知柏地黄丸对瘦素诱导特发性性早熟模型小鼠的影响

知柏地黄丸对瘦素诱导特发性性早熟模型小鼠的影响【关键词】知柏地黄丸/药理学；性早熟/中药疗法；黄体生成素/血液；雌二醇/血液；疾病模型，动物；小鼠性早熟是一种生长发育异常，表现为青春期特征提早出现。性早熟以女童为多见，其中特发性中枢性性早熟〔IPP〕占女孩性早熟的80%～90%，男童性早熟的40%，IPP的发病机理尚未完全清楚，可能系下丘脑—垂体—性腺轴〔HPGA〕功能的提早发动所致。由于其确切原因未明，因此无法复制出理想的IPP动物模型。一般认为青春期的发动需要一定体质量和体脂的积累，瘦素〔Leptin〕可能涉及获得临界体脂总量的神经内分泌通道的信号作用，这可能是青春期启动的一个允许因子［1］。本实验拟采用Leptin刺激未成熟雌性BALB/小鼠诱导IPP动物模型，观察知柏地黄丸对抗IPP的作用，现报道如下。1材料与方法1.1动物选用18日龄BALB/雌性小鼠61只，由中国医学科学院上海实验动物中心提供〔合格证号：中科动管会第001号〕，常规分笼饲养，自然照明，随意取食和饮水。1.4观察指标及方法1.4.1阴道开口据预试验观察正常BALB/雌性小鼠阴道开口时间一般在日龄26～28d，以27d较为集中。本实验于造模后第3天〔即22日龄〕开场每天下午4点观察各组阴道开口，26日龄时完毕。1.4.2体质量变化每天记录各组小鼠体质量变化，实验完毕时，取前后体质量进展比拟。1.4.3血清黄体生成素〔LH〕、雌二醇〔E2〕含量测定实验完毕时，各组动物称体质量后，摘取眼球眼眶取血，3500r/in、4℃离心15in，取上清，采用酶联免疫吸附法分别测定LH、E2含量。1.4.4子宫、卵巢质量各组动物眼眶取血后，摘取子宫、卵巢分别称质量，计算脏器指数〔〕：=脏器/bdy。1.5统计学方法采用SPSS11.5统计软件包进展数据处理，计数资料用列联表的rsstabs过程进展统计学处理，计量资料采用独立样本t检验、及非参数统计的两独立样本秩和检验。2结果2.1各组小鼠阴道开口情况比拟各组小鼠开场出现阴道开口的天数及小鼠数见表1，正常对照组于造模第5天才有2/9小鼠出现阴道开口，阴道开口的平均天数是6.3d。IPP模型组于造模第3天即有2/10小鼠出现阴道开口，阴道开口的平均天数是4.6d，比正常对照组提早1.7d〔P＜0.05〕。从造模第4天开场，IPP模型组与正常对照组的阴道开口小鼠数比拟出现差异，造模第4、5、7天，IPP模型组小鼠的阴道开口较正常对照组提早〔P＜0.05〕，提示Leptin可促进未成熟雌性小鼠阴道开口提早。知柏地黄丸高剂量组于造模第5天才有2/11小鼠出现阴道开口，与模型组比拟，于造模第4～6天对Leptin所致阴道开口提早均有抑制作用，尤以造模第5、6天抑制作用明显〔P＜0.05或P＜0.01〕；知柏地黄丸低剂量组及甲地孕酮对照组于造模第4天均有2/10小鼠出现阴道开口，与正常对照组比拟，造模后不同时间点知柏地黄丸低剂量组及甲地孕酮对照组与正常对照组比拟，阴道开口数之间差异均无显著性意义〔P＞0.05〕，提示低剂量知柏地黄丸及作为临床使用的阳性对照药甲地孕酮，在本实验中对抗Leptin诱导的开口提早的作用不明显。表1各组小鼠阴道开口数比拟统计方法：用列联表分析的rsstabs过程进展计算；①Ｐ＜０.０５，②Ｐ＜０.０１，与正常对照组比拟；③Ｐ＜０.０５，④Ｐ＜０.０１，与IPP模型组比拟2.2各组子宫、卵巢质量及体质量比拟表2结果显示，与正常对照组相比，IPP模型组小鼠的子宫、卵巢质量有增加趋势，但两组差异无显著性意义〔P＞0.05〕；知柏地黄丸高剂量的子宫、卵巢质量较IPP模型组均有降低趋势，但两组之间差异均无显著性意义〔P＞0.05〕。知柏地黄丸低剂量组子宫质量较IPP模型组降低〔P＜0.05〕，卵巢质量与IPP模型比拟差异无显著性意义〔P＞0.05〕；阳性对照药甲地孕酮能抑制Leptin所致子宫质表2各组子宫、卵巢质量及体质量比拟统计方法：独立样本t检验；①Ｐ＜０.０５，②Ｐ＜０.０１，与正常对照组比拟；③Ｐ＜０.００5，④Ｐ＜０.００１，与IPP模型组比拟2.3各组子宫、卵巢指数比拟为排除子宫、卵巢质量增加是由于体质量变化影响所致，比拟各组子宫、卵巢指数〔分别以子宫或卵巢质量除以体质量〕的变化。表3结果显示，与正常对照组比拟，IPP模型组小鼠的子宫指数、卵巢指数均有升高趋势，尤以子宫指数升高明显，但两组差异无显著性意义〔P＞0.05〕。提示Leptin虽具有一定的促进性腺生长，升高子宫指数、卵巢指数的作用，但作用不明显。与IPP模型组比拟，低剂量知柏地黄丸能抑制Leptin致子宫指数和卵巢指数升高〔P＜0.05或P＜0.01〕；高剂量知柏地黄丸亦能使子宫指数和卵巢指数下降，但两组之间差异无显著性意义〔P＞0.05〕。甲地孕酮能抑制Leptin所致子宫指数的升高〔P＜0.05〕，但对卵巢指数无显著影响〔P＞0.05〕。3讨论阴虚火旺是IPP的主要病机，因此滋阴降火表4各组血清LH、E2程度比拟统计方法：独立样本t检验；①Ｐ＜０.０1，与正常对照组比拟；②Ｐ＜０.０5，③Ｐ＜０.０1，与IPP模型组比拟是IPP的主要治疗法那么［3］。知柏地黄丸是滋阴降火的传统名方，治疗特发性性早熟〔真性性早熟〕和假性性早熟均获得一定疗效［4］。IPP主要是因于HPGA功能的提早发动。青春期是一个性成熟的过程，而青春发育启动主要是促性腺激素释放激素〔GnRH〕脉冲释放频率和峰度增加所触发，尤其是夜间GnRH脉冲式分泌的增加，被认为是青春期开场启动的标志［5］。但GnRH脉冲释放频率和峰度增加确实切机制仍然未明。有学者认为，只有根本体脂到达最低阈值才能维持正常的月经周期和触发青春期，此即临界体脂学说。其中Leptin在感知机体的营养状态及个体大小和体脂含量，从而启动GnRH的高频率释放中起关键作用［6］。在人类性成熟和未成熟个体内，Leptin的循环程度有显著性差异，且Leptin先于青春期前生殖激素尚未升高之时升高［7］，因此，Leptin可能是人类青春发育启动的允许因子〔但并不是唯一的青春启动刺激因子〕。当Leptin作为一种外源性刺激作用于初情期前的动物，可能使HPGA功能提早发动，从而模拟人类IPP主要病理生理变化。本实验采用Leptin诱导刚离乳的BALB/雌性幼鼠复制IPP动物模型，结果发现Leptin可致模型小鼠阴道开口提早，LH程度升高，E2程度、子宫质量和子宫指数、卵巢质量和卵巢指数有增加的趋势，提示Leptin有一定的促进子宫、卵巢生长发育的作用，与Farid等的研究结果一致［2］。以上结果说明Leptin在诱导性早熟的过程中发挥了启动因子的作用，其可能通过使LH分泌增加提早启动垂体—性腺轴的功能，从而诱导性成熟的提早。第二性征的提早发育是IPP的临床特征。雌鼠〔啮齿类动物〕最能代表第二性征发育的指征即是阴道开口，本实验发现知柏地黄丸高剂量组从造模第3天起即对Leptin促进幼龄雌鼠阴道开口提早具有抑制作用。性腺轴功能的启动，可促进其靶腺—子宫和卵巢的生长发育。知柏地黄丸低剂量组对Leptin诱导的子宫质量、子宫指数及卵巢指数升高有显著抑制作用。观察各组小鼠体质量的变化，可以反映性成熟的启动与体质量和体内能量代谢的关系。本实验中发现，模型组小鼠体质量略为减轻，与正常对照组比拟差异无统计学意义，提示Leptin调控生殖功能的生理作用并非继发于其对体质量和能量平衡的调节。这是与临界体脂学说不一致之处，但与Ahia的研究结果一致［8］。知柏地黄丸高、低剂量均无对抗Leptin减轻体质量的作用。LH是初情期的标志，LH优势性升高为IPP的临床标志之一［9］。LH在正常月经周期中呈周期性变化，在排卵前到达峰值，因此亦作为预测排卵常用的最显著的激素标准。本实验发现Leptin能诱导IPP模型小鼠LH、E2程度升高，这与hehab等的实验结果不一致，hehab等于雌鼠出现动情期的29日龄时，采血测定LH、E2程度，结果显示均低于磷酸盐缓冲液〔PBS〕组，该学者认为是与实验组动情期较早出现是一致的［2］。本实验IPP模型小鼠LH、E2升高，可能因于26日龄的动物处于不同的动情周期如排卵前期所致；同时发现高、低剂量的知柏地黄丸有对抗Leptin诱导LH升高的作用，但对E2程度无显著影响。综合所述，以Leptin腹腔注射于幼龄BALB/雌鼠，可提早启动垂体—性腺轴功能，给促性腺激素分泌以答应信号，诱导IPP的出现。知柏地黄丸可能是通过抑制Leptin诱导垂体—性腺轴功能的提早启动，抑制垂体分泌LH进而抑制E2的分泌，或直接抑制Leptin对性腺的作用，从而降低Leptin诱导的子宫质量及质量指数升高，抑制Leptin诱导的幼龄雌鼠阴道开口的提早，发挥其对抗Leptin诱导性早熟的作用【参考文献】［1］ZhangY,PrenaR,affEi,etal.Psitinallningftheusebesegeneanditshuanhlgue［J］.Nature,1994,372:425.［2］FaridFhehab,Khalidunzih,RnghuaLu,etal.Earlynsetfreprdutivefuntininnralfealeietreatedithleptin［J］.Siene,1997,275(3):88.［3］时毓民，俞建.性早熟女童阴虚火旺本质的讨论［J］.中国中西医结合杂志，1997，7：30.［4］杨美琳，刘妍，申巧玲.知柏地黄丸治疗儿童性早熟25例结果分析［J］.河南中医1999，5：59.［5］陈非.瘦素与男性青春期发育［J］.国外医学：妇幼保健分册，2002，13〔4〕：177.［6］黄荷凤.瘦素对生殖功能的影响［J］.浙江医学，2002，24〔4〕：198.［7］赵咏桔，陆洁莉，唐金凤