低氧诱导因子

低氧诱导因子（HIF-1）及相关因子在缺血性卒中的作用摘要：低氧是脑血管疾病发病过程中一个重要的病理生理因素，尤其在缺血性卒中过程中起着非常重要的作用。低氧是在卒中过程中低氧应答时基因表达和恢复内环境平衡的调节中心。低氧诱导因子（HIF-1）对缺血坏死后新生血管的形成和低氧诱导的细胞凋亡过程都是非常关键的因素。调控低氧诱导因子（HIF-1）水平将为缺血性疾病的治疗开辟新的途径。关键词：低氧低氧诱导因子（HIF-1）卒中Abstract:lowoxygeniscerebrovasculardiseaseprocessisanimportantpathophysiologicalfactors,especiallyintheprocessofischemicstrokeplaysaveryimportantrole.Intheprocessoflowoxygenislowoxygenwhenansweringstrokegeneexpressionandrestorethebalanceinenvironmentalregulationcenter.Hypoxia-induciblefactor（HIF-1）forischemiaaftertheformationofnewbloodvesselsnecrosiswithlowoxygenapoptosisinducedprocessisverycrucialfactors.ControlHIF（HIF-1）levelforthetreatmentofischemicdiseaseswillopenanewway.Keywords:lowoxygenHIF（HIF-1）stroke1992年semenza在人的HEP3B细胞株的核提取物中发现一种蛋白质，这种蛋白能特异性地结合于红细胞生成物（EPO）基因增强子的寡核苷酸序列，这种蛋白即被命名为低氧诱导因子（HIF-1），随着对其研究的不断深入，在实验中发现其与缺血/低氧状态下机体的各种应答机制关系密切。【1】但目前由于受实验条件等各种原因的限制，低氧诱导因子（HIF-1）在缺血性脑血管卒中的研究中还处于起步阶段。本文即对其和其他相关因子在缺血性脑血管卒中的发病机制中的作用作一概括总结。低氧诱导因子（HIF-1）的结构基础与低氧应答的相关机制HIF-1的结构HIF-1是由一个120KD的a亚单位和一个91-94KD的8亚单位构成，特点是一个异构二聚体，两个亚单位均为碱性螺旋-环-螺旋蛋白，且含有PAS结构域【2】，属于bHLH-PAS超家族的成员。其中HIF-1a是HIF-1的特异性蛋白，HIF-18是ARNT的基因产物，HIF-1的活性分以下几个层次:HIF-1mRNA表达水平调节，蛋白表达水平调节，HIF-1的二聚化，以及DNA结合活性调节，HIF-1a的转录活性调节。常氧下HIF-1无DNA结合活性，但低氧可诱导HIF-1a蛋白水平和HIF-1DNA结合活性的增加，但HIF-18不受低氧诱导。HIF-1活性的调控HIF-1和HIF-1a是受细胞氧浓度的精确调节，HIF-1a是HIF-1的活性亚基，又是氧调节亚基。在非低氧条件下HIF-1a被泛素-蛋白酶体所降解，而低氧可使HIF-1a迅速积累，然后与HIF-18结合，形成二聚体【3,4】。HIF-18的蛋白表达是非氧依赖性的，可以在细胞内持续表达。此外HIF-1的活性还受多种因子的调节，如白细胞介素18，肿瘤坏死因子（TNF）,NO等因子的调节。Bergeron等通过对新生大鼠脑缺氧预处理3h发现，缺氧预处理可明显提高HIF-1a和HIF-18的表达水平，从而保护新生大鼠脑组织免受缺血/缺氧损伤【】，提示这种脑保护的机制可能是通过缺氧处理后导致脑组织HIF-1表达增高而实现。Ran等在成年大鼠持续性脑局灶缺血前24h给予正常压力缺氧3h,可迅速提高HIF的含量及其靶基因EPO、血管内皮细胞生长因子（vascularendothelialgrowthfactors,VEGF）、诱生型一氧化氮合酶（induciblenitriosynthesizeenzyme,iNOS）、糖酵解酶的mRNA水平;持续6h缺氧,24h后可上调EPO和VEGF在蛋白水平的表达【】。1.3靶基因及其生物学效应HIF-1可与含有低氧反应元件和顺式作用转录调节序列的靶基因结合，从而激活靶基因的转录。迄今发现HIF-1的靶基因有几十个，可以诱导多种酶的表达，每种酶分别在器官、组织、细胞水平的低氧适应反应过程中起重要作用：如EPO刺激红细胞再生以提高机体血液携氧能力；转铁蛋白为血红素合成提供铁原料；VEGF、FLT-1、ANGII等影响血管新生。iNOS、血红素氧合酶(HO1)用于合成NO和CO,从而影响血管紧张度或参与缺血预适应第二窗口期的组织保护作用；Clutl、Glut3、LDH-A、醛缩酶、烯醇化酶、胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)等多种酶可促进糖酵解从而增加ATP产量；凋亡前基因NiP3【5】影响细胞凋亡因子P53；铜蓝蛋白参与应急炎性反应等。1.4低氧诱导因子(HIF-1a)与脑缺氧损伤大脑对低氧十分敏感，任何氧浓度降低的情况均可能诱导HIF-1的快速大量表达，HIF-1a神经元的出现在时间上要早于神经元形态改变。急性缺氧后4小时开始出现HIF-a的表达，8小时后逐渐减少，24小时后不能检测到。慢性缺养状态下，3〜4周后出现大量HIF-1a缺血再灌注阳性的神经元。在大鼠短暂性全脑缺血模型中，用免疫印迹(Westernblot)法和免疫细化学分析方法监测发现，缺血 15分钟后，大脑皮质和海马有HIF-1mRNA和VEGFmRNA在同一神经元的表达，在4〜72小时再灌注期间持续表达【6】。在线栓大脑中动脉(multi-conjugateadaptiveoptics，MCAO)局灶脑缺血模型中发现HIF-1在梗死边缘和扣带区皮质表达，其靶基因也在此区域表达，包括葡萄糖转运体蛋白1(glucosetransporterin-1，GLUT-1)、乳酸脱氢酶(1actatedehydrogenase，LDH)、磷酸果糖激酶等。梗死区外凡有血流量下降的区域均出现HIF-1表达，提示脑缺血后HIF-1a表达区域可认为是梗死区周围慢性缺氧的区域。可见HIF-1在缺血性卒中过程中起着一定的负反应作用。低氧诱导因子(HIF-1)的脑保护作用机制2.1低氧诱导因子(HIF-1)对血管内皮生长因子的生物学调节VEGF是一种由二硫键连接的、相对分子质量为36X10〜42X10的糖蛋白二聚体，其对缺血再灌注组织的保护作用主要通过以下几个途径：2.1.1促进内皮细胞的增殖和血管的生成VEGF是一种内皮细胞特有的有丝分裂原，VEGF及其受体在HIF-1的刺激下表达增多。VEGF可以通过其特异性受体Flt-1与flk-1/KDR直接作用于血管内皮细胞刺激其增殖，促使血管形成，改善局部血供。在这里VEGF促进血管生成的方式为血管新生，有别于胚胎发育时的血管发生。VEGF不仅贯穿血管新生的整个过程,而且它还能在内皮细胞中诱导抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，抑制凋亡蛋白caspase-3的表达，维持内皮细胞的生存。此外VEGF还能刺激内皮细胞的迁移，对减轻内皮增厚，防止血管再狭窄有重要意义。2.1.2增加血管通透性VEGF又被称为血管通透因子，它增加血管通透性的作用十分强烈，尤其是微小血管。使血浆大分子外渗沉积在血管外的基质中，为细胞的生长和新生毛细管的建立提供营养。其作用机制为VEGF与Flt-1受体结合，可使NO产生增加，NO可激活环氧化酶进而可促进前列环素的产生，后者可使血管通透性增加，促进许多血浆蛋白渗出血管外，故有学者认为VEGF可能导致缺血再灌注组织水肿，导致组织损伤，但有实验证明VEGF使血管通透性增加，促进血浆蛋白外渗的作用要早于缺血再灌注后的组织水肿，故可认为VEGF不直接导致组织水肿。相反，有研究表明VEGF可以通过保护内皮细胞进而保护血脑屏障来减轻脑水肿。2.1.3对神经系统的保护作用目前研究比较多的是关于VEGF在脑缺血再灌注中的保护作用，许多试验表明VEGF对神经组织有直接的保护作用。VEGF还可以刺激神经元轴突生长，促进胶质细胞分裂、迁移、存活，另外还有促进神经再生的作用。综上VEGF是HIF-1的一个重要靶基因，也是血管生成的主要调节因子。脑缺血后，HIF-1使VEGF表达增加，促进了微循环重建，增加缺血组织血流灌注和供氧量，加快脑缺血缺氧的恢复过程【7】。VEGF基因的表达虽受多种因子的调控，但缺氧是其最主要的调节因素。缺氧时HIF-1通过与VEGF基因5’端的缺氧反应元件(hypoxiaresponseelement，HRE)结合，提高其转录。缺氧时HIF-1a仅积聚，并且DNA结合活性增加，HIF-1a仅与VEGF基因的HRE结合后，促进了VEGF的转录和表达，并增加缺氧情况下VEGFmRNA的稳定性，VEGF进而作用于存在血管内皮细胞表面的血管内皮生长因子受体1(VEGFR-1)和血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)，从而激活了一系列的缺血转导通路，诱导新生血管的生成。缺乏HRE启动子的VEGF基因在低氧时表达并不增高，致使新生的血管减少，运动神经元变性增加，说明VEGF的上调是通过HIF-1作用实现的。在缺氧反应的过程中，VEGFmRNA的稳定性起着关键作用。VEGFmRNA的半衰期在正常条件下较短，约为30分钟，但在缺氧条件下可增加到6〜8小时，这说明VEGF在缺氧条件下受HIF-1的调节不仅发生在转录水平，同时也发生在转录后的水平。激活的HIF-1促使VEGF和VEGF受体表达增加，刺激缺氧组织建立有效的侧支循环，并恢复内皮细胞的完整性，发挥自身搭桥作用，诱导新生血管形成，并使新生血管从正常组织向半暗带及缺血中心区延伸，增加受累脑组织再灌注及供氧量，从而减少脑的缺血再灌注损伤。通过基因或药物手段调节HIF-1的活性，可防止脑缺血【8】。2.2低氧诱导因子(HIF-1)作用于促红细胞生成素而发挥脑保护作用EPO是一种相对分子质量为30X10〜39X10的糖蛋白，主要来源于肾小管问质细胞和肝实质细胞。HIF-1作用于EPO3'端的启动子，促进EPO的转录。EPO对缺血再灌注组织的保护作用主要有以下几个方面：2.2.1EPO经典的作用是作用于骨髓巨核前体细胞,刺激红祖细胞及早幼红细胞形成成熟的红细胞集落并释放进入血液，提高血液内红细胞数量及携氧量。2.2.2EPO与细胞凋亡：目前认为抗凋亡作用可能是EPO对组织器官缺血再灌注保护作用的重要机制，根据目前的研究，其机制为：EPO与其受体EPOR结合，并启动细胞内的信号传导机制，增加抗凋亡蛋白的表达，发挥抗凋亡作用。另外，EPO还可降低血中有促进凋亡作用的细胞因子。研究表明EPO-EPOR的细胞内信号传导机制具有组织特异性，在不同的细胞及组织中不尽相同【21.22】。2.2.3EPO对血管的保护：EPO对血管的保护作用不仅是保持内皮细胞的完整性，更重要的是EPO还能促进血管新生。EPO在体内、体外都有促血管生成作用，且与VEGF有相似的成血管潜能。EPO能通过促进血管内皮细胞增生、分化、迁移，来介导血管生成从而对维持和重建血供，促进损伤修复有重要意义。另外，根据研究，EPO在体内促血管生成作用可能部分与促进骨髓内皮起源细胞(EPC)迁移至成血管处分化为血管有关.。2.2.4此外，EPO可以通过上调抗氧化酶的表达及下调氧自由基的生成发挥其抗氧化作用。EPO还可以抑制许多致炎因子的释放，从而减轻炎性细胞的浸润，发挥对缺血再灌注组织的保护作用。另外，在神经组织中EPO还可抑制谷氨酸的释放，减轻谷氨酸与N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体结合，介导的钙钠通道开放，大量持续的钙内流可以引起神经元坏死。根据目前的研究，EPO抑制谷氨酸释放的机制可能为抑制谷氨酸的转录与翻译。低氧条件下激活的HIF-1能诱导脑源性的EPO生成，其与血源性EPO比较，产生的量少，但具有更高的活性，脑源性EPO对缺血导致神经细胞损伤有重要的保护作用。其机制如下：①抗炎症作用。小胶质细胞激活后可上调多种表面受体，释放大量重要的促炎症因子。EPO通过调节小胶质细胞激活以及控制细胞因子的释放，从而维持细胞内环境的稳定。此外，EPO通过抑制一些促炎因子，如白细胞介素_6(IL-6)、TNF-a和单核细胞化学趋化因子蛋白-1的产生以及抑制炎症细胞聚集而直接参与细胞炎症反应【9】。在脑和脊髓的创伤和缺血损伤以及多发性硬化模型中，EPO的抗炎作用已得到验证。细胞死亡有炎性坏死和细胞凋亡两种方式。EPO对神经的保护作用在于对这两种方式的阻断，神经细胞EPO受体被激活后通过干扰非受体型酪氨酸激酶(janus-aminotyrosinekinase-2，JAK-2)和核转录因子-KB(NF-KB)，能防止N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)和NO诱导的凋亡。EPO在体内和体外的多种神经细胞损伤模型中均有抗凋亡作用【10】；②维持血管完整性、促进血管生成。在损伤过程中EPO可阻止血脑屏障通透性的增加，维持细胞与细胞之间连接的建立。EPO对大脑血管内皮细胞提供直接保护，并可防止氧化应激下的核变性。EPO还能促成新的毛细血管生成，并向无血管区域延伸，EPO能诱导内皮细胞基质金属蛋白酶-2的生成、细胞增殖和血管形成。由EPO诱导的血管生成也可在中枢神经系统提供间接的细胞保护作用。由EPO诱导的血管生成也可为中枢神经系统提供间接的细胞保护作用。EPO能促进缺氧脑组织中毛细血管内皮细胞的增殖和迁移，这样会给缺血细胞提供更多的血流和营养；③促进神经祖系干细胞增殖与分化。EFO提高了胚胎皮质神经元的生存力，促细胞存活并可上调神经祖细胞的增殖反应。与其他造血因子一样，EPO也充当着分化细胞的神经营养因子，例如EPO可以影响细胞的再生、分化和存活，并诱导干细胞分化为多巴胺能神经元或星形胶质【11】；④抗兴奋性毒性作用和抗NO介导的损伤。脑缺氧时神经元产生大量HIF-1导致脑损伤，而同时HIF-1上调EPO基因的表达，激活的促红细胞生成素受体(EPOR)阻止了NMDA导致的细胞凋亡。在大鼠海马和大脑皮质神经元的原代培养中，EPO不能抑制NMDA受体介导的细胞内钙离子浓度的升高，但可阻止NO诱导的神经元死亡。最近的研究显示：NO能诱导神经细胞培养物中EPOR的表达，从而通过这种方式支持EPO的神经保护作用【12】。2.3血红素氧合酶-1(HO-1)EdaTtiztiner等人的研究认为，HO-1对缺血再灌注组织的保护作用主要与其能降解亚铁血红素有关。亚铁血红素为HO-1的底物，是有毒的物质，能够引起铁的释放、启动Haber-Weiss或/和Fenton反应，导致细胞损伤。HO-1可以将亚铁血红素转化为三种生物活性物质：一氧化碳、胆绿素、二价铁离子。其中一氧化碳可以通过上调cGMP来调节血管的紧张度，使血管平滑肌松弛，抑制血小板凝聚，从而增加血流量和血管通透性，使缺氧组织得到充足的氧气供应。目前已有实验证明加入外源性的一氧化碳，可以模拟HO-1的保护作用；胆绿素可以被胆绿素还原酶进步转化为胆红素，而胆红素是众所周知的强抗氧化剂；二价铁可以与铁蛋白结合【13】。此外HO-1还能增加细胞对NO的耐受性，这对细胞也有保护作用，因为小剂量的NO可作为细胞内的重要调节因子，但大剂量的NO对细胞有毒性作用【14】。2.4诱导型一氧化氦合成酶(iNoS)在生物体内存在三种亚型的一氧化氮合成酶，分别是神经元型(nNOS)、内皮细胞型(eNOS)和诱导型(iNOS)。前两者在细胞内持续表达，其活性依赖于细胞内钙离子的水平，而iNOS主要是在病理的情况下受许多细胞因子诱导才表达的【15】。它可以使缺血缺氧组织内NO生成增多，参与缺血再灌注损伤的保护作用。研究表明NO主要参与缺血预处理的延迟性保护作用，又称第二窗保护作用(Secondwindowofprotection)，出现在组织短暂缺血24h后，并可延续至72h【16】。尽管有人认为，iNOS诱导产生大量NO对组织有损伤作用，但一氧化氮在缺血再灌注组织中的护作用也已证实【17】。NO可激活可溶性的鸟苷酸环化酶(sGC)、生成环磷酸鸟苷(cGMP)，即通过NO-sGC-cGMP信号传导途径介导一系列反应，如促进血管舒张、减轻细间黏附分子(ICAM)的聚集、抑制白细胞和血小板黏附和聚集、抗血栓形成、减轻无复流现象等【18】。试验也证明了无论内源性还是外源性的NO都可通过cGMP途径诱导心肌细胞预适应延迟保护作用。NO可通过PKC-NF-kB途径诱导HSP70蛋白表达而发挥对脑细胞的延迟保护作用。GangMinHur等人的研究表明核转录因子(NFkB)的激活可进一步促进iNOS的转录，使其蛋白表达增加，加速NO的生成，发挥持久的保护作用。NO可激活ATP依赖的钾离子通道(KATP)KATP通道开放后促进Ca2细胞外流，从而减轻Ca超载，并且KATP活化可逆转钙超载，防止肌质网和线粒体在缺血/再灌注时ca超载造成后续的一系列损伤。另外KATP通道的开放，有助于维持细胞内外的钾离子浓度，对保持细胞内外的离子平衡有重要作用°KATP通道的开放还可以引起血管平滑肌细胞超极化，阻碍肌肉收缩所必需的Ca内流，从而最终引起血管扩张，血流量增加。这对缺血再灌注损伤具有保护作用。2.5，目前,常氧条件下细胞因子IL-1对HIF-1的表达调控逐渐成为研究热点，且对其分机制的研究取得了一定成果°Stiehl等［4］的实验表明,常氧条件下胰岛素和IL-lp通过磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)途径对HIF-la进行调节。Hellwig-Burgel等［5］的研究进一步证实了这一点，他们发现抑制原代培养的人类肾脏近端小管细胞中的PI3K能够阻断IL-lp诱导的HIF-la蛋白蓄积。Haddad等［6］提出重组的人类IL-lp可参与调节HIF-la的稳定性、核转位，及其依赖于抗氧化剂/活性氧敏感机制的活化,可见非低氧途径介导了细胞因子对HIF-la的调节作用。Jung等［7］在人肺腺癌细胞株A549中发现,IL-lp通过两条途径提高细胞内HIF-la水平。首先,IL-lP促进HIF-la的生成需要通过依赖于PI3K/Akt(蛋白激酶B)/mTOR途径NF-KB(nuclearfactor-KB)的活化。其次IL-lP抑制HIF-la的降解。同时证实了IL-lP介导HIF-la的上调是通过NF-kB/COX-2(环氧合酶-2)通路。NF-kB是调节基因编码细胞因子的一个重要因子。进一步研究发现,常氧下IL-lp通过ERKl/2途径诱导正常人类滋养层细胞中HIF-la的表达［8］。IL-l调节HIF-la表达的具体分子机制及所依赖的信号途径还有待于深入研究。6TNF-a对HIF-l的调节TNF-a与IL-lp类似，能够增强HIF-l的DNA结合活性［l］。Haddad等［6,9］报道,在肺泡上皮细胞活性氧(ROS)敏感途径介导了TNF-a对HIF-a的调节。在常氧下，TNF-a可促进HIF-la的转位，并增强其转录活性。他们在分析TNF-a作用方式时观察到H2O2,O2-•,•OH等氧自由基的积累。所有形式的活性氧均与HIF-la的活性成正相关。应用抗氧化剂清除过氧化氢和羟自由基可阻断TNF-a对HIF-la的活化，通过清除氧自由基阻滞NADPH(reducedformofnicotin-amide-adeninedinucleotidephosphate,还原型辅酶II)-氧化酶也会降低HIF-la的活性。抑制线粒体复合物l可以消除TNF-a对HIF-la的活化作用，同时干扰呼吸链也会逆转TNF-a对HIF-la的兴奋作用。由此显示，活性氧族在介导TNF-a对HIF-a的活化过程中有重要作用,至于其具体的作用途径还不明确。Zhou等［l0］研究发现,与经典的低氧诱导途径不同,TNF-a通过NF-kB依赖途径可诱导HIF-la泛素化，从而引起其与pVHL(肿瘤抑制蛋白)的相互作用。在HepG2细胞中,TNF-a能活化HIF-l,并且伴有经典低氧反应基因的表达上调，这说明泛素化的HIF-la也具有转录调节活性。该实验结果与前面所述的活性氧族敏感途径并不矛盾,因为活性氧能作用于IKB激酶，从而影响NF-KB的活性。并且，他们进一步研究发现，在近端小管LLC-PKl细胞中TNF-a通过NF-kB,PI3K,MAPK途径增强Bcl-2的表达，而高度表达的Bcl-2能够促进HIF-lamRNA翻译，最终导致HIF-la蛋白表达增加［ll］。Jung等［l2］则表明常氧条件下，TNF-a诱导细胞内HIF-la蛋白的积聚依赖于RIP(receptor-interactingprotein)途径。有趣的是，尽管TNF-a对HIF-la的mRNA水平没有影响，但用转录抑制放线菌素D预先处理细胞后却能阻断TNF-a对HIF-la蛋白的上调作用，而且pVHL基因的缺失也会抑制该效应。综上所述,TNF-a对常氧细胞内HIF-la的诱导是在蛋白水平，但还有赖于NF-KB的转录调节。相反地,Peyssonnaux等［l3］提出在脓毒血症形成过程中,HIF-la能促进炎症细胞因子TNF-a的分泌。TNF-a和HIF-l可能存在一个正反馈环，有着相互促进作用。可见阐明其内在的分子机制对炎症的深入认识有重要的指导意义。展望HIF-l作为低氧信号转导途径中的关键因子，广泛参与多种神经系统疾病的发生和发展【20】，尤其在缺血性卒中的过程中起着非常重要的作用。对于HIF-l在缺血性脑血管病中的信号转导途径及其活性调节机制的阐明为缺血性脑血管病的治疗提供了新的靶点。对于HIF-l羟化过程中的酶如PHD,FHD,VHL等，以及底物如铁离子、2一酮戊二酸等，以及HIF-l与DNA的结合活性等进行干预，均可以改变HIF-1的转录活性，诱导或抑制HIF-1的活性，发挥治疗效果。由于HIF-1能够调控一系列靶基因的表达，因此，针对HIF-1的治疗可能远比针对单个靶基因的治疗可能会有更好的疗效。但同时，HIF有神经保护和促神经细胞凋亡的作用，它既可以参与致病，也可以抑制疾病的进一步发展。因此，我们在针对HIF-1进行治疗时，必须保持谨慎。对HIF-1进行干预的时间窗，以及进行干预的具体内容，诱导还是抑制，以及干预的持续时间、程度等都是有待进一步研究深入的问题。我们期待将HIF-1研究的成果尽快实施于临床。参考文献：1.GLsemenza，GL 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