病毒和亚病毒因子

关于病毒和亚病毒因子第1页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五第2页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五第三章病毒和亚病毒一、教学目的与要求学习病毒的形态和大小，掌握病毒的化学组成、形态结构、增殖方式和生活周期，了解亚病毒的特点，了解病毒在生产实践中的应用。二、

教学内容：

1、病毒的形态结构、化学成分与增殖方式(★)

2、亚病毒的组成与特点３、病毒与实践(☆)第3页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五第一节病毒病毒的概念：病毒是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的超显微“非细胞生物”。其本质是一种只含有DNA或RNA的遗传因子，它们能以感染态和非感染态两种状态存在。在宿主体内呈感染态，只能在活的、敏感细胞内以复制方式增殖(活细胞内专性寄生)；在离体条件下，能以无生命的生物大分子颗粒状态长期存在，并可保持其侵染活性，即非感染态。可以作为致病因子，也可以当作遗传成分。第4页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五第一节病毒病毒的特点1、形体极微小，都通过细菌滤器，只能在电镜下观察；2、无细胞构造，其主要成分仅为核酸和蛋白质两种。故又称“分子生物”；3、每一种病毒只含一种核酸，不是DNA就是RNA；4、既无产能酶系，又无蛋白质和核酸合成酶系，只能利用宿主活细胞内现成代谢系统合成自身的核酸和蛋白质组分；5、以核酸和蛋白质等“元件”的装配实现大量繁殖；6、在离体条件下，能以无生命的生物大分子状态存在，并可长期保持侵染活力；7、对一般抗生素不敏感，但对干扰素敏感；8、有些病毒的核酸还能整合到宿主的基因组中，并诱发潜伏性感染。第5页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五第一节病毒病毒的主要类群真病毒：亚病毒：至少含有核酸和蛋白质两种组分类病毒：卫星因子：朊病毒：只含不具独立侵染性的核酸组分只含具独立侵染性的核酸组分只含单一蛋白质组分病毒第6页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五第一节病毒病毒与人类的关系病毒种类多样性：凡在有细胞的生物生存之处都有与其相对应的病毒存在。与人类关系密切至今和许多有益动物疑难疾病和威胁性最大的传染病几乎都是病毒病发酵工业中的噬菌体污染会严重危及生产许多侵染有害生物的病毒则可制成生物防治剂而用于生产实践许多病毒还是生物学基础研究和基因工程中的重要材料或工具第7页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五一、病毒的形态构造和化学成分一）病毒的大小二）病毒的形态三）病毒的化学组成、结构和对称性重点第8页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五一）病毒的大小测量单位为纳米,直径20-200nm

(病毒：细菌：真菌约为1：10：100)

<50nm小型病毒50nm-150nm中型病毒（大多数）>150nm大型病毒

最大：痘病毒，直径约为200nm最小：菜豆畸矮病毒，直径9-11nm第9页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五微生物的大小比较葡萄球菌(1000nm）

牛痘病毒300×250nmABCDEFG立克次体450nm衣原体390nmA、大肠杆菌噬菌体

(65×95nm)B、腺病毒(70nm)C、脊髓灰质炎病毒

(30nm)D、乙脑病毒(40nm)E、蛋白分子(10nm)F、流感病毒(100nm)G、烟草花叶病毒第10页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五二）病毒的形态1、病毒的细胞形态多种多样，有杆状、球状、蝌蚪状、砖状、子弹状杆状：直杆状----烟草花叶病毒、苜蓿花叶病毒稍弯曲----马铃薯X病毒、甜菜黄化病毒球状：豌豆花叶病毒、黄瓜花叶病毒、大多数动物病毒蝌蚪状：有些细菌病毒杆状球状蝌蚪状第11页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五二）病毒的形态2、病毒的群体形态①包涵体②噬菌斑③病斑和空斑④枯斑第12页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五①包涵体（inclusionbody）概念：

感染病毒的宿主细胞内，出现在光学显微镜下可见的大小、形态、数量不等的小体，称为包涵体。在细胞中的形成部位：

位于细胞核内—如包疹病毒 位于细胞质内—如狂犬病毒等

细胞核、细胞质内都有—麻疹病毒

包涵体的本质

—大多数是病毒粒子组成的，少数是细胞对病毒的反应。了解研究包涵体的实践意义

—病毒鉴定、临床诊断依据第13页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五②噬菌斑(plaque)概念：

指在宿主细菌的菌苔上，噬菌体使菌体裂解而形成的一个具有一定形状、大小、边缘和透明度的空斑（负菌落）。应用：

1、噬菌体定量计数

2、噬菌体的鉴定烈性噬菌体噬菌斑温和噬菌体噬菌斑第14页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五

③空斑和病斑：由动物病毒在宿主单层细胞培养物上形成的。也可以采用噬菌斑法类似的技术。用于动物病毒粒子的计数。④枯斑：

植物病毒在植物叶片上形成的群体称为枯斑第15页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五三）病毒的组成、结构与对称性1、病毒的化学组成基本成分为核酸和蛋白质，有的还有脂质、糖类等。①病毒核酸一种病毒只有一种核酸，核酸构成了病毒的基因组，具有遗传信息的载体和传递体的作用。是病毒系统分类中最可靠的分子基础。大多数病毒粒子中只有一个核酸分子，但有少数RNA病毒含2个或以上的核酸分子，各个分子担负着不同的遗传功能，它们一起构成了病毒的基因组，这些病毒为双组分基因组、三组分基因组和多组分基因组。类型极为多样化：病毒DNA和RNA不仅有是单链(singlestrand,ss)还是双链(doublestrand,ds)，线状和环状，而且有正链(+链)和负链(-链)，其类型为生物之最。第16页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五若干有代表性病毒的核酸类型细菌病毒真菌病毒第17页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五三）病毒的组成、结构与对称性1、病毒的化学组成②病毒蛋白质：由病毒核酸编码结构功能：结构蛋白组成病毒体的成分

衣壳蛋白：包在病毒外构成病毒的基本结构——核衣壳

包膜蛋白：

基质蛋白：连接衣壳蛋白与包膜蛋白的部分吸附功能：噬菌体尾丝及包膜糖蛋白刺突吸附在宿主表面的受体上破坏宿主细胞膜与细胞壁：如噬菌体的溶菌酶增殖：各种酶。如DNA和RNA聚合酶，RNA复制酶、逆转录酶等第18页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五三）病毒的组成、结构与对称性裸露病毒：基本结构(核衣壳)包膜：核心(基因组)：衣壳：病毒核酸由许许多多衣壳粒(蛋白质亚单位)组成由类脂双层膜(来自宿主的细胞膜)组成，有的长有刺突包膜病毒：2、病毒的构造病毒粒(病毒体)：有时也称病毒颗粒或病毒粒子，专指成熟的、结构完整的和有感染性的单个病毒。第19页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五病毒粒的模式构造衣壳粒衣壳核心（核酸）核衣壳包膜包膜病毒包膜子粒第20页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五3、病毒粒的对称体制

杆状：烟草花叶病毒(TMV)等丝状：E.coil的f1、fd、M13噬菌体等卷曲状：正粘病毒(流感病毒)等弹状：狂犬病毒，水泡性口膜炎病毒等小型：脊髓灰质炎病毒等，Φ174噬菌体等

大型：腺病毒等

无包膜：E.coil的T偶数噬菌体(蝌蚪状)等有包膜：痘病毒(砖块状)三）病毒的组成、结构与对称性无包膜无包膜有包膜螺旋对称二十面体对称复合对称有包膜：疱疹病毒等第21页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五ssRNA

(5%)衣壳粒

(95%)烟草花叶病毒的模式构造第22页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五腺病毒的模式构造A二十面体的形态第23页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五五邻体腺病毒的模式构造B衣壳粒形态12个角，20个面，30条棱，252个球状衣壳粒70-80nm六邻体第24页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五腺病毒的模式构造C腺病毒的形态核心为线状dsDNA第25页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五E.coil的T偶数噬菌体的模式构造T2、T4、T665nm95nm95nm20nm（中空的核心）第26页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五第27页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五二、4类病毒及其繁殖方式一）原核生物病毒—噬菌体二）植物病毒三）人类和脊椎动物病毒四）昆虫病毒第28页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五一）原核生物病毒—噬菌体概念：即原核生物的病毒。包括噬细菌体、噬放线菌体和噬蓝细菌体等。分布：噬菌体在自然界广泛存在，凡有原核生物活动之处几乎都发现有相应噬体菌存在。种类：可归纳成6种主要形态第29页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五噬菌体的六类形态★T-系噬菌体——T-系噬菌体是研究的最广泛而又深入的细菌噬菌体，按发现的先后顺序进行从T1---T7编号，后来发现其中偶数者的形态都相同（蝌蚪形收缩性长尾），故统称T偶数噬菌体（A型）。第30页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五1、噬菌体的繁殖吸附(adsorption)侵入(penetration)增殖(复制与生物合成）成熟（装配）(assembly)裂解（释放）(release)第31页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五几个概念烈性噬菌体（virulentphage）——感染细胞后，能在寄主细胞内短时间完成吸附、侵入、增殖、成熟和裂解5个阶段而实现繁殖，产生大量子代噬菌体并引起细菌裂解的噬菌体。温和噬菌体（temperatephrage）——噬菌体感染细胞后，将其核酸整合（插入）到宿主的核DNA上，并且可以随宿主DNA的复制而进行同步复制，在一般情况下，不引起寄主细胞裂解的噬菌体。裂解性周期（增殖性周期）——烈性噬菌体所经历的繁殖过程第32页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五TheLyticLifeCycleofLyticBacteriophages第33页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五吸附：接触→结合→特异性吸附（病毒以其特殊结构与宿主细胞表面的特异受体结合）噬菌体:尾丝、刺突---------细胞壁(脂多糖、脂蛋白、磷壁酸)

荚膜、鞭毛、性毛动物病毒：刺突、吞噬作用和胞饮作用被动进入植物病毒：刺突侵入病毒或其一部分进入宿主细胞的过程噬菌体:吸附后尾丝收缩，使尾管碰及细胞壁，这时，尾管端所携带的少量溶菌酶水解细胞上的肽聚糖，然后，尾鞘收缩，把尾管推出并插入细胞壁中，头部的核酸就通过尾管迅速注入宿主细胞中，而将蛋白质外壳留在壁外。动物病毒：核衣壳侵入，需脱壳植物病毒：通过表面伤口或昆虫口器插入细胞而侵入吸附和侵入第34页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五Thebacteriophagebindstoreceptorsonthebacterialcellwall.Thebacteriophageinjectsitsgenomeintothebacterium'scytoplasm

Fig.2:Penetration

Fig.1:Adsorption

第35页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五增殖（复制和生物合成）①核酸复制第36页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五增殖（复制和生物合成）②蛋白质的生物合成首先是设法利用宿主细胞内原有的RNA聚合酶转录出噬菌体的mRNA病毒一转录出其mRNA，就由这些mRNA合成出病毒蛋白质(酶、衣壳粒)早期转录:早期蛋白次早期转录:次早期蛋白晚期转录:晚期蛋白噬菌体的基因组转录和表达具有严格的时序性第37页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五装配(成熟)①偶数噬菌体的装配指导装配：需要有一些非结构蛋白作指导第38页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五成熟(装配)②TMV的装配自体装配：各个组分自发地组装形成病毒粒完整病毒粒双层盘双圈螺旋第39页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五裂解(释放)裂解（Disintegration）:裸露病毒裂解当宿主细胞内的大量子代噬菌体成熟后，由于水解细胞膜的脂肪酶和水解细胞壁的溶菌酶等的作用，促进了细胞的裂解，从而完成了子代噬菌体的释放。自外裂解指大量噬菌体吸附在同一宿主细胞表面并释放众多的溶菌酶，最终因外在的原因而导致细胞裂解。裂解量：平均每一宿主细胞裂解后产生的子代病毒粒子数出芽（Budding）:包膜病毒装配好的核衣壳迁移到宿主细胞膜上对应特异部位，在出芽穿过细胞膜的过程中裹上包膜，释放.第40页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五植物病毒的繁殖过程第41页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五2、噬菌体效价的测定效价(滴度,Titre)—表示每毫升试样中所含有的具有侵染性的病毒粒子数。噬菌体效价—或噬菌斑形成单位（plaque-formingunit,pfu）或感染中心数（infectivecentre），指噬菌体的浓度，即每毫升试样中含具有侵染性的噬菌体的个数。噬菌体效价测定方法电镜直接计数法、血细胞凝集试验、抗原试验（免疫沉淀试验、酶联免疫吸附试验等）、分光光度法双层平板法成斑率同一样品根据噬菌斑计算出来的效价与用电镜计算出来的效价比。第42页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五主要操作步骤：双层平板法（2%琼脂底层培养基7-8mL）上层培养基（1%琼脂培养基3mL）底层平板宿主菌悬液（对数期菌液0.2mL）噬菌体试样（合适稀释液0.1mL）上层平板双层平板混均37℃10余h计数噬菌斑双层平板法计算出来的噬菌体效价总是比用电镜直接计数得到的效价低可使所有噬菌斑都近似位于同一平面上，因而大小一致、边缘清晰且无重叠现象琼脂较稀，故形成的的噬菌斑形态较大、特征较明显并便于观察和计数第43页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五3、一步生长曲线概念：或称一级生长曲线，是定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线。基本实验步骤1、吸附用噬菌体的高倍稀释液去感染高浓度的宿主细胞，以保证每个细胞所吸附的噬体体至多只有一个。吸附数分钟后，在混合液中加入适量的相应抗血清以中和尚未吸附的噬菌体。2、稀释用保温的培养液稀释此混合液，同时终止抗血清的作用。3、培养与测定置于适宜的温度与培养，其间每隔数分钟取样，连续测定其效价，以感染时间为横坐标，噬菌体的效价为纵坐标绘制一步生长曲线。第44页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五3、一步生长曲线指噬菌体核酸侵入宿主细胞后至第一个成熟噬菌体粒子装配前的一段时间。指潜伏期后的宿主细胞迅速裂解，溶液中噬菌体粒子急剧增多的一段时间。指感染后的宿主细菌全部裂解，溶液中噬菌体效价达到最高点的时期。指在潜伏前期人为地(用氯仿等)裂解宿主细胞后，此裂解液仍无侵染性的一段时间。胞内积累期：指在隐晦期后，若人为地裂解细胞，其裂解液已呈现侵染性的一段时间。噬菌体以分钟计，动物病毒和植物病毒以小时或天计。是平均每一宿主细胞裂解后所产生的子代病毒粒子数。其值等于平稳期病毒效价与潜伏期病毒效价之比。噬菌体的裂解量一般为几十至上百个，动物病毒和植物病毒可达数百至上万个第45页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五3、一步生长曲线Phageplaques概念：又称一级生长曲线，定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线。其基本实验步骤为：Samplesremovedat5-minuteintervalsPhagesuspensionInfectedbacteriaBacteriaBacterialysedBacteriachlorofomHost

bacteria

meltedagarBacteria—eachcellbeconesinfectedwithonephageAllowtohardedSandwichoftopagarandnutrientagarNutrientagarplateIncubate24-48hoursLawnofhostcellBacteriophagesuspensionAllowedtostand1minutewithchloroformPourmixtureofbacteriaandphageontonutrientagarplate1%琼脂培养基45℃-48℃2%琼脂双层平板每隔数分钟取样第46页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五4、溶源性概念：或称溶源现象。指温和噬菌体侵染敏感宿主细胞后不裂解它们，而与宿主细胞共存的特性。溶源菌：是能与温和噬菌体长期共存，一般不会出现有害影响的宿主细胞。温和噬菌体如E.coli的、P1、P2，Salmonellatyphimurium的P22等存在形式：游离态：指成熟后被释放并有侵染性的游离噬菌体状态整合态：指已整合到宿主基因上的前噬菌体状态。(进入溶源性周期)营养态：指前噬菌体经外界理化因子诱导后，脱离宿主核基因组而处于积极复制、合成和装配的状态。检出：噬菌斑第47页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五前噬菌体：没有感染力图1.1-4细菌受噬菌体感染后的两种反应

A.裂解反应B.溶原性反应自发或诱导变异营养态游离态整合态自发或诱导变异第48页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五★烈性噬菌体与温和噬菌体的生活史比较：吸附侵入增殖成熟裂解整合同步复制自发或诱导多次循环裂解性循环溶源性循环第49页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五★溶源菌的检验：●方法：

将少量溶源菌与大量的敏感性指示菌混合→→倒琼脂平板→→经培养后观察是否有噬菌斑出现。●敏感性指示菌——遇溶源菌裂解后所释放的温和噬菌体会发生裂解循环者，这些菌株可以从自然界或菌种库中获得。由于溶源菌在细胞分裂过程中有极少数个体会引起自发裂解，其释放的噬菌体可不断侵染溶源菌菌落周围的指示菌菌苔，于是就形成了一个个中央有溶源菌的小菌落，四周有透明圈围着的独特的噬菌斑第50页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五在合适的培养基中培养待测菌样原噬菌体复制除去活菌体倒琼脂平板（或将滤液加到敏感性指示菌的液体培养物中培养观察是否有噬菌斑出现（或使菌液变清）对数期进行紫外照射培养，过滤取少量滤液与大量的敏感性指示菌混合溶源菌的优化检验步骤：第51页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五补充1：病毒的分类病毒的分类系统病毒分类与命名的权威机构国际病毒分类委员会（ICTV）国际病毒分类系统目、科、亚科、属、种分类依据是其免疫学特性与宿主特异性ICTV将其定义为具有一定世代关系并占据一定生境的病毒群。即在具有科和属特征前提下，把某些次要特征不完全相同的病毒归为同一种。病毒种以下的血清型、基因型、毒力株、变异株和分离株的分类和命名由公认的国际专家小组确定。病毒的命名采用英文或英文化拉丁文，只用单名，不用斜体书写。但目、科、亚科、属分别用拉丁文后缀“virales”、“viridae”、“virinae”、“virus”。第52页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五补充2：病毒研究的基本方法一、病毒的培养病毒只能在对其敏感的相应宿主及其细胞内才能繁殖。二、病毒的分离与纯化1、病毒的分离将疑有病毒而待分离的标本经处理后，接种于敏感的实验宿主、鸡胚或细胞培养，经过一段时间后，检查病毒特异性病理表现或用其他方法来肯定病毒的存在。2、病毒的纯化(1)病毒纯化的标准第53页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五补充2：病毒研究的基本方法二、病毒的鉴定：病毒性质和特征分析1、病毒感染的宿主范围及感染表现的鉴定2、病毒的理化性质鉴定病毒颗粒大小和形态、病毒及其组分的沉降系数、浮力密度和相对分子质量、病毒的核酸类型、对理化因子的敏感性等。3、血细胞凝集性质鉴定不同病毒所凝集的血细胞种类及发生凝集所要求的温度、pH条件不同4、病毒的血清学鉴定采用免疫血清或抗体，进行免疫沉淀反应、凝集反应、酶联免疫吸附测定、血凝抑制实验等5、病毒的分子生物学鉴定病毒感染宿主所引起的疾病症状；在鸡胚绒毛尿囊膜上所形成的痘疱形态及在单层细胞培养物上所产生的细胞病变表现等第54页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五补充3：病毒与肿瘤发生肿瘤是由失去调控而异常生长和繁殖的新生异常细胞或瘤形成的组织团块。据估计，15%的人类肿瘤是由病毒所引起。肿瘤病毒可引发机体肿瘤发生的病毒。其最显著的特征是能够像温和噬菌体一样把病毒自身核酸整合到宿主染色体DNA上。第55页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五补充4：新生病毒概念指以往局部低水平感染的病毒或具有种间屏障的病毒，将其宿主范围扩大到别的物种，引起了大范围的人类传染性疾病。其产生与人类对环境的破坏有关、艾滋病（人类获得性免疫缺陷综合症，AIDS），其病原体是人免疫缺陷病毒（HIV）其产生与现代交通、旅游发展和人类大规模迁居有关脊髓灰质炎病毒其产生与某些病毒基因突变改变了宿主范围或致病力有关禽流感（AI），由A型流感（H有15个型，N有9个型）病毒引起H5N1流感、甲型H1N1流感，由A型流感病毒变种引起其产生与人和动物的密切接触有关严重急性呼吸综合症（SARS），由SARS冠状病毒引起第56页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五第57页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五第二节亚病毒类病毒(Viroids)：只含具独立侵染活性的核酸低相对分子量，有二级结构环状，裸露ssRNA分子，无衣壳或包膜复制依赖于宿主细胞的转录酶系统，而不需要辅助病毒其RNA不产生蛋白质其RNA总是在宿主细胞核中复制类病毒颗粒的识别需要鉴定其RNA序列多与植物疾病相关第58页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五第二节亚病毒卫星因子：只含不具独立侵染活性的核酸，需辅助病毒才能复制和感染卫星病毒核酸分子含有编码衣壳蛋白的遗传信息，核酸被所编码的衣壳蛋白包裹成形态学和血清学与辅助病毒不同的颗粒。卫星核酸（卫星RNA或卫星DNA）核酸分子没有编码衣壳蛋白的遗传信息，核酸被装配于辅助病毒的衣壳蛋白中。例如：烟草坏死病毒（TNV）卫星病毒（STNV）人类丁型肝炎病毒（HDV）是乙型肝炎病毒（HBV）的卫星核酸第59页，共65页，2022年，5月20日，12点38分，星期五第二节亚病毒朊病毒：蛋白侵染子（“普利昂”）是具侵染性蛋白质分子，对人类最大的威胁是导致人类和家畜患中枢神经系统退化性病变，最终不治而亡。抗热，90度不能使之失活抗辐射抗DNA酶或RNA酶降解对蛋白质变性剂如酚和尿素