细胞游离亚铁原卟啉检测技术资料课件

细胞(xìbāo)游离亚铁原卟啉检测技术作者：温鑫第一页，共六十八页。

细胞游离亚铁原卟啉（CellsFreeFerrousProtoporphyrinFH）是恶性肿瘤发生过程中产生的因果性生物标志因子。FH是含亚铁原卟啉蛋白的分解产物。FH具有强氧化作用，导致细胞自稳调节功能紊乱。

FH含量具有连续可测量性，且与细胞癌变程度呈密切正相关。采用直接(zhíjiē)生物学介质（组织渗液）进行靶向定位检测，即可显示细胞恶变过程。第二页，共六十八页。

细胞游离(yóulí)亚铁原卟啉

（FH）主要来源

线粒体第三页，共六十八页。膜间腔嵴间腔DNA基粒外膜内膜核糖体嵴嵴内腔(nèiqiānɡ)基质(jīzhì)基质(jīzhì)颗粒线粒体的超微结构第四页，共六十八页。膜间腔嵴内腔嵴间腔基粒第五页，共六十八页。

抑制剂

可溶性的ATP酶寡酶素敏感蛋白（OSCP）HP蛋白第六页，共六十八页。

线粒体内含亚铁原卟啉的蛋白主要包括：

铁硫蛋白、辅酶Q、细胞色素等；

ATP合酶、过氧化氢(ɡuòyǎnɡhuàqīnɡ)酶、过氧化物酶、单胺氧化酶、血红素加氧酶、NAD（P）H氧化酶、鸟氨酸氧化酶、一氧化氮合成酶、腺苷酸激酶、细胞色素氧化酶、苹果酸还原酶等120余种酶类。

第七页，共六十八页。

在病理情况下，亚铁原卟啉从细胞蛋白析出，成为细胞游离亚铁原卟啉，不仅没有生物学功能(gōngnéng)，反而能引起细胞和组织器官的氧化损伤。

第八页，共六十八页。

细胞游离(yóulí)亚铁原卟啉（FH）生成机制【细胞能量代谢重编程】第九页，共六十八页。ATPADP肌酸磷酸肌酸~P~P机械能(肌肉(jīròu)收缩)渗透能(物质主动转运)化学能(合成代谢)电能(生物电)热能(维持体温)生物体内能量的储存和利用(lìyòng)都以ATP为中心。第十页，共六十八页。糖脂肪蛋白质葡萄糖脂酸+甘油氨基酸乙酰CoA

TAC2H

呼吸(hūxī)链H2OADP+PiATPCO2

Ⅰ：分解(fēnjiě)

Ⅱ：氧化(yǎnghuà)分解

Ⅲ：氧化磷酸化第十一页，共六十八页。

第十二页，共六十八页。

诺贝尔奖获得者德国生物化学家奥托.海因里希.瓦博格（OttoHeinnichWarburg）发现肿瘤细胞的耗糖速度是正常细胞的10倍，却仅产生1/10的能量。肿瘤细胞主要通过磷酸戊糖途径(tújìng)产能，使即便在有氧情况下有氧氧化过程也不能对糖酵解产生抑制，这称为瓦博格氏效应（Warburgeffect）。第十三页，共六十八页。

以6-磷酸(línsuān)葡萄糖开始，在6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化下形成6-磷酸葡萄糖酸，进而代谢生成以磷酸戊糖为中间代谢物的过程，称为磷酸戊糖途径，简称PPP途径。反应部位：胞浆

重要反应产物：NADPH、5-磷酸核糖

限速酶（启动因子）：6-磷酸葡萄糖脱氢酶第十四页，共六十八页。

6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活性与抑癌基因p53有关。p53基因因编码一种分子质量为53kDa的蛋白质而得名，是一种抑癌基因。一旦p53基因发生突变，P53蛋白失活，细胞分裂失去(shīqù)节制，发生癌变。第十五页，共六十八页。第十六页，共六十八页。

在正常情况下,p53与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶相结合,抑制它的活性，阻止磷酸戊糖途径进行,细胞(xìbāo)中的葡萄糖主要通过三羧酸循环产生能量。

第十七页，共六十八页。

在p53发生突变或缺失的肿瘤细胞中,失去了对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的抑制,该酶作为戊糖磷酸途径的启动因子，使葡萄糖通过戊糖磷酸途径代谢。1、耗能；2、产生(chǎnshēng)大量还原型辅酶Ⅱ（NADPH）,进行生物合成；3、改变细胞微环境。

第十八页，共六十八页。致癌因素(yīnsù)阻抑蛋白p53葡萄糖-6-磷酸(línsuān)脱氢酶P53突变(tūbiàn)突变的p53葡萄糖-6-磷酸脱氢酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶激活启动因子葡萄糖戊糖磷酸代谢途径TACNADPH果糖-6-磷酸3-磷酸甘油醛二氧化碳抑制第十九页，共六十八页。第二十页，共六十八页。Warburg效应形成的细胞微环境紊乱

低氧（氧稳态紊乱）

酸性环境（酸碱平衡紊乱）

还原性状态(zhuàngtài)（氧化-还原平衡紊乱）

第二十一页，共六十八页。第二十二页，共六十八页。

FH位于细胞含亚铁原卟啉蛋白的肽链靠近表面(biǎomiàn)的一个疏水核内，它主要依靠Fe2+与F8His的咪唑氮配位而挂在Pr链上。但是它之所以能固定在蛋白质的固定位置上而且取向一定，主要是因为还有大约21个残基逼近FH，距离在4A°之内，这些残基中有60多处与FH比较靠近，可以发生极性与非极性的相互作用，足以保持FH在细胞蛋白中的位置。第二十三页，共六十八页。

FH的极性部分丙酸基侧链伸向亲水的表面，在生理pH下解离成负离子，在α链中，有一个丙酸基与CD3His相连；在β链中，FH的两个丙酸基分别与CD3Ser和E10Lys相连。FH与肽链之间的静电引力对于(duìyú)维持FH在细胞含亚铁原卟啉蛋白中的位置有很大作用。第二十四页，共六十八页。

谷胱甘肽过氧化物(ɡuòyǎnɡhuàwù)酶以还原型谷胱甘肽(GSH)作为供氢体来分解H2O2，生成氧化型谷胱甘肽(GSSG)，使细胞内GSH:GSSG的比率下降。GSH生成GSSG过程中形成肿瘤细胞的低氧状态，激活氧感受器和缺氧信号传导通路。第二十五页，共六十八页。

FH的极性部分丙酸基侧链伸向亲水的表面，在生理pH下解离成负离子，在α链中，有一个丙酸基与CD3His相连；在β链中，FH的两个丙酸基分别与CD3Ser和E10Lys相连。FH与肽链之间的静电引力对于(duìyú)维持FH在细胞含亚铁原卟啉蛋白中的位置有很大作用。第二十六页，共六十八页。

氧感受器分子导致蛋白质的巯基由氧化型向还原型转变，促使缺氧特异性转录因子-低氧诱导因子（hypoxia-induciblefactor；HIF）HIF-1a的磷酸化并与HIF-1b结合而形成一个完整的HIF-1转录复合体，从而与相应靶基因上的缺氧反应元件(HRE)结合，促进基因的表达.并通过第二信使-活性氧族(ROS)与激酶系统(xìtǒng)发生联系，激活下游酶系统。第二十七页，共六十八页。

细胞在代谢过程中通过Fenton反应产生产生一系列活性氧族（reactiveoxygenspecies,ROS），包括：O2-、H2O2及HO2·、·OH等。ROS可双向调控细胞的凋亡和增殖，机体内的自由基通过其浓度调节(tiáojié)着机体细胞的生死平衡，对转录因子的激活以及对细胞增殖的促进。第二十八页，共六十八页。

由于瓦格博效应，在低氧诱导因子（hypoxiainduciblefactor，HIF）的介导下，血管内皮生长因子（VEGF）mRNA转录和稳定性增加，且VEGF受体表达上调，VEGF的生物学效应增强。其表达的结果(jiēguǒ)是增加血管分支形成,增强血流量。第二十九页，共六十八页。

HIF-1a、ROS、VEGF表达上调，使一种亲脂性物质(wùzhì)（Hydrophilicfattymolecules）进入细胞含亚铁原卟啉蛋白疏水核内，它所带的负电荷中和了肽链上His、Lys所带的正电荷，使它们不再与FH丙酸基侧链保持静电吸引，从而使FH在细胞蛋白中脱落。第三十页，共六十八页。瓦博格(bóɡé)效应NADPH增加(zēngjiā)GSH增加(zēngjiā)激活氧感受器和缺氧信号传导通路缺氧特异性转录因子HIF-1a活性增强激活第二信使-ROS与激酶系统EPO基因表达水平升高NADPH氧化酶H2O2下降cGMP抑制激活鸟苷酸环化酶VEGF表达上调血红素氧合酶及NOS活性抑制内源性CO及NO下降FH释放第三十一页，共六十八页。

代谢改变

HIF-1

VEGF不典型增生癌前病变原位癌浸润癌细胞增生

形态学改变低氧、还原态

ROS瓦博格效应

α链CD3His

β链CD3Ser、E10Lys酶蛋白

FH

p53等基因突变

致癌因素

Hfm细胞高增生低凋亡低分化低氧代谢(dàixiè)通路第三十二页，共六十八页。

还有的学者特别强调自由基的作用，认为亲脂性物质进入含亚铁原卟啉蛋白疏水核，与蛋白中心的Fe2+通过Fenton反应产生．OH。．OH具有极高的氧化还原(huányuán)态势，反应力极强，几乎可以和生物细胞内所有类型的分子以s-1化学反应0级（相当于几个飞秒，1飞秒只有1秒的一千万亿分之一）的反应速率作用。第三十三页，共六十八页。

但是，．OH寿命短暂，因而最靠近．OH的部位受到攻击的可到性也最大。位居线粒体内膜基粒基片的含亚铁原卟啉蛋白由于在空间位置上的态势，首先(shǒuxiān)受到．OH的攻击，共价键断裂，其结构遭到不可逆转的破坏，FH析出。第三十四页，共六十八页。

FH对细胞氧化损伤可能的作用(zuòyòng)靶点：1、细胞周期各期交叉处存在的检查点（checkpoint）及核染色体基因组（nucleicgenome)；2、线粒体基因组(mitochondrialgenome)；3、细胞囊泡（Vesicles）运输调控机制。第三十五页，共六十八页。

DNA损伤(sǔnshāng)检查点（DNAdamagecheckpoint）DNA复制检查点（DNAreplicationcheckpoint）纺锤体组装检查点（spindleassemblycheckpoint）第三十六页，共六十八页。第三十七页，共六十八页。人类具有两个基因组：核/染色体基因组（nucleicgenome)线粒体基因组(mitochondrialgenome)一般(yībān)认为线粒体基因组（mtDNA）的自发突变率远较核基因组（nDNA）高，约10-20倍。第三十八页，共六十八页。

mtDNA在nDNA内的整合(zhěnɡhé)可能通过两条途径引起细胞癌变：1、通过引起核基因组的不稳定性发生癌变；2、通过改变细胞能量产生，提高线粒体氧化压力，引起线粒体酶表达异常和/或调控凋亡等途径来影响细胞的生物学行为，使其发生恶变。第三十九页，共六十八页。第四十页，共六十八页。

囊泡运输是生命(shēngmìng)活动的基本过程，细胞内的膜性细胞器之间的物质运输(如蛋白质、脂类)，主要是通过囊泡完成的。囊泡是细胞内物流的集装箱。钙离子是囊泡释放的开关。苏德霍夫发现，囊泡表面有一种结合蛋白，该蛋白只有在钙离子定向流动时才能与细胞膜表面的另一种蛋白结合，从而促进囊泡运输功能。第四十一页，共六十八页。

FH的氧化损伤作用使线粒体出现单价电子渗漏（univalentleak）；胞内Ca2+超载，触发线粒体摄取Ca2+并使Ca2+在线粒体内积聚。线粒体氧化损伤使Ca2+定向流动发生异常，不能与细胞膜表面的特定蛋白结合(jiéhé)，从而损害囊泡运输功能。囊泡运输功能的破坏是细胞恶变的重要通路。第四十二页，共六十八页。P53基因(jīyīn)突变FH物质(wùzhì)析出检查点功能(gōngnéng)受损细胞周期稳态失调细胞功能紊乱mtDNA氧化损伤基因组稳态失调细胞形态紊乱细胞钙通路障碍囊泡运输功能失调第四十三页，共六十八页。

关于细胞癌变(áibiàn)(carcinogenesis)的具体机理还存在争议和分歧。1、体细胞突变（somaticmutation）假说：主要包括基因突变(genemutation)假说和非整倍体(aneuploidy)假说；2、表型遗传修饰（epigenesis）改变假说；3、肿瘤干细胞假说；

4、对称分裂抑制机制紊乱假说；第四十四页，共六十八页。5、干细胞不对称分裂机制紊乱假说(jiǎshuō)（1）基因突变与干细胞不对称紊乱；（2）非整倍体与干细胞不对称分裂紊乱；

（3）表型遗传改变与干细胞不对称分裂紊乱；（4）细胞永生化与干细胞不对称分裂机制紊乱。第四十五页，共六十八页。

成体干细胞不对称分裂(fēnliè)紊乱第四十六页，共六十八页。

根据生物全息律理论，生物体的一个部分（细胞）包含全部整体信息。肿瘤发生过程是体细胞的全能性表现过程，只不过是表现出结构和功能只适应特殊的局部环境而与整个机体不协调，是一种对称破缺紊乱(wěnluàn)或影像对称（手性特征）破缺紊乱(wěnluàn)。第四十七页，共六十八页。

生命的基本物质是生物大分子，它包括蛋白质、核酸、多糖和脂类。其中蛋白质是生命功能的执行者，组成生物蛋白质的氨基酸都是L型（左旋）的；核酸是遗传信息的携带者和传递者，通常是右旋的。这是生物大分子的手性特征。生物体内化合物的这种左右不对称性（对称破缺）正是生命力的体现，人类(rénlèi)自身都是对称性自发破缺的产物。对称破缺紊乱是病理的结果。第四十八页，共六十八页。

粒子物理学中的对称破缺问题与未知的力有关。粒子物理学中的许多理论,如量子色动力学,爱因斯坦的广义相对论,都是源于对称的.可是我们的世界又是不对称的.这表明除了已经知道的强力,电磁力,弱力和引力外可能存在未知的力,这个力是引起对称破缺的原因.如果我们了解这个力,就有可能知道对称破缺的机制,就能知道不对称性的起源,进而(jìnér)就有可能了解质量(包括暗物质)的来源，也就能真正明了世间万物的产生机理。第四十九页，共六十八页。

综之，机体在各种致癌因素作用下，可能由于细胞游离亚铁原卟啉氧化损伤作用的参与，细胞稳定性紊乱，在基因水平上失去了正常调控，可能导致细胞对称分裂抑制机制紊乱，或者导致干细胞不对称分裂机制紊乱。表型遗传修饰(xiūshì)改变的细胞克隆性增生，形成恶性肿瘤。第五十页，共六十八页。致癌因素(yīnsù)细胞(xìbāo)能量代谢重编程细胞(xìbāo)内环境紊乱细胞形态紊乱细胞功能紊乱氧稳态紊乱酸碱平衡紊乱氧化-还原态平衡紊乱细胞周期功能紊乱线粒体功能紊乱囊泡运输功能紊乱表型遗传修饰机制紊乱细胞对称分裂抑制机制紊乱干细胞不对称分裂机制紊乱细胞癌变瓦博格氏效应第五十一页，共六十八页。

细胞游离亚铁原卟啉检测最适宜(shìyí)领域

群体性筛检

（mass

screening）第五十二页，共六十八页。癌前期无症状早期癌中晚期死亡筛查筛查检查看病可预防不改变预后可长期存活第五十三页，共六十八页。筛检试验

诊断试验对象不同

健康人或无症状的病人

病人目的不同把病人及可疑病人与无病者区分开来把病人与可疑有病但实际无病的人区分开来要求不同快速、简便、高灵敏度科学性、准确性费用不同简单、廉价一般花费较贵处理不同须进一步作诊断试验以便确诊结果阳性者要随之以治疗第五十四页，共六十八页。

筛检试验技术五大要素准确、快捷(kuàijié)、经济、易接受与后续的诊断能保持连续性

细胞游离亚铁原卟啉检测基本符合上述要求，是癌症筛查的适宜技术。第五十五页，共六十八页。

细胞游离亚铁原卟啉（FH）连续可测量性【上皮细胞FH检测(jiǎncè)技术】第五十六页，共六十八页。采用一种脂溶性较强的物质，使之很容易进入细胞与细胞器中，其与FH物质的氧化-还原产物使上皮细胞内含有的内源性过氧化物酶等酶染色(rǎnsè)。作为筛查手段，观察组织渗液上皮细胞中FH物质对细胞内酶的染色情况，即可显示上皮细胞是否存有恶变及其程度。因细胞内酶的差异，同一含量FH显色可能略有不同。第五十七页，共六十八页。

技术特色1、细胞游离亚铁原卟啉是一种因果性生物标志因子，是细胞稳定性失调、肿瘤发生过程细胞代谢变化的必然产物。因而用以检测(jiǎncè)恶性肿瘤敏感度高。2、本技术采用直接生物学介质进行检测，是一种靶向定位检测，因而用以检测恶性肿瘤特异度高。第五十八页，共六十八页。

3、这种代谢(dàixiè)改变的肿瘤细胞是全息性的，是体细胞全能性不协调的表现，因而用以检测恶性肿瘤具有广谱性，适用范围广。

4、简约设计；床边诊断技术，可自检，快速、廉价；操作简便，采样后的检测过程只需3分钟内即可得出检测结果。

第五十九页，共六十八页。

生物学介质和检测(jiǎncè)范围

宫颈渗液：宫颈癌

直肠渗液：直肠癌

鼻咽部渗液：鼻咽癌前列腺液：前列腺癌痰液：肺癌乳头溢液：乳腺癌

宫腔渗液：子宫内膜癌、绒毛膜上皮癌。

体表部位增生、溃疡、糜烂等处的组织渗液：肛管癌、阴茎癌、外阴(wàiyīn)癌、口唇癌、舌癌、牙龈癌、乳房外湿疹样癌、鳞状上皮细胞癌、基底细胞癌、恶性黑色素瘤、隆突性皮纤维肉瘤、淋巴管肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、体表转移癌等。第六十页，共六十八页。【参考文献】【1】GatenbyRA，GillesRJWhydocancerhavehaghaerobicglycolysis?.NatRevCancer，2004,4（11）891-899【2】HiroshiKondon，CellularlifespanandtheWarburgeffect【J】.ExyCellRes，2008,314（9）1923-1928【3】 WuMian.P53regulatesbiosynthesisthrouthdirectinactivationofglucose-6-phosphateNatureCellBiology2011，（13）310-316【4】BasantaD，SimonM，DeutschA，etal.Evolutionarygametheoryelucidatestheroleofglycolysisingliamaprogresionandinvasion【J】.Cellprolif，2008，41（6）：980-987【5】YeungSJ，PanJ，LeeMH.Rolesofp53，MycandHIF-Iinregulationglycolysis—theseverthhallmaekofcancer【J】.CellMoilifeSci，2008，65（24）：3981-3999【6】BandV，KarinM.Signaltransductionbytumornecrosisfadorandisrelatives.YrendsCellBiol，2001,11:372-377【7】AshrafianH.Cancer,ssweettooth：Januseffectofglucosemetabolismintumonigenesis【J】.Lancet，2006，367（9510）618-621【8】SemenzaGL，RegulationofmammalianO2homeostasisbyhypoxia-mduciblefactor1AnnualReviewCellDevelopmentalBiology，1999:15:551第六十一页，共六十八页。【9】Guhaniyogi,J.andG.Brewer,RegulationofmRNAstabilityinmammaliancells.Gene,2001.265(1-2):p.11-23.【10】BensandK，TsurtaA，SajakMA，etal，TIGAR，ap53-inducibleregulatorofgdycolysisandapoptosis【J】，Cell，2006，126（1），107-120【11】KondonH，LleonartME，CilJ，etai，Glycolyticenzymescanmodulatecellularlifespan【J】，CancerRes，2005，65（1）：177-185【12】黄耿文,杨连粤.肿瘤细胞的缺氧信号传导通路.世界华人消化杂志2002;10(12):1441-1444【13】HausenioyDJ,YelionDM,Survivialkinasesinischemicpreconditioningandpostconditioning.CardivascularResearch,2006,70；240-253【14】KutalaVK，ParinandiNL，ZweierJL，KuppusamyP.ArchBiochemBiophys，2004，424：81-88【15】LeeMH，YangHY，ReguiationofG1cyclin-dependentkinasesandancers.CancerMetastasisRev.2003，22（4）：435-449【16】吴伟康：细胞增殖、分化、凋亡异常与疾病(jíbìng)，见：陈主初，主编，病理生理学北京：人民卫生出版社，2005,15-33【17】LoyerP，TrembleyJH，KiddVJ，LahtiJM.RoleofCDK/cyclincompiexesintranscriptionandRNAspicing.CellSignal，2005,17（9）；1033-1051第六十二页，共六十八页。【18】YamashitaYM,JonesDL,FullerMT.OrientationofasymmetricstemcelldivisionbytheAPCtumorsuppressorandcentrosome[J].Science.2003,301(5639):1547-50.【19】DlugoszA,MerlinoG,YuspaSH.Progressincutaneouscancerresearch[J].JInvestigDermatolSympProc.2002,7(1):17-26.【20】YuspaSH.Thepathogenesisofsquamouscellcancer:lessonslearnedfromstudiesofskincarcinogenesis--thirty-thirdG.H.A.ClowesMemorialAwardLecture[J].CancerRes.1994,54(5):1178-89.【21】CahillDP,KinzlerKW,VogelsteinB,et.al.Geneticinstabilityanddarwinianselectionintumours[J].TrendsCellBiol.1999,9(12):M57-60。【22】PihanG,DoxseySJ.Mutationsandaneuploidy:co-conspiratorsincancer[J]?CancerCell.2003,4(2):89-94.【23】CairnsJ.Somaticstemcellsandthekineticsofmutagenesisandcarcinogenesis[J].ProcNatlAcadSciUSA.2002,99(16):10567-70.【24】CohenSM,EllweinLB.Geneticerrors,cellproliferation,andcarcinogenesis[J].CancerRes.1991,51(24):6493-505.【25】Preston-MartinS,PikeMC,RossRK,et.al.Increasedcelldivisionasacauseofhumancancer[J].CancerRes.1990,50(23):7415-21.【26】CohenSM,EllweinLB.Cellproliferationincarcinogenesis[J].Science.1990,249(4972):1007-11.第六十三页，共六十八页。【27】CohenSM.Roleofcellproliferationinregenerativeandneoplasticdisease[J].ToxicolLett.1995,82-83:15-21.【28】AmesBN,GoldLS.Re:E.Farber,Cellproliferationasamajorriskfactorforcancer:aconceptofdoubtfulvalidity[J].CancerRes.,55:3759-3762,1995.CancerRes.1996,56(18):4267-9;authorreply4272-4.【29】SuraniMA.Reprogrammingofgenomefunctionthroughepigeneticinheritance[J].Nature.2001,414(6859):122-8.【30】Ferguson-SmithAC,SuraniMA.Imprintingandtheepigeneticasymmetrybetweenparentalgenomes[J].Science.2001,293(5532):1086-9.【31】Chakhp