DB37-T 3573-2019牛支原体诊断技术规程

ICS 11.220B41

DB37山 东 省 地 方 标 准DB37/T3573—2019牛支原体诊断技术规程CodeofPracticefortheDiagnosisofMycoplasmaBovis20192019052920190629山东省市场监督管理局发布目 次前言 II范围 1规性用件 1术与义 1试及器 112样采与理 2似支体牛的判断 2似例品采集 2品理 2微物检法 2体养 2落态察 2Dienes3化验 3果定 3核检法 3DNA板制备 3PCR3胶泳 4量制 4果定 4废物处和测程中全施 4操注事项 5附录A（范附）养的备法 6前 言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。牛支原体诊断技术规程范围本标准适用于牛支原体的实验室诊断。GB6682—2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T14926.8—2001实验动物支原体检测方法GB15981—1995消毒与灭菌效果的评价方法与标准GB19489—2008实验室生物安全通用要求3术语与定义3术语与定义下列术语和定义适用于本文件。3.1牛支原体Mycoplasmabovis3.2Dienes染色液一种经典的利用天青美蓝染色检测支原体的染色液。3.3类胸膜肺炎微生物培养基Pleuropneumonia-LikeOrganismsmedium，PPLO培养基4试剂及仪器4.1试剂去离子水（符合GB6682—2008的相应要求）；牛支原体检测培养基所需试剂及配制方法见附录A；TaqDNA聚合酶及其反应缓冲液；生理盐水；Dienes染色液；TAE电泳缓冲液；琼脂糖4.2仪器接种环、酒精灯、移液器（5～100μL和100～1000μL）、枪头（200μL和1mL）、培养试管（15mL）和玻璃平皿（90mm）、CO2恒温培养箱、移液器、1L容量瓶、核酸扩增仪、电泳仪、高压灭菌锅、正置光学显微镜。根据“5.1”所述牛支原体感染的三种临床表现型，分别进行样品的采集，具体要求如下：15152mL～5mL剪至云雾状后，用2mL生理盐水重悬，7500g离心5min，用注射器吸取1mL上清液经0.45μm滤膜滤过后备用。用2mL生理盐水浸润拭子后，7500g离心5min，吸取1mL上清液经0.45μm滤膜滤过后备用。分别取1mL原液与1mL生理盐水充分混合，7500g离心5min，用注射器吸取1mL上清液经0.45μm滤膜滤过后备用。6微生物学检测法将0.5mL“5.34.5mLPPLO37℃，53PPLO取50μL疑似液体培养阳性的样品加入到PPLO固体培养基（配方见附录A）上，涂布均匀后，置于37℃，5%CO2培养箱中培养3～5天后，4倍物镜下观察菌落形态。Dienes将有可疑菌落的固体培养基平皿进行Dienes染色，37℃孵育30min后，观察菌落颜色。0.2mg/mLPPLO37℃，5CO23℃，5%CO2培养箱中培养3或变黄时，说明不水解精氨酸；当培养基颜色变红时，说明水解精氨酸。当同时满足以下条件时，判定为牛支原体阳性：Dienes7核酸检测法DNA水煮法取“5.3”所述的上清样1mL于灭菌的2mLEppendorf管中，12000g离心12min，弃上清，沉淀重悬于200μL无菌ddH2或变黄时，说明不水解精氨酸；当培养基颜色变红时，说明水解精氨酸。当同时满足以下条件时，判定为牛支原体阳性：Dienes7核酸检测法DNA水煮法取“5.3”所述的上清样1mL于灭菌的2mLEppendorf管中，12000g离心12min，弃上清，沉淀重悬于200μL无菌ddH20中，沸水浴15min后立即冰浴2min，待Eppendorf管冷却后12000g离心10min，取上清液即为样品DNA模板。提取样品DNA模板时，采用商品化的支原体基因组DNA提取试剂盒或革兰氏阴性菌基因组DNA提取试剂盒进行提取，操作步骤参照商品化试剂盒说明书。7.2PCRPCR参照国际上常用的PCR诊断方法，选择针对牛支原体设计的一对特异性引物用于PCR检测（Subramaniam,etalMolecular&CellularProbes,1998.）1626bpMBOUVRC2-L：5’-TTACGCAAGAGAATGCTTCA-3’MBOUVRC2-R：5’-TAGGAAAGCACCCTATTGAT-3’PCR经“7.1”提取的样品DNA模板，以牛支原体DNA作为阳性对照，ddH2O为阴性对照。PCR反应体系如表1。表1牛支原体PCR反应体系中各成分添加量试剂名称用量Taq酶（1000U/mL）1μL10×反应缓冲液（含镁离子）2μLdNTP（10mM）1μL上游引物（10μM）1μL下游引物（10μM）1μL检测模板5μLddH209μL总体积20μL7.2.37.2.3PCR955min9530s，5230s，721.5min36个循环；7210min4采用1.5120V35min1600bpPCR1600bp8废弃物的处理和检测过程中安全措施按照GB19489—2008中规定执行。48h2～3PCR附录A（）PPLO（pH7.6）PPLO21.0g2.5g，2.5g2.0g850mLddH2O1w/v)4mL，11620min（GB15981—1995执行）56150mL和pH7.6，每4.5mL15mL1PPLO（pH7.6）PPLO粉21.0g，酵母粉2.5g，葡萄糖2.5g，丙酮酸钠2.0g，琼脂粉20.0g，溶于850mLddH2O中，加入1%(w/v)酚红溶液4mL，116℃灭菌20min（按照GB15981—1995执行），冷却至55℃左右。无菌操作加入56℃灭活的马血清150mL和20万单位青霉素，调节pH值为7.6，每15mL倒入90mm无菌培养皿，冷却凝固，室温保存1周，冷藏保存1个月。PPLOPPLO2.1g0.25g，0.25g85mLddH2O1w/v)0.2mL，116℃灭菌20min（按照GB15981—1995执行），加入56℃灭活的马血清150mL和20万单位青霉素，调节pH值为7.6，每4.5mL分装至15mL培养管，冷藏保存1个月。A.4精