体内药物方法

体内药物分析Biopharmaceuticalanalysis第一章体内药物分析概述一、体内药物分析的定义狭义：利用现代分析仪器和分离手段对人和动物血液、尿和组织等样品进行定性定量的分析广义：通过体内药物浓度的分析，了解药物在体内的数量和质量的变化，获得药代动力学参数，为药品的生产、临床应用作出评价二、体内药物分析的意义（一）在新药评价和开发中的意义1．全面质量控制2．新药报批3．为设计新药提供信息①从代谢产物中开发新药保泰松→羟基保泰松（作用强、副作用小）非那西丁→扑热息痛②前药设计③新剂型的研究，缓控释、经皮制剂等以上内容必须通过测定体内药物浓度得以解决（二）临床合理用药中的意义

1．血药浓度与药理作用2.影响血药浓度的因素（1）机体因素a．生理因素年龄、性别、生理状况b．病理因素c．遗传因素（2）药物因素a．剂型因素（生物利用度问题）b．药物合并使用（酶抑、酶促）c．时间因素（三）药物中毒解救的意义（四）兴奋剂检测的意义三、体内药物分析的对象3．从样品的来源分1．从分析物分母体药物代谢物内源性物质2．从生物样品种类分均匀样品非均匀样品人体实验动物四、体内药物分析的任务（一）方法学的研究（二）治疗药物监测TDM，therapeuticalDrugMonitoring1．定义2．哪些药物需进行体内血药浓度监测①有效血药浓度范围窄，稍高毒性大，稍低无疗效②剂量小，毒性大的药物③个体差异大，剂量难以控制④药物毒性反应与疾病症状相似⑤多种药物合并应用，有中毒危险⑥胃肠道、肝脏、肾脏疾病⑦呈非线性动力学的药物⑧判断患者用药的依从性（三）药代动力学的研究（四）代谢分型的应用（五）内源性物质测定

五、体体内药药物分分析的的特点点1．干干扰杂杂质多多2．样样品浓浓度低低3．取取样量量少4．工工作量量大5．时时间短短6．有有一定定设备备六、体体内药药物分分析的的发展展1．国国外发发展概概况60年年代初初发发现药药效与与血药药浓度度关系系70年年代体体内内药物物分析析方法法建立立80年年代~至今今发发展迅迅猛，，新仪仪器不不断涌涌现书籍出出版《DrugLevelMonitoring》》1980《TherapeuticalDrugMonitoring》》1981《TextbookofBiopharmaceuticAnalysis》19812．国国内情情况80年年代初初，药药物分分析工工作者者倡导导，1980年年版《《药物物分析析》教教材中中纳入入部分分内容容，第第二、、三版版增加加体内内药物物分析析一章章。80年代开始在医院进行临床药学工作，主要测定药物浓度。有关书籍吴如金《体体内药物分分析》人人卫版1984陆明廉《血血药浓度测测定与临床床应用》上上海科技1986陈刚《治疗疗药物监测测理论与实实践》人民民军医1988吴莱文《治治疗药物监监测》人人卫版1989曾经泽《生生物药物分分析》北北京大学出出版社1998姚彤炜《体体内药物分分析》浙浙大2001张君仁《体体内药物分分析》化化学学工业出版版社 20023．学科前前沿游离药物浓浓度测定直接进样方方法研究代谢物测定定对映体分析析第二章体体内药物物存在的状状态与体体内药物物分析的关关系一、药物的的体内变化化吸收→分布布→代谢→→排泄ADME过程发生两种变化化物理变化可可逆变变化化学变化结结构和数数量发生变化化二、药物与血血浆蛋白的结结合1．游离型药药物与结合型型药物（非特特异性的结合合）①在血浆、组组织中均存在在游离型和结结合型的药物物②尿液中含微微量P，血浆浆中含大量P，唾液中P为血浆1/10③与药物结结合的蛋白白主要有白蛋蛋白，a1-酸性糖蛋白白、脂蛋白弱酸性药物主主要与白蛋白白结合弱碱性药物与与白蛋白、a1-酸性糖蛋白白结合④药物与蛋白白质的结合通通过共价键（（氢键，离子子间静电力等等）2．血浆蛋白白结合率Df+PDbK=解解离常数血浆蛋白结合合率：Β==[P]·[Df]DbDbDb+Df11+K/np+Df/np结合力强的药药物可以置换换结合力弱的的药物，通过过竞争蛋白是是药物相互作作用类型之一一。由此可见，K、np是影影响β的重要要因素np↓ββ↓K↓ββ↑药物在足够高高浓度时使结结合部位饱和和，浓度再增增高，多余的的药物均呈游游离状态，结结合部分比率率降低，药物物血浆蛋白结结合率是药代代动力学的重重要参数之一一。3．血浆蛋白白结合的测定定平衡透析法、、超滤法、凝凝胶过滤法、、光谱法等。。（1）平衡透透析法①原理②计算β=××100%=Ct-C袋内-袋外袋内药物③注意事项a.蛋白质质溶液新新鲜血浆pH7.4，，至少三个浓浓度测定b.缓冲液液0.13mol/L磷酸盐缓冲冲液，因为Na3PO4抑制酸性性药物与蛋白白质结合c.温度与与平衡时间37℃16~48h注意防防腐剂加入，，药物的分解解d.透析袋袋渗漏检测3%三氯氯醋酸e.搅拌保保持动态态平衡④影响因素a.药药物物膜上上吸附附b.Donnan效应应由于电电荷的的影响响，可可造成成平衡衡时半半透膜膜两侧侧游离离药浓浓不同同，donnan效效应，，加入入中性性盐可可消除除。c.空空白白值增增加d.缓缓冲冲液体体积变变化，，水分分进入入血浆浆游游离药药浓↑此法用于测定药物时，耗费时间太长，一般少采用（2））超滤滤法原理计算注意事事项a．装装置50μμl→→5ml，，选择择不同同型号号超滤滤膜，，保湿湿。b．速速度与与时间间3000~10000r/min5~15minc．温温度37℃℃，25℃℃，4℃影响因因素a．膜膜吸附附b．超超滤液液的体体积超超滤液液/总总体积积≈0.3~0.6c．超超滤膜膜温度度三、药药物与与血浆浆蛋白白结合合对体体内药药物分分析的的影响响1．血血浆不不同对对体内内药物物分析析的影影响2．平平衡状状态不不同对对体内内药物物分析析的影影响3．平平衡状状态受受破坏坏对体体内药药物分分析的的影响响4．游游离与与结合合同时时出现现时对对体内内药物物分析析的影影响四、药药物代代谢1．研研究药药物代代谢的的意义义了解药药物在在体内内的命命运及及相互互作用用，保保证临临床用用药安安全有效效研究究药药物物代代谢谢途途径径、、药药物物结结构构与与药药理理作作用用关关系系，，寻寻找找新新药研究究药药物物相相互互作作用用机机制制有利利于于建建立立体体内内药药物物分分析析新新方方法法，，避避免免代代谢谢物物干干扰扰2．．药药物物代代谢谢的的途途径径第一一相相反反应应：：在在酶酶作作用用下下发发生生的的氧氧化化、、还还原原、、水水解解，，使使极极性性增增加加，，水水溶溶性性增增强强第二二相相反反应应：：药药物物或或经经一一相相反反应应后后的的代代谢谢物物与与葡葡萄萄糖糖醛醛酸酸、、硫硫酸酸盐盐结氧化化反反应应还原原反反应应水解解反反应应结合合反反应应a．．葡葡萄萄糖糖醛醛酸酸结结合合b．．硫硫酸酸酯酯化化c．．谷谷胱胱甘甘肽肽缀缀合合d．．乙乙酰酰化化结结合合e．．氨氨基基酸酸结结合合五、药物物代谢与与体内药药物分析析的关系系1．样品品的保存存样品可能能会分解解，如血血浆酯酶酶可使酯酯类药物物水解，，酶类可可使药物物继续代代谢，加加入酶抑抑制剂和和冷藏保保存。2．分析析方法选选择光光谱法色色谱谱法免免疫法法3．样品品的提取取、分离离法代谢物极极性大、、水溶性性强，pH缓冲冲系统分分开尿液中药药物多以以结合型型存在，，要进行行水解（（酸水解解、酶水水解，溶溶剂解））第三章生生物物样品的的预处理理一、生物物样品的的采集与与贮藏体内药物物分析常常用的分分析品种种有血液液、尿液液、唾液液，也可可用乳汁汁、泪液液、脑脊脊液、胆胆汁等。。（一）样样品的采采集1．血样样血样浓度度与作用用点的浓浓度密切切相关，，可以反反映靶器器官的浓浓度。血细胞血浆（plasma））血小板血清（serum）血细胞测定血样样中平均均分布于于细胞内内和细胞胞外的药药浓抗凝自然全血血液2．尿样样目的：药药物剂量量回收，，药物清清除，药药物代谢谢和生物物利用度度特点：浓浓度高，，易于收收集，体体内代谢谢研究，，应水解解分离离3．唾液液唾液中药药浓与血血浓相关关性收集方法法离离心收收集（二）样样品的贮贮藏1．血样样（血浆浆、血清清）及时时分离→→冷藏，，-70℃℃加入稳稳定剂剂NaF2．尿尿样①尿中中水、、无机机盐、、尿素素等细细菌的的生长长，4℃℃保存存②加入入防腐腐剂a．1%甲甲苯b．．饱和和氯仿仿c．．pH改变变3．唾唾液：：同血血样二、生生物样样品的的预处处理（一））预处处理的的目的的①存在在形式式的多多样性性游游离离结结合合代代谢谢物②浓度度低，，杂质质多（（分离离浓缩缩）③出现现浑浊浊和沉沉淀④与试试剂起起反应应⑤影响响色谱谱柱寿寿命（二））处理理方法法选择择的一一般原原则1．药药物理理化性性质pKa亲亲脂脂性挥挥发性性溶溶解解度光光谱特特征稳稳定定性2．浓浓度范范围灵灵敏的的方3．测定的目的定性定量母体代谢4．生物样品的种类5．样品处理与分析方法的选择①专一性②灵敏性（三）生物物样品去蛋蛋白处理1．加入与与水能混溶溶的有机溶甲醇乙腈甲醇1:2乙腈1:1.5（NH4）2SO4NaCl2．加入酸性沉淀剂三氯醋酸高氯酸苦味酸等使蛋白质分子的阳离子形成不溶性盐而↓，pH低于等电点3．组织酶酶消化法加入酶使蛋蛋白质水解解优点：①平平衡条件下下进行，可可避免反应应和降解②可改善对对蛋白结合合率强的药药物的回收收率③不产生乳乳化4．其他加加热超超滤（四）生物物样品缀合合物水解1．酸水解解2．酶水解解β-葡萄糖糖醛酸苷酶酶芳基基硫酸酯酶酶混合合酶pH4.5-7.037℃3．溶剂解解某些药物的的硫酸酯，，往往加入入率取溶剂剂时发生分分解，同时时提取有机机溶剂中（五）生物物样品的萃萃取1．液-液液萃取（1）优点点：①与杂杂质分离②②简便③浓集④④提提取率高（2）提取取率：在有有机相与水水相中的溶溶解度的比比值分配系系数，一般般少量多次次，对生物物样品一般般一次萃取取，>70%重重现性（3）影响响提取率的的因素①pH碱碱性药物在在碱性pH酸性酸酸性pH②提取溶剂剂相似似相溶原理理沸点低低，不影响响检测,性性质稳定，，不起化学学反应③离子强度度加入入中性盐增增加离离子强度，，与水结合合强，便于于有机溶剂剂提取（4）离子子对提取对于离子性性特强，水水溶性极大大的药物，，可采用离离子对提取取①原理②应用阴离子：COOH+SO3H-反离子四四丁基铵铵阳离子：NH2+反离子烷基基或芳基磺磺酸盐（5）提取取技术一般在试管管中进行有有机相与与水相比1:1或2:1（6）乳化化问题措施①轻缓振摇摇②含有分散散度大或不不溶物应过过滤掉③避免在高高pH条件件下，从水水中提取药药物④避免使用用易发生乳乳化的溶剂剂⑤萃取剂水中中加入少量NaCl破孔方法①机械法②加入少量高高级脂肪醇改改变变表面张力③改善混合溶溶剂比例，增增加分散相分分数（7）药物的的吸附①玻璃容器吸吸附1%三甲一氯硅硅烷10%二甲二氯氯硅烷②血浆2．液固萃取取固相萃取[solidphaseextractionSPE]针管式抽抽空减压加加压过滤滤（1）固相萃萃取步骤①固相选择样样品1ml1ml规格固相相1~25ml3ml规格固相相②固相处理反相C18固定相的6~10倍体积积甲醇洗柱，，使溶剂化6~10倍水水缓冲服液冲冲洗达分离状状态③上样④分离用用适当的弱溶溶剂洗涤洗洗去杂质，，通N2干燥固相⑤洗脱待测物物改变pH或极性（2）影响固固相萃取的因因素（1）流速流流速快，，按触不充分分，样品流失失回收率率低柱处理5~10ml·min-1洗脱0.2~1ml·min-1（〈300mg〉2~5ml··min-1（>300mg）（2）装样过过载突突破性试验验已知浓度样品品液①小体积上上柱→洗脱回回收百分率②加大体积→→洗脱回收百百分率③绘图当当回收率下降降时为过载（六）生物样样品的组分浓浓集（七）衍生生化处理GC衍生化HPLC衍生生化第四章体体内药物分析析方法的建立立与评价一、分析方法法灵敏度专属性光谱法++刚开始应用较多双波长，导数色谱法++++++HPLCGC免疫法++++++疫交叉反应，重现性根据药物理化化性质，结构构特征，药物物浓度，干扰扰成分大小，，实验目的二、分析方法法的设计依据据方法的建立原始方法改进进→创新创立方法1．做好文献总总结2．充分了解药药物特征及体体内状况pH、亲脂性、溶溶解度、极性性、光谱特征征、药动学参参数、体内代代谢情况3．明确测定目目的、要求目的4．结合实验室室条件设备条件预处理方法药浓监测药代动力学研研究母体药物和代代谢物三、分析方法法的建立1．纯品进行测测定确定线性范围围、灵敏度、、反应条件（（pH、t、T）2．空白样品测测定确定空白样品品是否有干扰扰3．以水代替空空白样品，加加标准液后测测定了解提取率、、检测浓度确定萃取条件件、pH、挥发浓缩等4．空白样品加加入标准液测测定标准曲线建立立回归方程回收率5．实验样品测测定四、分析方法法的评价可行性和可靠靠性1．准确度accuracy测定结果与真真实性的差异异用回收率表示示①接近100%②相对恒定①绝对回收率率也称萃取回收收率、提取回回收率测定血浆样品品中药物浓度度/相同浓度的标标准液=绝对回收率考虑3个浓度（高、、中、低）分布在标准曲曲线成上、中中、下一般要求绝对对回收率在≥≥70%一般方法HPLC内标内标法时注意意：药物与内内标用各自外外标法测定回回收率应相近近，差值<10%②相对回收率率方法回收率药物系列浓度度+血样→标准曲曲线取高高、、中中、、低低三三浓浓度度加加入入到到空空白白血血浆浆中中，，处处理理后后测测定定，，与与加加入入标标准准量量相相比比，，得得方方法法回回收收率率，，测测定定值值<15%，定定量量限限<20%注意意问问题题：：a．加加入入药药量量与与实实际际测测定定值值相相近近b．加加入入物物与与实实际际存存在在状状态态相相近近c．空空白白试试验验与已已确确定定方方法法进进行行比比较较2．精精密密度度precision①标标准准差差SD②相相对对标标准准性性偏偏差差RSD不大大于于15%，定定量量限限不不大大于于20%②日日间间精精密密度度日日内内精精密密度度3．灵灵敏敏度度（（sensitivity）检测测的的最最小小量量（1）检检测测限限（（LOD））从背背景景中中检检测测到到的的最最小小药药物物浓浓度度：：S/N≥3的绝绝对对量量LOD=3N/S（N噪间间S被测测物物信信号号/单位位重重量量））N=1mm