分离科学与技术

7/7分离科学与技术分离科学与技术

技术比分离技术明显地显得丰富多样且高效先进。例如，色谱技术、毛细管电泳技术和紫外光谱、红外光谱、质谱、核磁共振谱、氨基酸序列分析等等对微量样品的分析鉴定技术都已较普遍地得到应用。而对物质的分离纯化技术则显得较为匮乏。面对社会的进步和人类对高科技含量精制产品的要求，极其缺乏既能实现高纯度物质的分离纯化，又能实现相当量级制备能力的新技术[3]。如果没有这样的新技术，就很难实现新一代产物的研发与生产，就不能实现高纯度标准物质的制备和高精度质量检定与控制方法的建立。因此，研发和采用先进高效的分离纯化技术，是值得倍加关注的命题。

二、常见的药物分离技术与方法

1.两相溶剂萃取法

1.1简单萃取法[4]

液—液萃取法即两相溶剂提取法，是利用混合物中各组分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离目的的方法。简单的萃取过程是将萃取剂加入到样品溶液中，使其充分混合，因某些组分在萃取剂中的平衡浓度高于其在原样品溶液中的浓度，于是这些组分从样品溶液中向萃取剂中扩散，使这些组分与样品溶液中的其他组分分离。

组分A在两相间的平衡关系可以用平衡常数K表示：

K＝CA／CA'

式中：CA——组分A在萃取剂中的浓度；

CA'——组分A在原样品溶液中的浓度。

这就是分配定律。在液—液萃取中，K通常为分配系数，可将其近似地看作组分在萃取剂和原样品溶液中的溶解度之比。

影响分离效果的主要因素包括：萃取剂、被萃取的物质在萃取剂与原样品溶液两相之间的平衡关系(主要表现为被萃取物质在萃取剂与原样品溶液两相中的溶解度差别)、在萃取过程中两相之间的接触情况。在—定的条件下，被萃取物质的分离效果，主要决定于萃取剂的选择和萃取次数。

1.2逆流连续萃取法[4]

逆流连续萃取法是一种连续的两相溶剂萃取法。是利用两相溶剂密度不同，即密度小的溶剂作为分散相，逆流连续穿过密度大的固定相，使某种成分发生转溶的原理。对于乳化严重的液—液萃取，通常用逆流连续萃取法。萃取过程中可用薄层色谱、纸色谱，以及显色反应或沉淀反应检查萃取是否完全。

1.3逆流分配法[4]

逆流分配法又称逆流分溶法、逆流分布法或反流分布法。逆流分配法与两相溶剂逆流萃取法原理一致，是一种在加样量一定，并不断在一定量的两相溶剂中，

经多次移位萃取分配而达到混合物分离的方法。

1.4液滴逆流分配法[4-6]

液滴逆流分配法又称液滴逆流层析法，是近年来在逆流分配法基础上改进的两相溶剂萃取法。对溶剂系统的选择基本同逆流分配法，但要求能在短时间内分离成两相，并可生成有效的液滴。由于移动相形成液滴，在细的分配萃取管中与固定相有效地接触、摩擦不断形成新的表面，促进溶质在两相溶剂中的分配，故其分离效果往往比逆流分配法好，且不会产生乳化现象，用氮气压驱动移动相，被分离物质不会因遇大气中氧气而氧化。本法必须选用能生成液滴的溶剂系统，但对高分子化合物的分离效果较差，处理样品量小(1g以下)，并要求有一定的设备。

2.结晶法[4]

结晶法是提纯固体化合物的一种重要方法，它适用于产品与杂质性质差别较大、产品中杂质含量小于5％的体系。

固体有机物在溶剂中的溶解度与温度有密切关系。一般是随温度升高溶解度增大。若把固体物质溶解在热的溶剂中达到饱和，冷却时由于溶解度降低，溶液变成过饱和溶液而析出结晶。利用溶剂对被提纯物质及杂质的溶解度不同，可以使被提纯物质从过饱和溶液中析出，而让杂质全部或大部分仍留在溶液中(或被过滤除去)，从而达到提纯的目的。进行结晶时，溶剂的选择是关键，只有选择合适的溶剂，才能得到有效的分离。

结晶法通常包括以下几个步骤：(1)制备提纯物的饱和液；(2)脱色；(3)热过滤；(4)冷却结晶；(5)抽滤；(6)晶体干燥。干燥晶体可通过测熔点来确定结晶的纯度。

3.沉淀法[4]

沉淀法是在天然药物提取液中，加入某些试剂使产生沉淀，通过过滤将成分分离的方法。依据加入沉淀剂的不同，沉淀法可分为以下几种。

3.1酸碱沉淀法

酸碱沉淀法根据酸(碱)成分碱(酸)试剂反应成盐而溶于水，再加酸(碱)试剂反应重新生成。游离酸(碱)从溶液中又析出以达到分离的目的。

3.2醇沉淀法

在浓缩的水提取液中，加入一定量的乙醇(使含乙醇量达80％以上)，则难溶于乙醇的成分，如淀粉、树胶黏液质、蛋白质等从溶液中析出，经过滤除去。

3.3铅盐沉淀法

铅盐沉淀法是分离某些天然药物成分的经典方法之一。该法是利用中性醋酸铅或碱式醋酸铅水溶液能与多种天然药物成分生成难溶的铅盐，或配合物沉淀的

原理，利用这种性质使有效成分与杂质分开。

4.透析法

透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质达到分离的方法。在分离纯化蛋白质、多肽、多糖、皂苷等相对分子质量较大的成分时，常采用本法除去无机盐、单糖、双糖等小分子杂质。反之，如果杂质是大分子的蛋白质、淀粉、树脂等，采用此法将其留在半透膜内，而将所要的小分子成分通过半透膜进人膜外溶液中，从而加以分离精制[4]。

5.分馏法

分馏法是利用混合物中各成分的沸点不同，在分馏过程中产生不同的蒸汽压，收集不同温度的馏分，借以分离液体混合物的一种方法。在天然产物有效成分研究中，挥发油及一些液体生物碱常用此法分离。分馏法是将多次蒸馏的复杂操作集中在一支分馏柱中完成。经分馏所得各馏分，仍然可能是混合物，须结合薄层色谱及气相色谱检查，再进一步纯化[4]。

6.色谱法

色谱法是分离纯化和定性定量鉴定药物成分的有效方法之一。色谱技术的应用与发展，药物各类成分的分离鉴定起到了巨大的推动作用。一些性质相近、结构类似的化合物，采用经典的溶剂法和结晶法不能很好分离的，使用色谱法往往可以收到很好的分离效果。

色谱法的基本原理是利用混合物中的各组分在互不相溶的两“相”溶剂之间的分配系数(分配色谱)不同、待分离物对吸附剂吸附能力不同(吸附色谱)、分子的大小差异(凝胶色谱)或其他亲和作用的差异进行反复地吸附或分配，从而使混合物中的各组分达到分离。

色谱法是由固定相(可以是固体或液体)和流动相(流动的溶液或气体)两种不同的相组成。流动相为液体的称为液相色谱，流动相为气体的称为气相色谱。根据各组分在固定相中的作用原理不同，又可分为吸附色谱、分配色谱、排阻色谱、离子交换色谱等。根据操作条件和载体的不同，又可分为纸色谱、薄层色谱、柱色谱、气相色谱、高效液相色谱等。

6.1吸附色谱法

吸附色谱法是利用吸附剂对混合物中的各种组分的吸附能力不同而使各成分达到分离的方法。此法主要适用于脂溶性、中等相对分子质量成分的分离。一般不适用于相对分子质量高的成分，如蛋白质、多糖或离子型亲水性化合物的分离。吸附色谱法分离效果如何，完全由吸附剂、溶剂和被分离物质的性质3种因素决定[7]。

6.2分配色谱法

分配色谱法是利用混合物中的各种成分在互不相溶的两相溶剂中的分配系数不同而将混合物中的组分分离的一种色谱方法。把作为固定相的溶剂吸附于某种惰性固体物质的表面，这些惰性物质主要起支撑这种溶剂的作用，称为支持剂或载体，而溶剂就是固定相。被分离物质置于固定相上端，用流动相进行洗脱(或展开)。混合物就在固定相和流动相之间不断进行分配，不同组分由于在两相溶剂中分配系数不同而得以分开[4]。

根据固定相和流动相的不同，分配色谱可分为正相分配色谱和反相分配色谱。以水或亲水溶剂为固定相，与水不相溶的有机溶剂作为流动相的分配色谱称为正相分配色谱，用于分离水溶性或极性较大的成分。以亲脂性有机溶剂作为固定相，以水或亲水性有机溶剂作为流动相的分配色谱称为反相分配色谱，用于亲脂性物质的分离。

6.3高效液相色谱法

在液相色谱中，采用高效固定相，并使用高压泵输送流动相，全部工作通过仪器来完成对有机物的分析，我们称之为高效液相色谱法。其优点主要是：(1)高压，(2)高选择性，(3)高灵敏度，(4)高速。高效液相色谱的基本分析方法的分类有:(1)定性分析方法:①色谱鉴别法；②化学鉴别法；③光谱鉴别法。(2)定量分析方法:①峰高和峰面积；②外标法；③内标法；④内加法。(3)药物杂质总量限度测定法。(4)制备型高效液相色谱法。此方法适用于分离相对分子质量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾现象。常用于分离同分异构体[8]。

高效液相色谱与其他技术的联用是高效液相色谱今后的主要发展方向。主要是色谱—色谱联用、色谱—光谱联用、高效液相色谱—质谱联用，还有柱切换技术以及高效液相色谱-傅立叶变换红外吸收光谱联用等。

高效液相色谱法在西药的分析中应用于质量控制，尤其表现在微量成分和痕量成分的分析。而在中药材鉴定和质量分析上也越来越重要，它的应用将促进我国中药质量的标准化和规范化。

6.4气相色谱法

气相色谱法是利用气体（载气）作流动相的一种色谱分离方法。由于其高分离效能，高灵敏度，用量少，速度快等优点，气相色谱常用于瞬间汽化且不分解、沸点小于350℃的稳定的有机化合物的分离和测定。气相色谱法被广泛应用于环境样品中污染物的分析、药品质量检测、天然药物成分分析、食品中农残分析、工业产品质量控制等领域[4]。

6.5大孔吸附树脂法

大孔吸附树脂技术目前已比较广泛地用于天然药物新药的开发和中成药的生产中，其设备较简单，工艺操作也简便，且树脂可反复使用，成本低廉。目前，

主要用于分离和提纯苷类、生物碱、黄酮类成分及大规模生产，并在抗生素成分提纯等方面也显示出独特的作用。其应用原理主要是利用特殊的吸附剂—大孔吸附树脂的吸附性和分子筛相结合原理，从天然药物水提取液中选择性地吸附其中的有效成分，去除杂质。特别是非极性吸附树脂在吸附药液中的有效成分时，主要是物理吸附(如比表面积、孔径等)在起作用。此方法主要应用于中药复方有效部位的提取和天然药物有效成分的提取。

6.6凝胶色谱法

凝胶色谱也称凝胶渗透色谱，分子筛过滤，是利用分子筛原理来分离物质的方法。凝胶是一种球形颗粒，具有网状结构，不溶于水，但可在水中膨胀的高分子化合物。当凝胶用水膨胀装柱后，加入样品，用同一溶剂洗脱时，由于各种化合物的相对分子质量不同，受凝胶网孔半径限制也不同，大分子不能渗入凝胶颗粒内部，随溶剂在颗粒间移动先被洗脱；小分子因可自由渗入并扩散到凝胶颗粒内部中，受到的阻力增大，流速减慢，故后被洗脱。这样混合物就按相对分子质量由大到小流出顺序不同而得到分离。该技术已发展成为天然产物化学和生物化学研究中的常规分离方法[5,6,9]。

6.7聚酰胺色谱法

利用聚酰胺对混合物中各成分进行分析的方法称聚酰胺色谱法。自20世纪50年代中期发现聚酰胺可以分离酸性物质以来，目前已发展成为分离极性和非极性物质如黄酮类、酚类、酮类、有机酸、氨基酸、生物碱、甾体等用途广泛的色谱方法。对黄酮类、酚类、酮类等化合物的分离，远比用其他方法优越[4]。

聚酰胺分离黄酮类、酚类、酮类等化合物的原理，是通过聚酰胺分子中酰胺基与上述化合物分子上的酚羟基、羰基或醌基形成氢键缔合而产生吸附作用进行分离的。吸附强度主要与溶剂种类、化合物分子结构有关。

6.8离子交换色谱法[7,9]

有些药物成分分子中具有酸性、碱性及两性基因，在水中多呈解离状，因此可根据解离度不同采用离子交换树脂进行色谱分离。这种以离子交换树脂代替吸附剂进行色谱分离的方法就称为离子交换色谱法。离子交换树脂本身具有解离的阳离子或阴离子，可与水溶液中相同电荷的离子发生交换作用，而被吸附到柱上，再用适当流动相洗脱，即可分离混合物中离子型的化合物。

根据离子交换树脂中交换离子的性质不同，离子交换树脂分两大类：

(1)阳离子(酸性)交换树脂：含有活泼的酸性基团，能交换阳离子。可分为强酸型、弱酸型和中等酸型。

(2)阴离子(碱性)交换树脂：含有活泼的碱性基团，能交换阴离子。可以分为强碱型、弱碱型和中等碱型。

6.9高速逆流色谱法

高速逆流色谱法是20世纪80年代发展起来的一种连续高效的液—液分配色谱分离技术，它不用任何固态的支撑物或载体，利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡，当其中一相作为固定相，另一相作为流动相，在连续洗脱的过程中能保留大量固定相。相对于传统的固—液柱色谱技术，此法具有适用范围广、操作灵活、高效、快速、制备量大、费用低等优点。目前此技术正在发展成为一种备受关注的新型分离纯化技术，已经广泛应用于生物医药、天然产物、食品和化妆品等领域，特别在天然产物行业中已被认为是一种有效的新型分离技术，适合于中小分子类物质的分离纯化[5,6,10]。7.超临界流体萃取技术

超临界流体萃取(SFE)技术是20世纪兴起的一种新型分离技术，由于其选择性高、分离效果好、提取率高、产物没有有机溶剂残留、有利于热敏性物质和易氧化物质的萃取等优点，国外已广泛用于香料、食品、石油、化工等领域。SFE技术自20世纪80年代中期以来逐渐被应用于药物有效成分的提取分离，并与气相色谱法、高效液相色谱法联用形成有效的分离技术。

超临界流体萃取的基本原理是：通过控制温度或压力，引起超临界流体独特的物理化学性质的显著变化，从而引起待萃取物质的溶解度发生变化达到萃取的目的。然后经过减压、升温或吸附的方法使超临界流体变成普通的气体，让被萃取的物质分离析出，以达到分离提纯的目的。二氧化碳、乙烷、乙烯、甲醇、乙醇和水等多种物质均可用作超临界流体的溶剂，二氧化碳因其无毒、无臭、无味、不燃烧、化学性质稳定、不易与被分离成分反应，临界点低(Tc＝3l.26℃，Pc＝7.2MPa)、容易达到临界条件，纯度高、价廉、易得、易与溶质分离和使用安全等优点，是目前最常用、研究较多的超临界萃取中一种较理想、较普遍使用的溶剂[4,6]。

8.毛细管电泳技术

毛细管电泳是一类以高压电场（E，可达30kV）为驱动力，以小内径的石英毛细管（常用20～70μm，有效长度50～75cm）为分离通道，依据各组分之间电泳迁移率或分配系数的差异而实现分离的新型液相分离分析技术，它迅速发展于20世纪80年代中后期。毛细管电泳实际上包含电泳、色谱及其交叉内容，它兼有高压电泳的高速、高分辨率及高效液相色谱的高效率等优点，是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，它使分析科学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析乃至单分子分析成为可能。长期困扰我们的生物大分子如蛋白质的分离分析也因此有了新的转机。目前，国际上毛细管的研究侧重于应用，研究的内容是多方面的，其中最富特色者有蛋白质分离、糖分析、DNA测序、手性分离、单细胞分析等。在药物分离中，此方法也广泛用于中药材各类有效成

分分析和中药复方制剂分析，如生物碱、黄酮、苷类、酚类、有机酸、蒽醌类及多糖等成分[6]。

毛细管电泳技术作为一种新的分离手段已应用到药物制剂及原料分析的各个方面，且分离效率高、速度快、操作简便、费用低，在中药及其复方制剂中有着广泛的应用前景。它的高效，使中药多种成分分析成为可能，它的快速提高了分离效率。此外，毛细管电泳技术与其它技术联用，可达到快速完成众多复杂成分的分离和结构测定的目的。

9.膜分离技术

膜分离是一种新型分离技术，它利用经特殊制造的具有选择透过性的薄膜，在外力(如膜两侧的压力差、浓度差、电位差等)推动下对混合物进行分离、分级、提纯和浓缩等操作，以获取需要的产品。膜分离应用广泛，既可用于液体混合物的分离，也可用于气体混合物的分离。目前，膜分离技术不仅在电子工业、食品工业、环境保护和生物工程等领域得到了广泛应用，而且正在逐步成为医药工业的分离纯化工艺、液体制剂除菌和除微粒工艺的基本操作单元。膜分离技术在中药领域应用较为广泛，主要用于中药注射剂和口服液的澄清除杂、除菌和除热原，此外在中药有效成分分离纯化、中药固体制剂生产、中药药液浓缩和中药膜控制释放制剂方面的应用也日益增多。膜分离技术作为一种新型高效分离技术，与传统分离方法相比，具有工艺简单、节能、成本低等优点[11,12]。

10.微波与超声波提取分离技术[13]

微波提取法是一种近年新兴的提取方法，其提取原理是利