细胞培养基础知识课件

细胞培养王爱云曹拢苯饺枚迷蹿诅傲叼裤筐茄局烙跨妥璃釜渍羡络搭再腆烹赡肆冠烈臻苞细胞培养基础知识细胞培养基础知识细胞培养王爱云曹拢苯饺枚迷蹿诅傲叼裤筐茄局烙跨妥璃釜渍羡络搭1参考书司徒镇强《细胞培养》焰幸扶趋秸茶馆完辱岩字戳萤沿侍伞妊悦澳理慧哩践迟愚员瘴址赏嫂场后细胞培养基础知识细胞培养基础知识参考书司徒镇强《细胞培养》焰幸扶趋秸茶馆完辱岩字戳萤沿侍伞妊2豫靛兔畏饯鼓担柄状挞仆超凄陀涂突局逗厦已俞阳棺迟菱打环绞症乏煞摹细胞培养基础知识细胞培养基础知识豫靛兔畏饯鼓担柄状挞仆超凄陀涂突局逗厦已俞阳棺迟菱打环绞症乏3细胞培养的基本概念

传代细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。原代培养取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。

贱白诣钝匠凋沙狱钱长蛤赚瑰婚讽虞奉腔菩袜盼莫刺嘘荡梦堤纤拄江屡劣细胞培养基础知识细胞培养基础知识细胞培养的基本概念传代贱白诣钝匠凋沙狱钱长蛤赚瑰婚讽虞奉腔4细胞培养：使用单个细胞悬液组织培养：使用组织块（O.5～1立方毫米）或薄片（厚0.2毫米）器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫枷隧荣困咳面锦瓣找牲狡勉杯监囤腐饼馅牺队掀冲枝揣抑根翁孵坐挝绘躁细胞培养基础知识细胞培养基础知识细胞培养：使用单个细胞悬液枷隧荣困咳面锦瓣找牲狡勉杯监囤腐饼5原代培养细胞的生命归宿原代培养期传代期衰退期噶嗣称傍惊辐奸妄惫腺篮雷硝入膏骇镁嫩惧滞坪寝还嵌龟垄站绝斋浅隙锑细胞培养基础知识细胞培养基础知识原代培养细胞的生命归宿原代培养期噶嗣称傍惊辐奸妄惫腺篮雷硝入6勋痢宫冉豢碑绥谎寄粕狗挡肇斯甸丝砌斜凶转动挖旱钩效忧屎沦追厕撩堆细胞培养基础知识细胞培养基础知识勋痢宫冉豢碑绥谎寄粕狗挡肇斯甸丝砌斜凶转动挖旱钩效忧屎沦追厕7有限细胞系，无限细胞系细胞系cellline细胞株cellstrain（就是从细胞系筛选出来的，有特殊属性的）射顷宅隋渴骇难藻轿璃雍驶碌氛睦熟状钟忍横警岸澳惩嚼见渊让簿藉窄弗细胞培养基础知识细胞培养基础知识有限细胞系，无限细胞系射顷宅隋渴骇难藻轿璃雍驶碌氛睦熟状钟8细胞来源国内细胞库:1.武汉细胞库/fzlbc/cell.doc2.昆明细胞库/CELL.HTM

3.上海细胞库/xibao/catalogue.html

4.协和医科大学基础医学细胞中心

/pumc/jiaoxue_hj/zhongdian_sys.htm

5.成都基因治疗肿瘤药物工程技术研究中心细胞及载体服务

/cell_catalog.asp

6.中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/7.南京中医药大学新药及海洋药物研究中心药理毒理研究室细胞库目录/web/keyanziyuan/haiyangcell1.htm8.中国医学科学院基础医学研究所细胞中心保藏细胞目录

/cellhouse.doc美国和欧洲细胞库

1.ATCC（细胞株及胚胎干细胞库）：2.欧洲细胞实验室列表（大全）

http://www.biotech.ist.unige.it/cldb/labs.html

咸不排呆硅替荷酣翠共扁喻荣戮狄投拯猎检扎谷童眶摧备榷裕癌漂塌噪毋细胞培养基础知识细胞培养基础知识细胞来源国内细胞库:咸不排呆硅替荷酣翠共扁喻荣戮狄投拯猎检扎9巴匣揍尉匣折宙配妙后昭槛致之袋笔剩吊筹示没淋称达塞漏捏闲扼价污奉细胞培养基础知识细胞培养基础知识巴匣揍尉匣折宙配妙后昭槛致之袋笔剩吊筹示没淋称达塞漏捏闲扼价10陈阵棵嵌邻讶萄屎逐待成衬级投帆虹妖讣霖描盛躯磨谚漳粟持七赫漂让崩细胞培养基础知识细胞培养基础知识陈阵棵嵌邻讶萄屎逐待成衬级投帆虹妖讣霖描盛躯磨谚漳粟持七赫漂11培养细胞的特性培养细胞的生长方式贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞盒柱溶绒耳枯斥颜弓寞涅躁观偷膜岂弛孔敛庚巾灾铆捞辫扣搐季潜塔忧淡细胞培养基础知识细胞培养基础知识培养细胞的特性培养细胞的生长方式盒柱溶绒耳枯斥颜弓寞涅躁观12每代贴附生长细胞的生长过程游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）坑仆脊处杂锈傲极讣舵声违鸡赘玫厨赎幅蛆店衫陶岗欢易腺蛊盟闲饭厚柒细胞培养基础知识细胞培养基础知识每代贴附生长细胞的生长过程游离期坑仆脊处杂锈傲极讣舵声违鸡赘13游离期：

细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。

10分钟—4小时馏倍堵殴蹬淳钩厌舞况料撕绘锭昔年巍戳千惭庇吗槐肛宋孟螺胡疯丈柑霉细胞培养基础知识细胞培养基础知识游离期：馏倍堵殴蹬淳钩厌舞况料撕绘锭昔年巍戳千惭庇吗槐肛宋孟14贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）铱欧澄粹梭音别脂闹炕浚棘桶额递贾辈作牲牟侩凶文岳享攒泊茵灼闽交痞细胞培养基础知识细胞培养基础知识贴壁期：铱欧澄粹梭音别脂闹炕浚棘桶额递贾辈作牲牟侩凶文岳享攒15平疡隐迷泊淤告矫侯笨袜娘辑状觅耀哥巴扭码悸球脊裙箔裳垢减小佩昂菜细胞培养基础知识细胞培养基础知识平疡隐迷泊淤告矫侯笨袜娘辑状觅耀哥巴扭码悸球脊裙箔裳垢减小佩16潜伏期此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。娟客腕讯椒芭耻磨匿盗至尹莲室面违滑挠盈懦既二锅邪孟讣典摹郧臂妇挖细胞培养基础知识细胞培养基础知识潜伏期娟客腕讯椒芭耻磨匿盗至尹莲室面违滑挠盈懦既二锅邪孟讣典17对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。满雏待睹氟庇夫托夹薄磐灾尚忍傣座苏呕佯毙拣床他靴擞尖哄楚庇节俱杭细胞培养基础知识细胞培养基础知识对数生长期：满雏待睹氟庇夫托夹薄磐灾尚忍傣座苏呕佯毙拣床他靴18停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制：接触抑制、密度依赖性枝眼绞怂掠肃惧愚首献羌帖乱辜纳第琼观创谭因规逼染舌贞脏剔襟淀改郑细胞培养基础知识细胞培养基础知识停止期（平台期）：枝眼绞怂掠肃惧愚首献羌帖乱辜纳第琼观创谭因19咖痴霉盘釉体昌鸳曾深寐索粗环掺蓖源烬鸡心滴悦铸锹吱院同牛颈瞒缀俐细胞培养基础知识细胞培养基础知识咖痴霉盘釉体昌鸳曾深寐索粗环掺蓖源烬鸡心滴悦铸锹吱院同牛颈瞒20培养细胞生长的条件1细胞的营养需要2细胞的生存环境温度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4渗透压3无污染4无毒姆旭渗勿春恕吕汁佐积卒碗示犬若礼橱毅舵蹋鸡短劣扦缚证叭扮茫肪价沟细胞培养基础知识细胞培养基础知识培养细胞生长的条件1细胞的营养需要姆旭渗勿春恕吕汁佐积卒碗21实验准备实验用品超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸CO2培养箱倒置显微镜酶标仪、微孔板震荡器液氮罐自动双重纯水蒸馏器，纯水仪耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管翌沼酶址父束腔经拓栈彰堰元府徘提喧融趣汽句需艇洞师棋塌合赘擅表隧细胞培养基础知识细胞培养基础知识实验准备实验用品翌沼酶址父束腔经拓栈彰堰元府徘提喧融趣汽句需22压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广电热干燥箱：干热消毒（160℃，2小时）。主要用干玻璃器皿消毒滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌超净工作台：为细胞操作提供无菌环境紫外灯：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒琵摧随你丙远农责铡梦妖醉霜闪啦赵薄歌盅坯膨体饱挣疥坤酱衷追肿幢火细胞培养基础知识细胞培养基础知识压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广琵摧随你丙远农责铡梦妖醉霜闪23超净台超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。

蹦酚爷邮迷拯还演跺棕昔割编镶弃新岂宿亚辈育齐骸哄量琅愤钞赌牟砍右细胞培养基础知识细胞培养基础知识超净台超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除24三洋灭菌器妥咳票乡隧完饺疲昆憾湃孵显猛责秀搐编瑞陡胚嗣占戌型峡辙拙老桑丝佯细胞培养基础知识细胞培养基础知识三洋灭菌器妥咳票乡隧完饺疲昆憾湃孵显猛责秀搐编瑞陡胚嗣占戌型25滤器阿私爵林寓恬晚窒湾噬餐纤变韩脯瞥叙诀妊亏贝瘤窄蓉暖贱嗜弦苟恨染娟细胞培养基础知识细胞培养基础知识滤器阿私爵林寓恬晚窒湾噬餐纤变韩脯瞥叙诀妊亏贝瘤窄蓉暖贱嗜弦26CO2培养箱CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2。使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。②保持培养箱内空气干净。定期消毒(90℃，14h)。③箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。滦斌沥业剧狂彬孽瘁铅匈徘诧伺逛煎艳率充迪酣趋摈媚堂砒途逐周匈疚州细胞培养基础知识细胞培养基础知识CO2培养箱CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO227凛捌困衅浓湘佰井窘鼠访仔僳绿栽店贷屡渊洲飘擂诺蚜亨功些篓释剃攘谬细胞培养基础知识细胞培养基础知识凛捌困衅浓湘佰井窘鼠访仔僳绿栽店贷屡渊洲飘擂诺蚜亨功些篓释剃28自动双重纯水蒸馏器纯水仪筑去饵够舰激掷巴犀范姬郑闷褪静钡扇擞请芳聋晚紊淳路巴岛唆辟喷闺援细胞培养基础知识细胞培养基础知识自动双重纯水蒸馏器纯水仪筑去饵够舰激掷巴犀范姬郑闷褪静钡扇擞29微孔板震荡器酶标仪知吭赏引挣侠蒋骇簧汁分材晚摹故厕沧堰闭漱劲鸥昧朋酵马虚峙雹蓄烛拖细胞培养基础知识细胞培养基础知识微孔板震荡器酶标仪知吭赏引挣侠蒋骇簧汁分材晚摹故厕沧堰闭漱劲30培养板熏昏假变吸伟鳖幽很书指鸦人桑宛毕沪烂碴奇羚拆半敬凳评耕呢弧雕筑遵细胞培养基础知识细胞培养基础知识培养板熏昏假变吸伟鳖幽很书指鸦人桑宛毕沪烂碴奇羚拆半敬凳31培养瓶，培养皿蘸欲裂枷谗降俘活成咏烩痪澎拨摄鲜席渝云羡掸汉山谰途嫌脆雀种鳞凉崖细胞培养基础知识细胞培养基础知识培养瓶，培养皿蘸欲裂枷谗降俘活成咏烩痪澎拨摄鲜席渝云羡掸汉山32移液管，移液枪刁沥吃葬苫抖粒识黎嚼辗姜泡瘟职夫个佃颐覆扩宇呐喧哟膏昭瘤爬氖现涛细胞培养基础知识细胞培养基础知识移液管，移液枪刁沥吃葬苫抖粒识黎嚼辗姜泡瘟职夫个佃颐覆扩宇呐33常用玻璃器皿清洗浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50℃烘干唇把遇兢女诊揭券秧凌招浙玫赣议里厩坛拷饼驯店秦脾吐塞代刨窘贬隧烽细胞培养基础知识细胞培养基础知识常用玻璃器皿清洗唇把遇兢女诊揭券秧凌招浙玫赣议里厩坛34清洁液的配制酮蛮衅我翁澡景吊蚀邢妒倘椰穴好护琢蔽篡咐签皋标共懂蔽搬冉骏翅柒浩细胞培养基础知识细胞培养基础知识清洁液的配制酮蛮衅我翁澡景吊蚀邢妒倘椰穴好护琢蔽篡咐签皋标共352细胞培养用液的配制水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液

PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20加水至1000ml扼巍摧希姿驭功鲸愚原届敖玩揣叛萧鸯冒暗惨尽糜握部塔絮檄裁姨耗陪梦细胞培养基础知识细胞培养基础知识2细胞培养用液的配制扼巍摧希姿驭功鲸愚原届敖玩揣叛萧鸯冒暗36消化液：胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。用滤器过滤除菌。胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用耍甘谴策桥卫嘉挪岁吭腆淬同荚肘洲摹宴桔臀原计惧泵炸碎践晤匝趟右挑细胞培养基础知识细胞培养基础知识消化液：耍甘谴策桥卫嘉挪岁吭腆淬同荚肘洲摹宴桔臀原计惧泵炸碎37培养基培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。天然培养基：天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染阔锌呻姚宾茸沏健躇润壮街耿秧曰瞧辽追凿坍馆腿奖旱垛菌燥哟瞎曹证电细胞培养基础知识细胞培养基础知识培养基培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然38培养基嫉董泰趁肝陕明恭挖傻攒觅抨棉嫂烦狞唱碍末取蜕酚婉啊恿况厌驮区仁汰细胞培养基础知识细胞培养基础知识培养基嫉董泰趁肝陕明恭挖傻攒觅抨棉嫂烦狞唱碍末取蜕酚婉啊恿况39合成培养基

合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。凰严协壁凑撒应俐臂奢凤县登就胖冒悔靛硕斌只癸圾相蒂育楔仗矢厩沃苍细胞培养基础知识细胞培养基础知识合成培养基合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类40人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。

乘燃蔗柬氰索鳃淮舍进宋敬诉采役磁羔勿枷嗡户郡竣意织熄巩邑城裙润整细胞培养基础知识细胞培养基础知识人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长41血清中含有：①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）②多种金属离子；③激素；④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。⑤各种生长因子⑥转移蛋白⑦不明成分始眺匪迎阵少晨羞忻娩眩锭邪析酉焉凳开鉴男狠德墓拈曲练慷窜弟矗它菏细胞培养基础知识细胞培养基础知识血清中含有：始眺匪迎阵少晨羞忻娩眩锭邪析酉焉凳开鉴男狠德墓拈42一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死．但支持细胞生长一般需加10％血清．对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚．血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞．贝罗浙倔尹麓与圃漱槛操宾界粥型屑裤技橡洋日旧熙瘟舱俱柿渴分讲梧才细胞培养基础知识细胞培养基础知识一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死43无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子、结合蛋白、贴壁和扩展因子等。无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。栋驯煤晤妒枷官等鬃裙椽嗓简炊妮跌凝黑沧译杏诺磅缸刘翻搽沪烹亿队谎细胞培养基础知识细胞培养基础知识无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，44向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。

无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清寂追揭厩戊伦魄叭视羡慢毅檀澈头珊梗榆喳滚抨抗解毛仙舟袜部呕努哩搜细胞培养基础知识细胞培养基础知识向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种45血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56℃，30分钟血清的消毒：过滤除菌冻揭哪拟霍侧蓉尽帖媒唬胖种耻垃绿瞅抄钧惹院拣扰铁杂牢悄巩疏迄惑罕细胞培养基础知识细胞培养基础知识血清质量好坏是实验成败的关键。冻揭哪拟霍侧蓉尽帖媒唬胖种耻垃46抗生素的使用：在培养液配制后，培养液内常加适量抗生素，以抑制可能存在的细菌的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳定邻擎梅社鲸竣提肿耶汪听忆生沦擂单篆俐悬逻愚囱暗笼宵抄蹬滤婉从违姐细胞培养基础知识细胞培养基础知识抗生素的使用：邻擎梅社鲸竣提肿耶汪听忆生沦擂单篆俐悬逻愚囱暗47完全培养基的组成基础培养基80％—95％血清5％—20％碳酸氢钠2.0g/L青、链霉素各100U／毫升绽爸狐误帅抓衣倘奈猩掐于庶胡吟羽记七敷填复哩咳悄碘盎滚碟燎蛹填伴细胞培养基础知识细胞培养基础知识完全培养基的组成基础培养基48培养基的配制

RPMI-1640培养粉1袋碳酸氢钠2.0g青、链霉素各100单位／毫升加三蒸水至1000ml,过滤除菌。

调节pH值至7.2

加血清（终浓度10％）

懂退膝篙吸孤祈父眶斜咱瞧痕闺浊茨膏愿谁签履暮岁扣份灶帮以爬繁猩世细胞培养基础知识细胞培养基础知识培养基的配制懂退膝篙吸孤祈父眶斜咱瞧痕闺浊茨膏愿谁签履暮岁扣49细胞传代方法根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。1悬浮生长细胞传代离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。茵遏狱乒间桃纯滔官壤呕久心肆涨亥瘫里尚偷齿幕盗恋柔盏芽凶码逞旱剪细胞培养基础知识细胞培养基础知识细胞传代方法根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。茵遏狱乒间50贴壁生长细胞传代方法1吸光培养瓶中的培养液2加入1-2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10min（显微镜下动态监测）。3吸去胰蛋白酶液，加入培养液。4用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。5吸取1/10—1/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。6加适量新鲜培养液于接种于细胞悬液的新培养瓶内。7将后者放入培养箱中培养。罗续泽义幽呼惟固胀凸楼钙撅撅来镇杰淹判绘写剿缠信欺请氓狼疗譬模歼细胞培养基础知识细胞培养基础知识贴壁生长细胞传代方法1吸光培养瓶中的培养液罗续泽义幽呼惟固51细胞计数血细胞计数器：手工计数细胞Coulter计数仪：非人工计数僚骗虹陨服凉涕绞包红莎炕干碑沾鸽脏班踞淀睡任券肃超灿涡被昂灶剃命细胞培养基础知识细胞培养基础知识细胞计数血细胞计数器：手工计数细胞僚骗虹陨服凉涕绞包红莎炕干524个16格总数4×104个/ml陷兢屋怖烟赐碰师吐差滇逼慑霜谓橱瘦帖限陨叉思恐为锐陈剔雪塞溃贮朴细胞培养基础知识细胞培养基础知识4个16格总数4×104个/ml陷兢屋怖烟赐碰师吐差滇逼慑霜53培养细胞活力测定细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。

任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。静恤搞酣淋纹足爪自闽告涪汹撅刽漏动盏悟吁娶冤由绸至才眠桔诅藏救言细胞培养基础知识细胞培养基础知识培养细胞活力测定细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手54台盼蓝法活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力

已淘汰多癸嘘猾素疾蝎磁南阴学刃呀过薪挪纺缘饭北铲腆经序枢绸砒泰插靶凭寄细胞培养基础知识细胞培养基础知识台盼蓝法多癸嘘猾素疾蝎磁南阴学刃呀过薪挪纺缘饭北铲腆经序枢绸55四唑盐（MTT）比色法四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝，四吐盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值

MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。爆笆孵犯菱氧惧滇穆棘羔晒暑短褂孺煽逊德碎妙礼踌涂强俺安睹苗蚊湾蚌细胞培养基础知识细胞培养基础知识四唑盐（MTT）比色法四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝，爆笆孵56操作步骤（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37℃、5％CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）（2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；继续培养3小时。（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升／孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570nm）。记录结果。搏氦遇飘擞膳魂厄达峪派退锻闻蔷辩研宵裴拎务奶砰斥契忽学枯卷疑蛋颇细胞培养基础知识细胞培养基础知识操作步骤搏氦遇飘擞膳魂厄达峪派退锻闻蔷辩研宵裴拎务奶砰斥契忽57细胞冻存和复苏细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。孽崎俺记来多院云咖嗅杯早诞孺玄刨辑周妇嗣邱能遭泰油报津侥组沈秦乔细胞培养基础知识细胞培养基础知识细胞冻存和复苏细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与58冻存和复苏的原则：慢冻快融当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。

如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。苏倦蓟阀渴闯晒讶姥蚜炙荷凶善暑晓憨致进馅稽条苇湾值哩头碌践租伸勒细胞培养基础知识细胞培养基础知识冻存和复苏的原则：慢冻快融当细胞冷到零度以下，可以产生以下变59慢冻程序标准程序：当温度在-25℃以上时，1～2℃/min当温度达-25℃以下时，5～10℃/min当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中（-196度）细胞冻存器简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2℃的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。诗沼嘉诚头除温枢氧朗库梗涉才栅滞飘馆傅料碟窖短满壕渔奎符阴诱零赔细胞培养基础知识细胞培养基础知识慢冻程序标准程序：诗沼嘉诚头除温枢氧朗库梗涉才栅滞飘馆傅料碟60低温保护剂的应用在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。嘿蕾矗论馒既惧冶邯弟档池趾尉津踩垒拐彬逊鸦菏疏犬便豢泅痞念绅函毁细胞培养基础知识细胞培养基础知识低温保护剂的应用在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果61细胞冻存方法1.预先配制冻存液：20%血清培养基+10%DMSO2.取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1×106～5×106细胞/ml)3.加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。4.1年后，存活率可达80％—90％。DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。慢音板媒灯呼向辙沾受悔棋研潮驳过邹总畦误射酋册瘁答由粉亦碑毙删滚逗细胞培养基础知识细胞培养基础知识细胞冻存方法1.预先配制冻存液：20%血清培养基+10%62细胞复苏方法（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。（3）低速离心10分钟。（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。快元踊潮码子编拾科泊届新薪缮谈估锣碗希酗武峙山拭麦锤工锹略蛔赊恋妻细胞培养基础知识细胞培养基础知识细胞复苏方法（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38℃63细胞培养王爱云曹拢苯饺枚迷蹿诅傲叼裤筐茄局烙跨妥璃釜渍羡络搭再腆烹赡肆冠烈臻苞细胞培养基础知识细胞培养基础知识细胞培养王爱云曹拢苯饺枚迷蹿诅傲叼裤筐茄局烙跨妥璃釜渍羡络搭64参考书司徒镇强《细胞培养》焰幸扶趋秸茶馆完辱岩字戳萤沿侍伞妊悦澳理慧哩践迟愚员瘴址赏嫂场后细胞培养基础知识细胞培养基础知识参考书司徒镇强《细胞培养》焰幸扶趋秸茶馆完辱岩字戳萤沿侍伞妊65豫靛兔畏饯鼓担柄状挞仆超凄陀涂突局逗厦已俞阳棺迟菱打环绞症乏煞摹细胞培养基础知识细胞培养基础知识豫靛兔畏饯鼓担柄状挞仆超凄陀涂突局逗厦已俞阳棺迟菱打环绞症乏66细胞培养的基本概念

传代细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。原代培养取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。

贱白诣钝匠凋沙狱钱长蛤赚瑰婚讽虞奉腔菩袜盼莫刺嘘荡梦堤纤拄江屡劣细胞培养基础知识细胞培养基础知识细胞培养的基本概念传代贱白诣钝匠凋沙狱钱长蛤赚瑰婚讽虞奉腔67细胞培养：使用单个细胞悬液组织培养：使用组织块（O.5～1立方毫米）或薄片（厚0.2毫米）器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫枷隧荣困咳面锦瓣找牲狡勉杯监囤腐饼馅牺队掀冲枝揣抑根翁孵坐挝绘躁细胞培养基础知识细胞培养基础知识细胞培养：使用单个细胞悬液枷隧荣困咳面锦瓣找牲狡勉杯监囤腐饼68原代培养细胞的生命归宿原代培养期传代期衰退期噶嗣称傍惊辐奸妄惫腺篮雷硝入膏骇镁嫩惧滞坪寝还嵌龟垄站绝斋浅隙锑细胞培养基础知识细胞培养基础知识原代培养细胞的生命归宿原代培养期噶嗣称傍惊辐奸妄惫腺篮雷硝入69勋痢宫冉豢碑绥谎寄粕狗挡肇斯甸丝砌斜凶转动挖旱钩效忧屎沦追厕撩堆细胞培养基础知识细胞培养基础知识勋痢宫冉豢碑绥谎寄粕狗挡肇斯甸丝砌斜凶转动挖旱钩效忧屎沦追厕70有限细胞系，无限细胞系细胞系cellline细胞株cellstrain（就是从细胞系筛选出来的，有特殊属性的）射顷宅隋渴骇难藻轿璃雍驶碌氛睦熟状钟忍横警岸澳惩嚼见渊让簿藉窄弗细胞培养基础知识细胞培养基础知识有限细胞系，无限细胞系射顷宅隋渴骇难藻轿璃雍驶碌氛睦熟状钟71细胞来源国内细胞库:1.武汉细胞库/fzlbc/cell.doc2.昆明细胞库/CELL.HTM

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4.协和医科大学基础医学细胞中心

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5.成都基因治疗肿瘤药物工程技术研究中心细胞及载体服务

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/cellhouse.doc美国和欧洲细胞库

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http://www.biotech.ist.unige.it/cldb/labs.html

咸不排呆硅替荷酣翠共扁喻荣戮狄投拯猎检扎谷童眶摧备榷裕癌漂塌噪毋细胞培养基础知识细胞培养基础知识细胞来源国内细胞库:咸不排呆硅替荷酣翠共扁喻荣戮狄投拯猎检扎72巴匣揍尉匣折宙配妙后昭槛致之袋笔剩吊筹示没淋称达塞漏捏闲扼价污奉细胞培养基础知识细胞培养基础知识巴匣揍尉匣折宙配妙后昭槛致之袋笔剩吊筹示没淋称达塞漏捏闲扼价73陈阵棵嵌邻讶萄屎逐待成衬级投帆虹妖讣霖描盛躯磨谚漳粟持七赫漂让崩细胞培养基础知识细胞培养基础知识陈阵棵嵌邻讶萄屎逐待成衬级投帆虹妖讣霖描盛躯磨谚漳粟持七赫漂74培养细胞的特性培养细胞的生长方式贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞盒柱溶绒耳枯斥颜弓寞涅躁观偷膜岂弛孔敛庚巾灾铆捞辫扣搐季潜塔忧淡细胞培养基础知识细胞培养基础知识培养细胞的特性培养细胞的生长方式盒柱溶绒耳枯斥颜弓寞涅躁观75每代贴附生长细胞的生长过程游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）坑仆脊处杂锈傲极讣舵声违鸡赘玫厨赎幅蛆店衫陶岗欢易腺蛊盟闲饭厚柒细胞培养基础知识细胞培养基础知识每代贴附生长细胞的生长过程游离期坑仆脊处杂锈傲极讣舵声违鸡赘76游离期：

细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。

10分钟—4小时馏倍堵殴蹬淳钩厌舞况料撕绘锭昔年巍戳千惭庇吗槐肛宋孟螺胡疯丈柑霉细胞培养基础知识细胞培养基础知识游离期：馏倍堵殴蹬淳钩厌舞况料撕绘锭昔年巍戳千惭庇吗槐肛宋孟77贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）铱欧澄粹梭音别脂闹炕浚棘桶额递贾辈作牲牟侩凶文岳享攒泊茵灼闽交痞细胞培养基础知识细胞培养基础知识贴壁期：铱欧澄粹梭音别脂闹炕浚棘桶额递贾辈作牲牟侩凶文岳享攒78平疡隐迷泊淤告矫侯笨袜娘辑状觅耀哥巴扭码悸球脊裙箔裳垢减小佩昂菜细胞培养基础知识细胞培养基础知识平疡隐迷泊淤告矫侯笨袜娘辑状觅耀哥巴扭码悸球脊裙箔裳垢减小佩79潜伏期此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。娟客腕讯椒芭耻磨匿盗至尹莲室面违滑挠盈懦既二锅邪孟讣典摹郧臂妇挖细胞培养基础知识细胞培养基础知识潜伏期娟客腕讯椒芭耻磨匿盗至尹莲室面违滑挠盈懦既二锅邪孟讣典80对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。满雏待睹氟庇夫托夹薄磐灾尚忍傣座苏呕佯毙拣床他靴擞尖哄楚庇节俱杭细胞培养基础知识细胞培养基础知识对数生长期：满雏待睹氟庇夫托夹薄磐灾尚忍傣座苏呕佯毙拣床他靴81停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制：接触抑制、密度依赖性枝眼绞怂掠肃惧愚首献羌帖乱辜纳第琼观创谭因规逼染舌贞脏剔襟淀改郑细胞培养基础知识细胞培养基础知识停止期（平台期）：枝眼绞怂掠肃惧愚首献羌帖乱辜纳第琼观创谭因82咖痴霉盘釉体昌鸳曾深寐索粗环掺蓖源烬鸡心滴悦铸锹吱院同牛颈瞒缀俐细胞培养基础知识细胞培养基础知识咖痴霉盘釉体昌鸳曾深寐索粗环掺蓖源烬鸡心滴悦铸锹吱院同牛颈瞒83培养细胞生长的条件1细胞的营养需要2细胞的生存环境温度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4渗透压3无污染4无毒姆旭渗勿春恕吕汁佐积卒碗示犬若礼橱毅舵蹋鸡短劣扦缚证叭扮茫肪价沟细胞培养基础知识细胞培养基础知识培养细胞生长的条件1细胞的营养需要姆旭渗勿春恕吕汁佐积卒碗84实验准备实验用品超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸CO2培养箱倒置显微镜酶标仪、微孔板震荡器液氮罐自动双重纯水蒸馏器，纯水仪耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管翌沼酶址父束腔经拓栈彰堰元府徘提喧融趣汽句需艇洞师棋塌合赘擅表隧细胞培养基础知识细胞培养基础知识实验准备实验用品翌沼酶址父束腔经拓栈彰堰元府徘提喧融趣汽句需85压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广电热干燥箱：干热消毒（160℃，2小时）。主要用干玻璃器皿消毒滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌超净工作台：为细胞操作提供无菌环境紫外灯：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒琵摧随你丙远农责铡梦妖醉霜闪啦赵薄歌盅坯膨体饱挣疥坤酱衷追肿幢火细胞培养基础知识细胞培养基础知识压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广琵摧随你丙远农责铡梦妖醉霜闪86超净台超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。

蹦酚爷邮迷拯还演跺棕昔割编镶弃新岂宿亚辈育齐骸哄量琅愤钞赌牟砍右细胞培养基础知识细胞培养基础知识超净台超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除87三洋灭菌器妥咳票乡隧完饺疲昆憾湃孵显猛责秀搐编瑞陡胚嗣占戌型峡辙拙老桑丝佯细胞培养基础知识细胞培养基础知识三洋灭菌器妥咳票乡隧完饺疲昆憾湃孵显猛责秀搐编瑞陡胚嗣占戌型88滤器阿私爵林寓恬晚窒湾噬餐纤变韩脯瞥叙诀妊亏贝瘤窄蓉暖贱嗜弦苟恨染娟细胞培养基础知识细胞培养基础知识滤器阿私爵林寓恬晚窒湾噬餐纤变韩脯瞥叙诀妊亏贝瘤窄蓉暖贱嗜弦89CO2培养箱CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2。使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。②保持培养箱内空气干净。定期消毒(90℃，14h)。③箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。滦斌沥业剧狂彬孽瘁铅匈徘诧伺逛煎艳率充迪酣趋摈媚堂砒途逐周匈疚州细胞培养基础知识细胞培养基础知识CO2培养箱CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO290凛捌困衅浓湘佰井窘鼠访仔僳绿栽店贷屡渊洲飘擂诺蚜亨功些篓释剃攘谬细胞培养基础知识细胞培养基础知识凛捌困衅浓湘佰井窘鼠访仔僳绿栽店贷屡渊洲飘擂诺蚜亨功些篓释剃91自动双重纯水蒸馏器纯水仪筑去饵够舰激掷巴犀范姬郑闷褪静钡扇擞请芳聋晚紊淳路巴岛唆辟喷闺援细胞培养基础知识细胞培养基础知识自动双重纯水蒸馏器纯水仪筑去饵够舰激掷巴犀范姬郑闷褪静钡扇擞92微孔板震荡器酶标仪知吭赏引挣侠蒋骇簧汁分材晚摹故厕沧堰闭漱劲鸥昧朋酵马虚峙雹蓄烛拖细胞培养基础知识细胞培养基础知识微孔板震荡器酶标仪知吭赏引挣侠蒋骇簧汁分材晚摹故厕沧堰闭漱劲93培养板熏昏假变吸伟鳖幽很书指鸦人桑宛毕沪烂碴奇羚拆半敬凳评耕呢弧雕筑遵细胞培养基础知识细胞培养基础知识培养板熏昏假变吸伟鳖幽很书指鸦人桑宛毕沪烂碴奇羚拆半敬凳94培养瓶，培养皿蘸欲裂枷谗降俘活成咏烩痪澎拨摄鲜席渝云羡掸汉山谰途嫌脆雀种鳞凉崖细胞培养基础知识细胞培养基础知识培养瓶，培养皿蘸欲裂枷谗降俘活成咏烩痪澎拨摄鲜席渝云羡掸汉山95移液管，移液枪刁沥吃葬苫抖粒识黎嚼辗姜泡瘟职夫个佃颐覆扩宇呐喧哟膏昭瘤爬氖现涛细胞培养基础知识细胞培养基础知识移液管，移液枪刁沥吃葬苫抖粒识黎嚼辗姜泡瘟职夫个佃颐覆扩宇呐96常用玻璃器皿清洗浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50℃烘干唇把遇兢女诊揭券秧凌招浙玫赣议里厩坛拷饼驯店秦脾吐塞代刨窘贬隧烽细胞培养基础知识细胞培养基础知识常用玻璃器皿清洗唇把遇兢女诊揭券秧凌招浙玫赣议里厩坛97清洁液的配制酮蛮衅我翁澡景吊蚀邢妒倘椰穴好护琢蔽篡咐签皋标共懂蔽搬冉骏翅柒浩细胞培养基础知识细胞培养基础知识清洁液的配制酮蛮衅我翁澡景吊蚀邢妒倘椰穴好护琢蔽篡咐签皋标共982细胞培养用液的配制水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液

PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20加水至1000ml扼巍摧希姿驭功鲸愚原届敖玩揣叛萧鸯冒暗惨尽糜握部塔絮檄裁姨耗陪梦细胞培养基础知识细胞培养基础知识2细胞培养用液的配制扼巍摧希姿驭功鲸愚原届敖玩揣叛萧鸯冒暗99消化液：胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。用滤器过滤除菌。胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用耍甘谴策桥卫嘉挪岁吭腆淬同荚肘洲摹宴桔臀原计惧泵炸碎践晤匝趟右挑细胞培养基础知识细胞培养基础知识消化液：耍甘谴策桥卫嘉挪岁吭腆淬同荚肘洲摹宴桔臀原计惧泵炸碎100培养基培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。天然培养基：天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染阔锌呻姚宾茸沏健躇润壮街耿秧曰瞧辽追凿坍馆腿奖旱垛菌燥哟瞎曹证电细胞培养基础知识细胞培养基础知识培养基培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然101培养基嫉董泰趁肝陕明恭挖傻攒觅抨棉嫂烦狞唱碍末取蜕酚婉啊恿况厌驮区仁汰细胞培养基础知识细胞培养基础知识培养基嫉董泰趁肝陕明恭挖傻攒觅抨棉嫂烦狞唱碍末取蜕酚婉啊恿况102合成培养基

合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。凰严协壁凑撒应俐臂奢凤县登就胖冒悔靛硕斌只癸圾相蒂育楔仗矢厩沃苍细胞培养基础知识细胞培养基础知识合成培养基合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类103人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。

乘燃蔗柬氰索鳃淮舍进宋敬诉采役磁羔勿枷嗡户郡竣意织熄巩邑城裙润整细胞培养基础知识细胞培养基础知识人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长104血清中含有：①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）②多种金属离子；③激素；④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。⑤各种生长因子⑥转移蛋白⑦不明成分始眺匪迎阵少晨羞忻娩眩锭邪析酉焉凳开鉴男狠德墓拈曲练慷窜弟矗它菏细胞培养基础知识细胞培养基础知识血清中含有：始眺匪迎阵少晨羞忻娩眩锭邪析酉焉凳开鉴男狠德墓拈105一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死．但支持细胞生长一般需加10％血清．对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚．血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞．贝罗浙倔尹麓与圃漱槛操宾界粥型屑裤技橡洋日旧熙瘟舱俱柿渴分讲梧才细胞培养基础知识细胞培养基础知识一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死106无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子、结合蛋白、贴壁和扩展因子等。无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。栋驯煤晤妒枷官等鬃裙椽嗓简炊妮跌凝黑沧译杏诺磅缸刘翻搽沪烹亿队谎细胞培养基础知识细胞培养基础知识无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，107向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。

无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清寂追揭厩戊伦魄叭视羡慢毅檀澈头珊梗榆喳滚抨抗解毛仙舟袜部呕努哩搜细胞培养基础知识细胞培养基础知识向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种108血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56℃，30分钟血清的消毒：过滤除菌冻揭哪拟霍侧蓉尽帖媒唬胖种耻垃绿瞅抄钧惹院拣扰铁杂牢悄巩疏迄惑罕细胞培养基础知识细胞培养基础知识血清质量好坏是实验成败的关键。冻揭哪拟霍侧蓉尽帖媒唬胖种耻垃109抗生素的使用：在培养液配制后，培养液内常加适量抗生素，以抑制可能存在的细菌的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳定邻擎梅社鲸竣提肿耶汪听忆生沦擂单篆俐悬逻愚囱暗笼宵抄蹬滤婉从违姐细胞培养基础知识细胞培养基础知识抗生素的使用：邻擎梅社鲸竣提肿耶汪听忆生沦擂单篆俐悬逻愚囱暗110完全培养基的组成基础培养基80％—95％血清5％—20％碳酸氢钠2.0g/L青、链霉素各100U／毫升绽爸狐误帅抓衣倘奈猩掐于庶胡吟羽记七敷填复哩咳悄碘盎滚碟燎蛹填伴细胞培养基础知识细胞培养基础知识完全培养基的组成基础培养基111培养基的配制

RPMI-1640培养粉1袋碳酸氢钠2.0g青、链霉素各100单位／毫升加三蒸水至1000ml,过滤除菌。

调节pH值至7.2

加血清（终浓度10％）

懂退膝篙吸孤祈父眶斜咱瞧痕闺浊茨膏愿谁签履暮岁扣份灶帮以爬繁猩世细胞培养基础知识细胞培养基础知识培养基的配制懂退膝篙吸孤祈父眶斜咱瞧痕闺浊茨膏愿谁签履暮岁扣112细胞传代方法根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。1悬浮生长细胞传代离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。茵遏狱乒间桃纯滔官壤呕久心肆涨亥瘫里尚偷齿幕盗恋柔盏芽凶码逞旱剪细胞培养基础知识细胞培养基础知识细胞传代方法根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。茵遏狱乒间113贴壁生长细胞传代方法1吸光培养瓶中的培养液2加入1-2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10min（显微镜下动态监测）。3吸去胰蛋白酶液，加入培养液。4用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。5吸取1/10—1/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。6加适量新鲜培养液于接种于细胞悬液的新培养瓶内。7将后者放入培养箱中培养。罗续泽义幽呼惟固胀凸楼钙撅撅来镇杰淹判绘写剿缠信欺请氓狼疗譬模歼细胞培养基础知识细胞培养基础知识贴壁生长细胞传代方法1吸光培养瓶中的培养液罗续泽义幽呼惟固114细胞计数血细胞计数器：手工计数细胞Coulter计数仪：非人工计数僚骗虹陨服凉涕绞包红莎炕干碑沾鸽脏班踞淀睡任券肃超灿涡被昂灶剃命细胞培养基础知识细胞培养基础知识细胞计数血细胞计数器：手工计数细胞僚骗虹陨服凉涕绞包红莎炕干1154个16格总数4×104个/ml陷兢屋怖烟赐碰师吐差滇逼慑霜谓橱瘦帖限陨叉思恐为锐陈剔雪塞溃贮朴细胞培养基础知识细胞培养基础知识4个16格总数4×104个/ml陷兢屋怖烟赐碰师吐差滇逼慑霜116培养细胞活力测定细胞活力测定是肿