副溶血性弧菌的快速检测技术课件

副溶血性弧菌及其检测食品工程2010.10.05基本特征副溶血性弧菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌，易呈多形态，有棒状、弧状、卵圆状、球状、丝状等，排列不规则，多数散在，偶而有成对排列，一般大小为0.3~0.7ｕm×1~2ｕm，单端一根鞭毛，有动力，运动活泼，两端浓染，在固体培养条件下能生长周鞭毛。基本特征革兰氏染色后电镜下副溶血性弧菌食物中毒副溶血性弧菌食物中毒也称嗜盐菌食物中毒，是进食含有该菌的食物所致，主要是海产品。临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。副溶血性弧菌食物中毒多发生在6~10月，海产品大量上市时，中毒食品主要是海产品，其次为咸菜、熟肉类、禽肉、禽蛋类，约有半数中毒者为食用了腌制品后。中毒原因主要是烹调时未烧熟煮透或熟制品被污染。发病机理

TDH对心脏有特异性心脏毒，可引起心房纤维性颤动、期前收缩或心肌损害。最近有人发现脲酶与本病腹泻有关。患者体质、免疫力不同，临床表现轻重不一，呈多型性。山区、内陆居民去沿海地区而感染者病情较重，临床表现典型；沿海地区发病者病情一般较轻。吞服10万个以上活菌即可发病，个别可呈败血症表现。耐热直接溶血毒素(TDH)、耐热相关溶血毒素(TRH)被认为是其重要的致病因素,分别由tdh、trh基因编码,能产生溶血性、肠毒素和细胞毒素等致病因子，可引致肠袢肿胀、充血和肠液潴留，引起腹泻。检测近年来，食物中毒的报道屡见不鲜，而其中很多都是致病菌引起的，随着人们对食品质量的关注，以及食品出口贸易的不断增大，对食品中致病菌的检测也越来越受到各国科学家的重视。国家食源性疾病监测网及国家食品安全信息监测系统统计数据显示:2002-2007年间暴发的细菌性食物中毒事件中,副溶血性弧菌位居病原菌之首。因此，副溶血性弧菌的检测越发重要。传统方法传统的副溶血性弧菌检测法主要分为增菌培养、分纯、镜检和生化试验等步骤。其主要流程见下图（参照GB/T4789-2008）。其优点是可以精确无误的对所含Vp进行检测，但其检测周期较长，该法的阳性检出周期至少需要72小时，且操作繁琐。检测

目前对V.p快速检测方法为PCR法，PCR法主要是根据V.p所携带的特异性基因片段，然后对其进行PCR扩增，随后通过一定手段检测扩增的基因片段来定量定性检测V.p。主要的方法有任意引物PCR、针对任意引物PCR、多重PCR、实时PCR。

检测快速检测方法

通过电泳分析发现，1996-1998年收集的22株血清型为03：K6菌株与1996年以前收集的03:K6血清型菌株基因序列有所不同，为03:K6血清型新出现的变异株，并最初出现在孟加拉国。这是目前最简单的以基因为基础的细菌亚分型方法。1、任意引物PCR2、针对任意引物PCR

Kim等选择toxR基因序列设计两对引物：5’一GTCTTCTGACGCAATCGTTG—3’5’一ATACGAGTGGTTGCTGTCATG一3’对14株V.p、14株其他弧菌进行PCR。结果显示，14株V.p都得到一条368bp的特异扩增亮带，而其他菌株没有特异扩增。此外，Venkateswaran等选择gyrB基因设计引物对V.p进行PCR、Cordova等选择pR72H基因设计引物进行PCR，特异性、灵敏度都很好。

由于不是全部副溶血性弧菌都含有tdh基因或trh基因，所以只针对tdh或trh的单一PCR，有时会漏检。多重PCR(multiplex-PCR)能全方位高效率地检测V.p。Bej白等针对tl、tdh、trh设计不同的引物对，在同一PCR反应体系内同时扩增tl、tdh、trh。3、多重PCR结果显示，所有的V.p都扩增出tl基因，tl基因是V.p特异的；54％的V.p扩增出tdh基因；只有38.73％的V.p扩增出trh基因;该法灵敏度高，能把10g牡蛎培养肉汤里10～100个V.p检测出来。与其他常规生化方法相比，多重PCR更快速，仅8h就能完成检测，结果更为准确、可靠，而且还可改进成定量竞争PCR，对标本中靶序列进行定量。3、多重PCR此法需要从反应体系中吸取产物做电泳或Southern杂交等试验进行鉴定，转移过程中易污染，造成假阳性，而且耗费时间。Tyagi开创了一种实时PCR。实时PCR是在PCR反应体系中加入标记有报告基团和淬灭基团的线性Taqman。4、实时PCR检测探针或茎环型荧光分子信标探针，在基因扩增过程中，与产物杂交，此时，报告基团和淬灭基团分开，根据能量共振转移现象，报告基团发出荧光而被检测。这种方法操作简单，闭管检测，减少污染，灵敏度高，并且可以在PCR结束或PCR过程进行同步定性或定量检测，面且可以进行临床大规模快速检测。4、实时PCR检测[1]张凡非.副溶血性弧菌及其引起的食物中毒研究进展.中国卫生监督杂志,2003,10(1):8-10.[2]中华人民共和国卫生部,中国国家标准化管理委员会.GB/T4789.7—2008.食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验.北京:中国标准出版社,2008.[3]刘秀梅,陈艳,王晓英,等.1992-2001年食源性疾病爆发资料分析-国家食源性疾病监测网.卫生研究,2004,33(6):725-727.[4]朱雪兰,陈艳.副溶血性弧菌溶血素基因及其检测的研究进展.国外医学卫生学分册,2007,34(4):233-237.[5]程苏云,张俊彦,王赞信,等.海水产品副溶血性弧菌污染定量检测分析.中国卫生检验杂志,2007,17(2):336-338.参考文献[6]LeeCY,PanickerG,BejAK.DetectionofpathogenicbacteriainshellfishusingmultiplexPCRfollowedbyCovalinkNHmicrowellPlatesandwichhybridezation.JMicmbiolMethoeds,2003,53(2):199-209.[7]KimYB,OkudaJ,MatsumotoC,etal.IdentificationofVibrioparahaemolyticusstrainsatthespecieslevelbyPCRtargetedtothetoxRgene.JClin.Microbiol,1999,37(4):1173-1177.[8]VenkateswaranK.DohmotoN,HarayamaS.CloningandnucleotidesequenceofthegyrBgeneofVibrioparahaemolyticusanditsa