外源基因表达调控2课件

原生质体培养技术植物取嫩叶酶消化细胞壁洗涤2-4次移栽入土

愈伤组织培养基原生质体培养基形成完整植株诱导生芽生根三.转录调控序列对外源基因表达的影响1.高等植物基因的分子结构特点.2.5`-端表达调控序列的基本特征.3.启动子和增强子.(1)组成型启动子:CaMV35S启动子,NOS启动子,其他启动子.(2)诱导型启动子:光诱导型启动子(如SSrbcorrbcS,LHCPa/b),损伤型启动子(如PI-II),其他诱导型启动子(如HSP70,对激素ABA敏感的启动子等)(3)组织特异型启动子:叶特异表达启动子,花粉特异表达启动子,糊粉层特异表达启动子,其他组织特异性启动子.2.诱导型启动子

所谓诱导型启动子就是在某些特定的物理或化学信号的刺激下，可以大幅度地提高基因转录水平的启动子。该类启动子常以诱导信号命名，如光诱导表达基因启动子；热诱导表达基因启动子；创伤诱导表达基因启动子；真菌诱导表达基因启动子等。诱导型启动子1.光诱导型启动子

二个光合基因启动子SSrbcorrbcS,LHCPa/borCab.

rbcS:例1豌豆rbcS基因一段973bp调节序列和cat基因构成嵌合基因,结果表现出叶绿体依赖性和光调节活性.发现-330—50长度280bp一段DNA对光诱导是必需的.例2rbcS的另一组试验结果都保持了rbcS表达的组织和光调控特异性.当rbcS5`-125--320bp区缺失时,丧失光调控转录活性,称为光反应区(调节区,Lightregulationelement,LRE),I区(GATAAG)G区(CCACGTGG)GT区(GGTTAA)蛋白因子:GA1GBFGT1点突变或缺失处理,使rbcS启动子完全丧失活性.其它诱导型启动子来自果蝇的HSP70基因的热诱导启动子.菜豆的几丁质酶(chitinase)启动子,对真菌侵染敏感.马铃薯块茎蛋白基因I(ClassIPatatin)启动子糖诱导.水稻对激素,ABA敏感的启动子等.(3).组织特异性启动子

也称为器官特异性启动子，在这类启动子的调控下，基因的表达往往只发生在某些特定的器官或组织部位，并往往表现出发育调节的特性。这种特异性通常以特定的组织细胞结构和化学物理信号为存在的基础。典型的组织特异性启动子有：马铃薯块茎蛋白基因启动子；小麦胚乳特异表达的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因启动子；番茄果实成熟特异性表达的多聚半乳糖醛酸酶基因启动子；花粉特异表达基因（lat52）启动子和木质部特异表达的苯丙氨酸脂肪酶基因（pal）启动子等。(3)组织特异性(Tissue-specific)启动子

和器官特异性(organspecific)启动子1.叶特异表达启动子LHCPa/b(Cab):光诱导叶组织中特异表达.光合有关的基因，叶绿体特有的基因只在叶片中而且依赖叶绿体才能表达.马铃薯块茎蛋白I基因(ClassIPatatin)启动子具有块茎特异表达和损伤蔗糖诱导活性.马铃薯的叶/茎特异表达基因(ST-LST)的5`上游调控序列与马铃薯块茎结构蛋白基因及3`-末端形成嵌合基因可以在转化烟草的茎叶内特异表达.而该结构蛋白基因通常只在马铃薯的块茎中表达.组织特异性(Tissue-specific)启动子和器官特异性(organspecific)启动子人工创造雄性不育

TA291.5kbpromoter+黑曲霉RNaseT1或芽孢杆菌RNase(Barnase)融合基因转化烟草,结果转化株与对照相比表型没有差别,但无花粉亦不能结种子,而花柱正常,雌性的育性不受影响.生物学特征表明表型的雄性不育是由于导入TA29-RNaseT1(Barnase),转化植株中的RNase基因在绒毡层细胞内特异地大量表达,从而降低了细胞中的RNA,抑制了绒毡层的形成引起花粉败育,导致雄性不育.组织特异性(Tissue-specific)启动子和器官特异性(organspecific)启动子3.糊粉层特异表达启动子大麦的α-淀粉酶(α-amylase)组分I的基因 通常amy只在发芽大麦的糊粉层表达.（植物激素GA3可诱导其表达,ABA可以抵消GA3的作用）把Pamy+NPTII融合,转化不同来源的原生质体,结果NPTII可以在糊粉层来源的原生质体内低水平表达,GA3可以是表达水平提高10倍,ABA可以抵消GA3的作用;盾片来源的原生质体只能低水平表达,而且不受激素影响;在叶肉原生质体中根本不表达.对照用P35S-NPTII,在三种不同来源的原生质体中都高效表达,而且不受激素的影响.说明Pamy不但具有激素诱导活性而且具有组织特异性.组织特异性(Tissue-specific)启动子和器官特异性(organspecific)启动子4.其他组织特异启动子小麦胚乳特异表达的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因P.

番茄果实成熟特异性表达PG酶基因启动子.花粉特异表达基因LAT52启动子.木质部特异表达PAL(苯丙氨酸脂肪酶)基因启动子.三.mRNA3`-端非编码区序列对外源基因表达的影响真核生物中:hnRNAmRNA(加帽,加尾)

1.3`-端序列的基本特征 （图） mRNA加尾过程三.mRNA3`-端非编码区序列对外源基因表达的影响3`端调控序列对CAT基因在植物细胞内表达水平的影响通过缺失突变发现位于PI-II终止子Poly(A)信号下游100bp一段含8bp组成的保守序列CGTGTTTT对于基因高效表达是必需的.这段序列广泛存在于动、植物的转录终止子内(YGTGTTYY),这段序列的缺失将极大地影响基因表达水平.

3`端来源5`-端来源马铃薯PI-IIT-DNAgene6BT-DNAgene7马铃薯PI-II高低低CaMV35S高低低9CGTGTCTT15-20

AAUAAA~100CGTGTTTT

不同来源的有着很大影响。使用35S启动子与NPTII结构基因形成共整合体，并于不同来源的终止子构建成融合基因，转化烟草。发现不同的终止子使NPTII基因的表达水平可相差60倍。植物基因的终止密码子多用UGA，而在双子叶植物中，UAA的使用频率高于UGA。四.5`-端内含子对外源基因的表达调控作用1.5`-端内含子的特点.2.5`-端内含子对外源基因表达的促进玉米SHI5`-端内含子,胚乳蔗糖酶基因(6kb)16exon,在启动子后面有一段非编码的外显子,并紧随着一个大的内含子(intronI,1028bp)PexonintronIIintronintron

+1ATG6kb四.5`-端内含子对外源基因的表达调控作用玉米shrunk基因内含子1(shiintron)的存在对cat酶活性表达的影响Sh1promoterintronI(1028bp)catgenecat活性(rice)

58

0

1P35S

数10倍0

1四.5`-端内含子对外源基因的表达调控作用玉米shrunkgene1外显子1(exon1)的作用Promotercatcat在玉米,水稻细胞中的表达活性

1

intronl

100

exoI10

1000shrunkgene1内含子的存在对catgene在烟草植株内的表达有抑制作用.四.5`-端内含子对外源基因的表达调控作用3.作用机理:

5`-端内含子并不具有增强子那样的结构和序列,内含子促进基因表达是通过增加mRNA活性以及提高mRNA含量来实现的.可能还包括增加mRNA稳定性既促进mRNA成熟等作用.五.外源基因在转(翻)译水平的调控1.mRNA结构对翻译的影响

S-D序列(Shine-Dalgarno)核糖体结合位点.原核mRNA翻译起始所必需,细菌中3-9bp组成.在mRNA上与16S核糖体RNA3’端互补，从而控制翻译的起始.真核生物中无此结构,但有帽子到AUG之间的先导序列(leader),可以形成二级结构被核糖体识别,依此来调节翻译的速度。往往二级结构多对翻译不利.五.外源基因在转翻译水平的调控2.翻译增强因子对转录的影响(1)TMVΏ因子来自TMV126KD蛋白基因的转录序列5`-末端的非翻译区,68nt组成.在AUG之前,并有3个8nt组成的重复序列.在AUG前51处,Ώ因子提供了另外一个核糖体结合位点.推测Ώ因子促进mRNA翻译是通过提供一个额外的核糖体结合位点实现的.体外实验证明:5`含Ώ因子的GUS基因的mRNA在烟草细胞内的翻译水平比不用Ώ因子高64倍.而且对植物动物和微生物细胞的翻译都有促进作用.五.外源基因在转翻译水平的调控2.翻译增强因子对转录的影响(2)AMV的Ώ样因子 AMVRNA的436nt的先导序列也具有提高外源基因的翻译活性的功能. 推测是由于这段序列不形成特定的二级结构,从而提高翻译的效率。这与Ώ因子正好相反. 常用Ώ及Ώ样因子提高翻译效率,使外源基因有效表达.五.外源基因在转翻译水平的调控Ώ因子对翻译的促进GUSmRNAGUS活性1Ώ因子GUSmRNA64Ώ因子:68nt组成来源于TMV126KD的转录序列5`-端非翻译区,含有3个8nt的重复序列-51处可能提供了一个额外的核糖体结合位点.五.外源基因在转翻译水平的调控3.碱基组成

植物基因的GC含量显著高于细菌.4.密码子的偏好性密码子的通用性.植物基因在编码氨基酸的同义密码子之间的选择上是有偏好的(codonbias).由于密码的兼并性和摆动性而产生选择偏好即第三位选择G,C还是A,U.例:植物叶绿体线粒体基因同义密码子第三位更偏爱AUNNA/U>65%绿藻,氰化细菌爱GC,NNG/C>90%,植物核基因单子叶GCNNG/C>75%,

双子叶轻微偏好NNG/C>55%.五.外源基因在转翻译水平的调控5.起始密码周边序列的影响不同类型的细胞对mRNA起始周边序列有不同的要求,植物倾向于AXA*ATGGC.有资料显示，ATG之前第三位的A对翻译效率影响很大。例:向植物中引入Bt基因的改造6.信号肽序列对转化外源基因翻译产物的调控作用

翻译的完成不是基因表达的结束，初级翻译产物并不具有生物活性，称之为前体蛋白。它通常还需要加工、修饰和正确折叠才能成为有活性的蛋白。前体蛋白的信号肽与活性蛋白的成熟有关、也与蛋白质的运输和分泌有关。五.外源基因在转翻译水平的调控6.信号肽序列对外源基因的翻译蛋白的运输和定向作用 翻译的完成不是基因表达的结束，初级翻译产物并不具有生物活性，称之为前体蛋白。它通常还需要加工、修饰和正确折叠才能成为有活性的蛋白。前体蛋白的信号肽与活性蛋白的成熟有关、也与蛋白质的运输和分泌有关。 分泌型 运转型 根据目的基因的蛋白起作用的部位选择相应的信号肽DNA序列，构成融合基因，使其融合表达六.转基因植物中外源DNA整合的遗传效应 对基因表达的影响遗传效应：位置效应（positioneffect）重组（重排）效应（recombination）甲基化（methylation）

转基因沉默（transgenesilencing）六.转基因植物中外源DNA整合的遗传效应 对基因表达的影响（一）位置效应Hilder认为，位置效应是由于插入位点附近染色体的微环境影响了外源基因启动子的表达所致。等容线（isochore):在染色体的各个区段，碱基组成是不均匀的，在某些区段常含有固定的较高的GC碱基对，这样的组成方式，称为等容线。产生易于识别的甲基化位点例：玉米al基因转化的烟草株系之一，al失活测序结果显示，al基因与插入位点两侧碱基组成差异太大。Al基因47.5％AT烟草插入点5‘74％AT3’77％ATIglesias等烟草试验：六.转基因植物中外源DNA整合的遗传效应 对基因表达的影响(二）重组（重排）效应转基因很容易被植物基因组的重组和修复系统所识别，结果将使外源DNA不同程度的重排。转基因的同源和非同源的重组必然引起DNA的易位、缺失、重复等结构变化。Peerbolte(1996)用Ti质粒转化烟草DNA结构分析证明基因在转化细胞中发生缺失、重排和扩增，导致表型变异。Southern杂交除了目的基因的杂交带外，还有大小不一的条带。说明外源基因在受体细胞内存在结构、拷贝数等有差异，是由于整合时引起的DNA重组造成的。六.转基因植物中外源DNA整合的遗传效应 对基因表达的影响（三）甲基化作用（Methylation)高等植物DNA中大约30％的胞嘧啶核苷酸残基被甲基化，抑制基因的表达。是由于甲基化酶作用，真核细胞中多发生在CG二核苷酸对。对基因表达的作用1.影响DNA与蛋白质的相互识别 2.影响DNA的构像。Z－DNA去甲基化试剂如：5－azac可以认为去甲基化实验例证：朱祯发生甲基化的机理或原因：限制修饰系统、基因组免疫功能（genomicimmunefunction)识别，(等容线差异识别）六.转基因植物中外源DNA整合的遗传效应 对基因表达的影响（四）转基因沉默 转基因在受体植物中往往不能稳定表达，有时甚至完全不表达，出现了所谓的转基因沉默现象（transgenesilencing）。是指利用遗传转化方法导入并稳定整合进受体细胞中的完整的外源基因在当代转化体或在其后代中表达受到抑制的现象。

转基因沉默的机理

外源基因进入受体细胞核后，会受到多种因素的作用，根据其作用机制和水平不同可分为三种：位置效应（positioneffect）、转录水平的基因沉默（transcriptionalgenesilencing，TGS）和转录后水平的基因沉默（post-transcriptionalgenesilencing，PTGS）。

涉及DNA-DNADNA-RNARNA-RNA分子之间的相互作用转录水平的基因沉默转录水平的基因沉默是DNA水平上基因调控的结果，主要是由启动子甲基化或导入基因异染色质化所造成的。二者都和转基因重复序列有密切关系。

重复序列可导致自身甲基化。外源基因如果以多拷贝的形式整合到同一位点上，形成首尾相连的正向重复（directrepeat）或头对头、尾对尾的反向重复（invertedrepeat），则不能表达。而且拷贝数越多，基因沉默现象越严重。这种重复序列诱导的基因沉默（repeat-inducedgenesilencing，RIGS）可能是重复序列间自发配对，甲基化酶特异性地识别这种配对结构而使其甲基化，从而抑制其表达。此外，重复序列间的相互配对还可以导致自身的异染色质化。其机理可能是异染色质化相关蛋白质识别重复序列间配对形成的拓扑结构，与之结合，并将重复序列牵引到异染色质区，或直接使重复序列局部异染色质化。

转录后水平的基因沉默转录后水平的基因沉默是RNA水平基因调控的结果，比转录水平的基因沉默更普遍。特别是共抑制（cosuppression）共抑制是指在外源基因沉默的同时，与其同源的内源DNA的表达也受到抑制。转录后水平的基因沉默的特点是外源基因能够转录成mRNA，但正常的mRNA不能积累，也就是说mRNA一经合成就被降解或被相应的反义RNA或蛋白质封闭，从而失去功能。可能是由于同源或重复的基因表达了过量mRNA的结果。有人提出，细胞内可能存在一种RNA监视机制用以排除过量的RNA。当mRNA超过一定的域值后，就引发了这一机制。特异性的降解与外源基因同源的所有RNA。此外，过量的RNA也可能和同源的DNA相互作用导致重新甲基化，使基因失活。

共抑制，矮牵牛CHS（四）转基因沉默转基因沉默的机理重复序列是基因沉默的普遍诱因，甲基化是基因沉默的直接原因上述三种机制并不是独立的，而是相互关联的。基因沉默机制在核酸水平上均是DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA相互作用的结果，所以人们认为对基因沉默机制的研究开启了认识DNA水平及RNA水平上调节基因表达的新纪元，并提出了基因免疫，即基因组对外源基因入侵有抵抗能力的新观念。六.转基因植物中外源DNA整合的遗传效应 对基因表达的影响克服转基因沉默的策略

1、转基因密码子优化及转化载体的合理修饰，使用具有组织和发育特异性调控作用的增强子：由于转基因DNA序列与受体植物基因组DNA碱基不同是引发DNA甲基化的重要原因，所以在开展遗传转化前非常有必要对转基因进行密码子的优化工作，尽量使用植物偏爱密码子。为避免反式失活及共抑制，转化载体中应尽量避免使用相同的启动子及重复序列并保证载体上的构建序列应在同一个方向阅读以免产生异常或反义RNA。六.转基因植物中外源DNA整合的遗传效应 对基因表达的影响

2、在有性生殖后代中筛选单拷贝转基因个体，避免多拷贝引起的转基因沉默：如利用southern杂交，反向PCR等来确定，如采用常规的杂交、回交等，通过分析后代分离比来确定。筛选到单拷贝转基因个体后，要对转基因纯合株系转基因表达的稳定性进行鉴定。可以通过组培来了解环境胁迫引起的转基因的甲基化，并结合不同田间条件及不同遗传背景开展转基因表达稳定性的鉴定。

六.转基因植物中外源DNA整合的遗传效应 对基因表达的影响

3、选择合适转化方法以及在遗传转化方法上的改进： 基因直接转化法极易导致多拷贝转基因在宿主细胞中的整合，最终导致转基因沉默。农杆菌介导的遗传转化法由于其产生的拷贝数相对较少，可以在一定程度上避免这个问题。（1）选用基于Ac/Ds转座系统建立的转化载体：该转化载体能扩大寄主范围，提高转化效率及转基因位点的质量。（