细菌内毒素检查3.光度法检查技术

光度法细菌内毒素检查技术湛江安度斯生物有限公司2017年5月1光度测定法方法学分类2光度测定法原理3试验器具4标准曲线的可靠性试验5干扰试验6检查法光度测定法2（一）光度测定法方法学分类光度测定法浊度法显色法动态浊度法终点浊度法动态显色法终点显色法3（一）光度测定法方法学分类浊度法：动态/终点检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化。显色法：动态/终点检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少。4光度测定法与凝胶法有

什么不同？5恒温孵育凝胶法-定性分析反应混合物检测结果通过凝胶的坚实程度来判断检测结果；手工操作、记录，肉眼观察结果检测灵敏度：0.5、0.25、0.125、0.06、0.03及0.015EU/ml；反应时间：60分钟；6鲎试剂与内毒素反应，使溶液的光度值发生变化，依据该变化与内毒素浓度的对应关系，计算样品中内毒素的含量值；检测范围宽：0.001EU/ml～10EU/ml或0.005EU/ml～50EU/ml等；反应时间：没有规定，用于中控最快5分钟可以判断；检测结果直观准确-定量的检测值；光度测定法-定量分析7光度测定法-定量分析反应混合物光度测定仪计算机BET软件检测结果8使用光度法BET

可以为我们带来什么9凝胶法光度法实现了实验结果的判断从肉眼观察到机械化实验结果的表示从定性到定量实验结果从不能保留到数据可溯源实验操作、数据记录从手工到自动化实验操作从繁琐到简单实验数据完整性从被质疑到信任反应过程从不可视到直观显示10更重要的是……11检测时间

缩短报告说服力

增强订单成交率提高12检测时间可以缩短多少呢符合药典的要求吗13反应时间比较凝胶法动态浊度法终点显色法PTS60分钟30~60分钟20~30分钟最快7分钟14光度法BET特点快速、定量结果形象、直观

操作简单

可靠性高灵敏度高

检测范围宽15比凝胶法更适合在如下领域使用：1.检测灵敏度更高，排除干扰的能力更强；

2.能更灵活的应用与质控中的快速内毒素分析；

3.定量的检测结果可用于产品的内毒素含量的趋势分析；

4.用定量的检测结果去衡量产品的质量水平；

5.边缘值产品辅助分析；

6.新产品BET方法学建立；

7.假阳性产品的判定等。光度测定法-定量分析16（二）光度测定法原理1.光电转换原理当一束光线进入如下光电转换装置时，该装置将产生电流I，我们称I为透光强度。光电池入射光反应混合物透射光I透光容器17设：初始时的透光强度为Is，某时刻的透光强度为It

定义1：透光率（Rt）：

Rt=It/Is(%)

初始时It=Is，Rt=100%，Rt曲线变化趋势是由高至低。定义2：吸光度(OD)：

OD=-lg(It/Is)

初始时It=Is，OD=0，OD曲线变化趋势是由低至高。选择不同的参数(Rt或OD)将得到不同变化趋势的动态曲线。T(分)IsItIeI18反应动态曲线(Rt-T曲线)以透光率（Rt）为纵座标，时间（T）为横座标，把鲎试剂与内毒素反应引起反应混合液透光率的变化连续地描绘在座标系中，便得到该反应的动态曲线如图：Rt（%）T（分）反应动态曲线100孵育期反应期结束期19反应动态曲线(OD-T曲线)以吸光度（OD）为纵座标，时间（T）为横座标，把鲎试剂与内毒素反应引起反应混合液吸光度的变化连续地描绘在座标系中，便得到该反应的动态曲线如图：ODT（分）反应动态曲线0孵育期反应期结束期202.动态曲线的特点把标准内毒素制备成三个浓度C1、C2、C3（C1>C2>C3），分别与鲎试剂反应，描绘出反应的动态曲线如下图：T（秒）C3ODC2C1分析动态曲线可看出：内毒素浓度越高，孵育期越短；内毒素浓度越高，反应期曲线越陡；内毒素浓度越高，进入结束期越快。213.光度法BET试验的相关变量相关变量：

内毒素浓度(C)

Rt或OD

反应时间(T):不同的方法有不同的意义常数：固定反应时间值终点法

固定Rt或OD值

动态法T（秒）C3ODC2C1224.动态法原理固定吸光度或透光率，检测反应混合物的吸光度或透光率达到某一预先设定的检测值所需要的反应时间。建立内毒素浓度与反应时间关系的标准曲线（C-T曲线）。用供试品的反应时间比对标准曲线，得出供试品的浓度。预设Rt或者OD值应按照试剂生产商的建议及使用的鲎试剂和仪器类型进行设定。23回归分析OD预设ODT1T2T30T(秒)C1C2C3LgT=b-kLgCLgTT3T2T1C3C2C1LgC（1）建立标准曲线24（2）测定供试品内毒素浓度（Cs）用鲎试剂与未知内毒素含量的供试品(S)反应，得到反应时间Ts，比对C-T关系的标准曲线，可得出供试品的内毒素含量Cs。比对标准曲线TsT(秒)LgT=b-kLgCLgCCsTsLgTOD0供试品预设OD25预设OD或Rt的选择OD反应时间最佳预设OD标准内毒素浓度之间的分辨率不好，容易受到背景噪声影响分辨率好但需要增加时间预设值一般由鲎试剂生产商建议，并注明在鲎试剂说明书中265.终点法原理固定反应时间（T），依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时的吸光度或透光率之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。建立内毒素浓度与吸光度或透光率关系的标准曲线（C-OD曲线或C-Rt曲线），用供试品的吸光度或透光率比对标准曲线，得出供试品的内毒素浓度。27回归分析ODOD10T(秒)C1C2C3OD=k*C+bODOD1OD2OD3C3C2C1C（1）建立标准曲线OD2OD3预设反应时间（T）左图为反应示意，终点法测试通常无法观测到反应曲线28（2）测定供试品内毒素浓度（Cx）用鲎试剂与未知内毒素含量的供试品（X）反应，得到吸光度值ODx，比对C-OD关系的标准曲线，可得出供试品的内毒素含量Cx。TODxODCx比对标准曲线OD=k*C+bODC预设反应时间（T）ODx左图为反应示意，终点法测试通常无法观测到反应曲线29（三）光度法BET试验器具光度测定仪和BET软件试剂实验用具30光度测定仪光度法试验需在特定的仪器中进行，温度一般为37±1℃。供试品和鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等，参照所用仪器和试剂的有关说明进行。31光度测定仪——FC/ET型

酶标分析仪特点：8位滤光片轮，标配3块滤光片：405nm、450nm和620nm；具有线性振荡；恒温孵育功能；可用于：动态浊度法、动态显色法和微板法动态显色鲎试验系统；通量大：96孔板（一次性）芬兰Thermo（赛默飞）FC/ET型

酶标分析仪32光度测定仪——ELx808IU酶标仪特点：6碟滤光轮，标配405、450、490、340和630nm波长可使用多波长同时分析，消除本底干扰；精确温控：37.0±0.5℃；通量大：96孔板（一次性）美国Biotek（伯腾）ELx808IU酶标仪33光度测定仪——试管仪LabKinetics（莱伯金耐特）ATi/LKL/LKM系列动态试管检测仪特点：体积小巧，占用空间小；恒温性能优越、各孔温度均在37±0.2℃；型号多，32孔、64孔和96孔；单波长和双波长可选择；每个孔有独立开关，独立计时，方便随时添加检测样品；反应管：可重复使用的玻璃管。34Endosafe®

Nexgen-PTS™

特点：便携式设备和试剂卡片组成的系统；快速：15分钟内获得定量结果；操作简单：只需要插入卡片，加入供试品即可检测；便携：定量仪、分析软件的一体化，可以携带的内毒素分析平台，带有锂电池，续航可满足一天的工作需求。光度测定仪——卡片式快速检测仪35Endosafe®

MCS™

特点：使用与PTS相同的试剂卡片;5个通道，可同时检测5个样品。光度测定仪——卡片式快速检测仪Endosafe®Nexus™特点：MCS和自动化平台的结合;全自动检测系统;3小时自动检测48-60个样品。36细菌内毒素检测软件生物探针5特点：用户分级管理和权限分配，密码保护等；审计追踪功能常规采集和快速采集模式，最快5分钟可判断供试品是否合格；检测结果可导出Excel表格，方便样品分析；符合数据完整性要求。37细菌内毒素检测软件EndoScan-V完全符合联邦条例法典第21款第11条关于电子记录的要求。电子签名功能38试剂光度法BET鲎试剂鲎试剂动态浊度法终点浊度法

动态显色法

终点显色法

规格1.25ml/支/0.35ml/支1.25ml/支0.45ml/支检测范围10-0.01EU/ml3-4个数量级/50-0.005EU/ml3-4个数量级0.5-0.05EU/ml1个数量级39试剂内毒素标准品

RSE或经RSE标化的CSE细菌内毒素检查用水

内毒素含量小于0.005EU/ml且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。40试验器具器具分类器具名称反应容器玻璃试管（外径8×75mm或10×75mm）、微孔平板稀释容器大口径玻璃试管移液器具刻度吸管及洗耳球，或移液器及无热原吸头等仪器光度仪、天平、电热干燥箱（温度250℃以上）、旋涡混合器其他试管架、异丙醇浸泡的无纺布、镊子、剪刀、砂轮、封口膜或医用胶布、标记纸等凡是与供试品或反应试剂接触的器具，必须经除热原处理。41（四）标准曲线的可靠性试验试验目的验证实验室的条件验证实验人员的实验技能是否满足BET试验的要求验证实验所用试剂验证实验所用器具42（四）标准曲线的可靠性试验试验流程图内毒素标准品（RSE或CSE）鲎试剂开启内毒素测定仪预热设定复溶、混合反应容器，内毒素每个浓度至少3支平行管，阴性对照平行2管在内毒素测定仪中反应制成至少3个浓度的稀释液，相邻浓度间稀释倍数不得大于10，最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限使用软件进行数据分析及结果判断复溶123564431.阴性对照的吸光度或透光率小于标准曲线最低点检测值或反应时间大于标准曲线最低点的反应时间；2.标准曲线的相关系数|r|≥0.980；3.变异系数CV<10%判断标准药典要求:建议值:（四）标准曲线的可靠性试验ChP（2015年版）增加终点法判断，更合理44何时需做这个试验呢？1、使用新批号的鲎试剂2、试验条件有任何可能会影响检验结果的改变45（四）标准曲线的可靠性试验例子：动态显色法1.试剂名称厂家装量规格动态显色法鲎试剂安度斯0.35ml/支10~0.01EU/ml内毒素标准品（CSE）中检院100EU/支BET水（W）安度斯25ml/瓶内毒素<0.003EU/ml462.仪器及软件信息仪器名称ET酶标分析仪厂家赛默飞世尔波长405nm软件名称生物探针５（四）标准曲线的可靠性试验例子473.反应溶液制备选择标准曲线浓度：2.0、0.2、0.02EU/ml；取CSE1支，打开加入1ml水复溶，旋涡混合15分钟，得原液100EU/ml的内毒素溶液记为E1004.复溶鲎试剂E100E100.4ml1.6mlWE20.2ml1.8mlWE0.20.2ml1.8mlWE0.020.2ml1.8mlW485.进入软件，设置试验参数及反应项目试验方法预设OD试剂批号试验布板496.加样：按项目布板位置加样0.025ml鲎试剂溶液＋0.025ml内毒素溶液,每个浓度平行三孔，NC平行二孔7.反应：把反应板放置仪器中，设置反应60分钟50阴性对照反应时间大于标准曲线最低浓度反应时间相关系数绝对值大于0.980CV＜10％8.试验完成后进行数据分析519.结果判断标准曲线范围：2.0~0.02EU/mlTNC

＞T

λ；|r|≥0.980,CV<10%标准曲线符合规定!5252变异系数变异系数(CoefficientofVariation):用于比较两个或多个数据离散程度的大小。变异系数越大，其离散程度的测度值越大（平行管重复差），反之越小（平行管重复好）。变异系数CV=(标准偏差SD/平均值Mean)×100%5353(五）产品验证：干扰试验目的：确定日常检测供试品的制备方法（检测浓度或稀释倍数）不管是哪一种光度法，简单的说分为两个阶段阶段1干扰初筛试验阶段2三批产品干扰验证试验54阶段1：干扰初筛目的：初步找到供试品的无干扰浓度选择标准曲线（确定λ）计算内毒素限值，C或MVD用一批产品制备供试品溶液介于未稀释的供试品原液到C或MVD之间原理：在供试品溶液中添加已知浓度的标准内毒素溶液，计算内毒素回收率，判断供试品浓度对BET的干扰情况。55验证三批产品用干扰初筛确定的无干扰稀释倍数/浓度进行试验如果可能请留一个安全系数小结：干扰初筛：一个批次测多个浓度干扰试验：三个批次测一个浓度阶段2：干扰试验56A为稀释倍数不超过MVD的供试品溶液

B为加入m内毒素且与溶液A有相同稀释倍数的供试品溶液

C为用于制备标准曲线的内毒素标准溶液

D为阴性对照反应项目设置编号内毒素浓度被加入内毒素的溶液平行管数A无供试品溶液至少2B标准曲线的中点（或附近点）的浓度（设为λm）供试品溶液至少2C至少3个浓度（最低点设定为λ）检查用水每一浓度至少2D无检查用水至少257标准曲线的选择小建议考虑检测范围检测灵敏度（与MVD有关）检测范围供试品的内毒素水平一般选择等比浓度，主要是线性要好不要选太高浓度581.标准曲线满足“标准曲线的可靠性试验”中的要求2.回收率R满足：50%≤R≤200%3、变异系数CV<10%判断标准药典要求建议值59回收率（R）的计算R=（CS-Ct)/λm×100%Ct:供试品内毒素含量；Cs:含标准内毒素的供试品内毒素含量；λm：人为添加的内毒素浓度；例子：某供试品内毒素含量0.05676EU/ml；含标准内毒素的供试品内毒素含量0.24534EU/ml；λm：0.2EU/ml；R=（0.24534-0.05676)/0.2×100%=94.29%601.干扰初筛试验举例例子-动态显色法试验KCA（1）供试品名称及内毒素限值供试品名称规格内毒素限值注射用乌司他丁10万单位/瓶1.25EU/10000单位61（2）仪器及软件信息1.干扰初筛试验举例仪器名称ET酶标分析仪厂家赛默飞世尔波长405nm软件名称生物探针５62（3）试剂信息名称厂家装量规格动态显色法鲎试剂安度斯0.35ml/支10~0.01EU/ml内毒素标准品（CSE）中检院100EU/支BET水（W）安度斯25ml/瓶内毒素<0.003EU/ml63（4）选择标准曲线范围2.0~0.02EU/ml

λ=0.02EU/ml；λm=0.2EU/ml；（5）最大有效稀释倍数MVD的计算

取供试品1瓶，加入2ml检查用水溶解后混合，供试品原液浓度为5万单位/ml;MVD=CL/λ=5万单位/ml×1.25EU/1万单位/0.02EU/ml=312.5(倍）

64（6）各反应溶液的制备溶液C的制备

溶液A的制备取供试品1瓶加入2ml水溶解后，稀释至10倍（S10）、20倍（S20）和40倍（S40）E100E100.4ml1.6mlWE20.2ml1.8mlWE0.20.2ml1.8mlWE0.020.2ml1.8mlW65溶液B的制备：配制供试品的10倍、20倍和40倍稀释液中含有0.2EU/ml的溶液制备方法参照凝胶法溶液B的制备方法：方法A：等比稀释法方法B：近似稀释法66（7）加样及反应反应项目设置编号反应项目平行管D阴性对照BET水C标准曲线E0.02E0.2E2.0A供试品溶液S10、S20、S40B供试品回收溶液S10、S20、S40中添加0.2EU/ml的内毒素溶液6710倍回收率：113.44%20倍回收率:101.15%TNC（>3600s）>Tλ相关系数绝对值|r|=0.9994>0.980试验有效有干扰40倍回收率:110.69%无干扰无干扰试验有效（8）试验完成后进行数据分析68（9）结果判断内毒素浓度（EU/ml）0.020.22.0阴性对照反应时间（秒）2468.51255685.5>3600相关系数-0.9994标准曲线信息供试品批号1检测浓度S10S20S40回收率（%）113.44101.15110.6950%~200%符合符合符合结果判断69（10）结果判断标准曲线范围：2.0~0.02EU/mlTNC

＞T

λ；|r|≥0.980；CV<10%标准曲线符合规定!注射用乌司他丁稀释10倍以上时，无干扰702.干扰试验举例（1）根据干扰初筛试验结果，确定选择供试品的无干扰浓度无干扰选择回收率接近100%的稀释倍数*本试验选择10倍稀释液为干扰验证浓度。无干扰无干扰71（2）反应项目设置溶液编号反应项目平行管D阴性对照BET水OOC标准曲线E0.02OOE0.2OOE2.0OOA1供试品溶液S10OOB1供试品回收溶液S10E0.2OOA2供试品溶液S10OOB2供试品回收溶液S10E0.2OOA3供试品溶液S10OOB3供试品回收溶液S10E0.2OO72（3）试验结果相关系数绝对值|r|=0.9998>0.980TNC（>3600s）>Tλ试验有效试验有效试验有效试验有效无干扰73（4）结果判断内毒素浓度（EU/ml）0.020.22.0阴性对照反应时间（秒）23341217.5663>3600相关系数-0.9998标准曲线信息供试品批号123检测浓度（S10）S10S10S10反应时间（S）174221991512回收率（%）94.2984.5796.7450%~200%符合符合符合结果判断74

TNC

＞T

λ,|r|＞0.980,CV<10%标准曲线符合规定!注射用乌司他丁稀释10倍时，3批供试品的回收率在84.57%~96.74%，无干扰；可以作为日常检查浓度。试验有效75（六）检查法（日常检查）根据干扰试验结果，选择无干扰的供试品浓度进行BET日常检查各反应溶液的制备及反应项目设置与干扰试验相同76判断标准1、标准曲线满足“标准曲线的可靠性试验”中的要求2、回收率R满足：50%≤R≤200%3、变异系数CV<10%若内毒素含量＜L，判供试品符合规定；若内毒素含量≥

L，判供试品不符合规定。

药典要求建议值77日常检查举例-注射用乌司他丁1.供试品名称及内毒素限值供试品名称规格内毒素限值注射用乌司他丁10万单位/瓶1.25EU/10000单位干扰试验结论：注射用乌司他丁稀释10倍时，无干扰。78溶液编号反应项目平行管D阴性对照BET水OOC标准曲线E0.02OOE0.2OOE2.0OOA供试品溶液S10OOB供试品回收溶液S10E0.2OO2.反应项目设置79标准曲线范围2~0.02EU/ml,反应平均时间663.0~2334秒。相关系数绝对值|r|=0.9998>0.980TNC（>3600s）>Tλ试验有效试验有效3.试验结果试验有效804.结果判断内毒素浓度（EU/ml）0.020.22.0反应时间（秒）23341217.5663标准曲线信息供试品批号123检测浓度（S10）S10S10S10反应时间（S）174221991512回收率（%）94.2984.5796.74内毒素值（EU/万单位）1.1360.4841.89结果判断合格合格不合格结果判断接近限值，慎重！81光度法报告解读

实测值？原液浓度？参考值？该报哪一个值好呢？82实测值：将反应时间代入回归方程中计算得到的内毒素浓度。表示反应容器中的供试品中的内毒素含量。当超出标准曲线范围时，则是外推值。原液浓度：表示未经稀释的供试品的内毒素含量。当实测值在标准曲线可测范围内时：原液浓度=实测值x稀释倍数（或实测值÷浓度）；当实测值在标准曲线可测范围外时：大于最高检测限，原液浓度表示为>标准曲线最高浓度x稀释倍数（或实测值÷浓度）；小于最低检测限，原液浓度表示为<标准曲线最低浓度x稀释倍数（或实测值÷浓度）；参考值：实测值x稀释倍数（或实测值÷浓度）。仅当实测值为外推值时出现。仅供参考。83还是不明白…0.05EU/ml0.5EU/ml5EU/ml标准曲线可测范围0.05~5EU/ml举例：假设某供试品检测浓度为10mg/ml建立标准曲线0.05、0.5、5EU/ml实测值：0.15EU/ml原液浓度：0.015EU/mg实测值：6.2EU/ml（外推值）原液浓度：>0.5EU/mg参考值：0.62EU/mg外推值外推值84（七）BET常见异常结果分析光度法标准曲线的线性不合格变异系数大内毒素回收率不合格阴性对照不合格不正确的预设Rt或OD值，导致的异常结果851.线性不足标准内毒素某个标准内毒素浓度制备误差标准品旋涡混合不充分标准品储存不当或用具干扰试剂污染检测能力不足仪器设置不