支气管分支开口，经气管活检孔缓缓加入灭菌生理盐水，每次30～50ml，总量100～250ml，不应超过300ml。7．眼结膜标本：眼结膜表面用拭子轻轻擦拭后，将拭子头插入采样管中，尾部弃去，旋紧管盖。8．粪便或肛拭子标本：如患者发病早期出现腹泻症状，则留取粪便标本约10g，或采集肛拭子到3ml病毒保存液中。粪便标本可用病毒保存液稀释混匀后，10000rpm在4℃条件下离心5min，吸取上清液备用。9.血清和血浆标本：血清用真空负压采血管采集血液标本5ml，室温静置30分钟，1500～2000rpm离心10分钟，收集血清于无菌螺口塑料管中。血浆用含有EDTA抗凝剂的真空采血管采集血液标本5ml，室温静置30分钟，1500～2000rpm离心10分钟，分别收集血清和血球于无菌螺口塑料管10.其他材料：依据设计需求规范采集。（五）标本分装和包装标本采集后在生物安全二级实验室生物安全柜内分装成二份。除本单位检测用标本外，一份上送市疾病预防控制中心（XX市传染病检测样本采集送验单），一份留待送中国疾病预防控制中心病毒预防控制所复核检测。1.标本分装：所有标本应放在大小合适的耐冷冻、有垫圈的外螺旋盖的样本采集管里，拧紧。容器外注明样本编号、种类、姓名及采样日期。2.标本包装：采集的病例标本按照A类感染性物质进行包装和运送。病毒培养物采用A类，对应的联合国编号为UN2814包装运送。环境标本属于B类，对应的联合国编号为UN3373。（六）标本保存用于检测的标本应尽快进行检测，24小时内能检测的标本可置于4℃保存；24小时内无法检测的标本则应置于-70℃或以下保存（如无-70℃保存条件，则于-20℃冰箱暂存）。血清可在4℃存放3天，可在-20℃以下暂存。标本运送期间应避免反复冻融，并单独保存标本，避免反复冻融。（七）标本送检1.标本运送：样本采集后应尽快送往实验室，如不能及时送实验室必须在-4℃条件下暂存；运送时使用冰袋保持低温环境。样本接收时需要核对被检样本姓名、性别、年龄、编号、样本种类及检测项目等信息。同时一起提交《XX市新型冠状病毒肺炎检测样本采集送验单》（见附件）。2.运送安全：按照《病原微生物实验室生物安全管理办法》（国务院424号令）和《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》（中华人民共和国卫健委第45号令）等有关规定执行，办理《准运证》，专人运送。3.标本和毒株管理：新型冠状病毒标本及其毒株应有双人专人管理，准确记录来源、种类、数量，编号登记，采取有效措施确保安全，严防发生无用、恶意使用、被盗、被抢、丢失、泄露等事件。二、新型冠状病毒的实验室检测和结果判定新型冠状病毒检测必须在符合生物安全要求的实验室由经过相关技术安全培训的人员进行操作。常规检测方法是通过实时反转录PCR（realtimereversetranscriptionPCR，rRT-PCR）检测病毒核酸和定型，阳性标本进一步通过新型冠状病毒全基因测序鉴定。（一）标本检测病毒核酸的检测方法主要有新型冠状病毒基因组中开放读码框架1a/b（ORF1a/b）和核壳蛋白（nucleocapsid，N）。根据试剂盒说明书进行操作和检测。（二）结果判断按照检测试剂盒的说明书，根据检测结果CT值，判定目标核酸检测结果的阴阳性。在实验室要确认病例阳性，需满足以下条件中的一个：1.同一份标本中新型冠状病毒2个靶标（ORF1a/b、N）特异性rRT-PCR检测结果均为阳性；2.如果出现单个靶标阳性的检测结果，则需要重新采样，重新检测，如果仍为单靶标阳性，判定为阳性。3.两种标本rRT-PCR同时出现单靶标阳性，或同种类型标本两次采样检测中均出现单靶标阳性的检测结果，可判定为阳性。4.阴性结果也不能排除新型冠状病毒感染，需要排除可能产生假阴性的因素，包括：样本质量差，XX口咽等部位的呼吸道样本；样本收集的过早或过晚；没有正确的保存、运输和处理样本；技术本身存在的原因，如病毒变异、PCR抑制等。rRT-PCR检测结果阴性，但临床表现和流行病毒学特点提示是新型冠状病毒感染。三、实验室生物安全新型冠状病毒暂按照病原微生物危害程度分类中第二类病原微生物进行管理。从事新型冠状病毒检测的技术人员应经过生物安全培训，并取得相应资格和具备相应的实验技能，实验室开展风险评估后并符合生物安全要求后开展检测，根据实验活动采取相应的生物安全防护。具体要求如下。（一）核酸提取：未经培养的感染型材料的分装和核酸提取应做好个人三级生物安全防护、在生物安全二级实验室的生物安全柜内进行。（二）血清学检测：进行ELISA检测血清抗体时，要求在生物安全二级实验室内操作；采用微量中和试验进行血清抗体检测应在生物安全三级实验室操作。（三）病