第五章-转录机制(Mechanisms-of-Transcription)课件

WelcometoMyMolecularBiologyClassYangYang（杨洋教授）

HuazhongUniversityofScienceandTechnologyWelcometoMyMolecularBiolog2MolecularBiologyoftheGene,5/E

---Watsonetal.(2004)PartI:ChemistryandGeneticsPartII:MaintenanceoftheGenome

PartIII:ExpressionoftheGenomePartIV:RegulationPartV:Methods2MolecularBiologyoftheGeneTherevisedcentraldogmaRNAprocessingGeneregulation基因组的保持基因组的表达TherevisedcentraldogmaRNAp4Ch12:Mechanismsoftranscription

Ch13:RNAsplicingCh14:TranslationCh15:ThegeneticcodePartIII:ExpressionoftheGenome4Ch12:MechanismsoftranscriChapter5:MechanismsofTranscription

（转录机制）Chapter5:MechanismsofTransRNApolymeraseandthetranscriptioncycle（RNA聚合酶和转录周期）Thetranscriptioncycleinbacteria（细菌的转录周期）Transcriptionineukaryotes（真核生物的转录）OutlineRNApolymeraseandthetranscrTranscriptionvsreplication7TranscriptionischemicallyandenzymaticallyverysimilartoDNAreplication.转录在化学和酶学上与DNA的复制非常相似，都是通过酶的作用合成一条与DNA模板互补的核酸链Transcriptionvsreplication7T8Someimportantdifferences:RNAismadeofribonucleotides（核糖核苷酸）RNApolymerasecatalyzesthereaction,whichdoesnotrequireaprimer(denovosynthesis，从头合成)TheRNAproductdoesnotremainbase-pairedtothetemplateDNAstrand（RNA产物不与模板DNA链的碱基保存互补状态，将正在延长的链从模板上置换下来）Lessaccurate(errorrate:10-4)，不如复制更为精确（errorrate:10-7）--why?8Someimportantdifferences:RN9Transcriptionselectivelycopiesonlycertainpartsofthegenomeandmakesonetoseveralhundred,oreventhousand,copiesofanygivensectionofthegenome.

转录是有选择性地复制基因组的特定部分，并从任何特定部分产生1个到几百个甚至上千个拷贝。

转录区域的选择并不是随机的，每个转录区通常包括一个或多个基因，而且在每个转录区域的首端和尾端都存在特定的DNA序列指导转录的起始和终止。复制：必须将整个基因组全部拷贝，并且在每次细胞分裂时进行一次（只能一次）

9Transcriptionselectivelycop10Fig12-1TranscriptionofDNAintoRNATranscriptionbubble转录泡10Fig12-1TranscriptionofDN11Topic1:

RNAPolymeraseandTheTranscriptionCycle11Topic1:

RNAPolymerasean121.1RNApolymerasescomeindifferentforms,butsharemanyfeatures

RNA聚合酶具有不同形式，但有很多共同特性RNApolymerasesperformsessentiallythesamereactioninallcells从细菌到哺乳动物细胞的RNA聚合酶都是由多个亚基组成的BacteriahaveonlyasingleRNApolymeraseswhileineukaryoticcellstherearethree:RNAPolI,IIandIII121.1RNApolymerasescomein13RNAPolIIisthefocusofeukaryotictranscription,becauseitisthemoststudiedpolymerase,andisalsoresponsiblefortranscribingmostgenes-indeed,essentiallyallprotein-encodinggenes（RNA聚合酶II复责转录所有蛋白质编码基因）RNAPolItranscribethelargeribosomalRNAprecursorgene（聚合酶I复责转录大核糖体RNA前体基因）RNAPolIIItranscribetRNAgene,somesmallnuclearRNAgenesandthe5SrRNAgenes（聚合酶III负责转录tRNA基因以及5SrRNA基因）13RNAPolIIisthefocusofe14Table12-1:ThesubunitsofRNApolymerases（RNA聚合酶的亚基）14Table12-1:Thesubunitsof15ThebacterialRNApolymeraseThecoreenzyme

alonesynthesizesRNA细菌RNA聚合酶的核心酶可以独立合成RNA（由亚基的两个拷贝，，‘，亚基各一个拷贝组成）aabb’w15ThebacterialRNApolymerase16aab’wRPB3RPB11RPB2RPB1RPB6Fig12-2RNAPComparisonThesamecolorindicatethehomologousofthetwoenzymesprokaryoticeukaryoticb，‘亚基与RPB1，RPB2同源亚基与RPB3，RPB11同源亚基与RPB6同源16aab’wRPB3RPB11RPB2RPB1RPB6Fi细菌RNA聚合酶的，‘亚基与RNA聚合酶II的RPB1，RPB2是同源的细菌RNA聚合酶的亚基与RNA聚合酶II的RPB3，RPB11是同源的细菌RNA聚合酶的亚基与RNA聚合酶II的RPB6是同源的细菌RNA聚合酶的，‘亚基与RNA聚合酶II的RPB1，18“Crabclaw（蟹爪）”shapeofRNAP

Activecentercleft(活性中心裂隙）18“Crabclaw（蟹爪）”shapeofRNA每一个酶的形状像一只蟹爪蟹爪的两个钳子主要是由酶的两个最大亚基组成（细菌：，‘亚基，真核生物：RPB1，RPB2亚基）酶的活性位点是由这两个亚基的一些区域共同组成的，活性位点可以结合两个Mg2+每一个酶的形状像一只蟹爪20TherearevariouschannelsallowingDNA,RNAandribonucleotides(rNTPs)intoandoutoftheenzyme’sactivecentercleft有多种通道允许DNA，RNA,rNTP进出这些酶的活性中心裂隙20Therearevariouschannelsa211.2TranscriptionbyRNApolymeraseproceedsinaseriesofsteps

由RNA聚合酶进行的转录是由一系列步骤完成的

--转录周期InitiationElongationTermination211.2TranscriptionbyRNApol转录起始转录延伸转录终止转录起始转录延伸转录终止231.InitiationPromoter（启动子）:theDNAsequencethatinitiallybindstheRNApolymerase

启动子是最初结合RNA聚合酶的DNA序列Thestructureofpromoter-polymerasecomplexundergoesstructuralchangestoproceedtranscription

启动子-聚合酶复合体一旦形成就发生结构改变，以使转录过程继续进行DNAatthetranscriptionsiteunwindsanda“bubble”forms

DNA在转录将要开始的部位展开，碱基对断裂，产生一个单链DNA的“泡”DirectionofRNAsynthesisoccursina5’-3’direction(3’-endgrowing)

转录总是从5’端向3‘端的方向进行的，但是只有一条链作为模板来合成RNA链启动子的选择决定了哪一段DNA将转录，这也是对转录进行调控的主要步骤231.InitiationPromoter（启动子）:24Transcriptioninitiationinvolves3definedsteps

转录起始又包括三个定义明确的步骤Formingclosedcomplex（形成闭合式复合体）Formingopencomplex（形成开放式复合体）Promoterescape:stableternarycomplex（启动子逃离，形成稳定的三重复合体-酶，DNA和RNA，向延伸阶段的转变）24Transcriptioninitiationinv25Fig12-3-initiationBinding(closedcomplex)Promoter“melting”(opencomplex)Initialtranscription25Fig12-3-initiationBinding(26

TheinitialbindingofpolymerasetoapromoterDNAremainsdoublestranded（DNA保持双链状态）Theenzymeisboundtoonefaceofthehelix（聚合酶结合在DNA双螺旋的一个面上）Closedcomplex（闭合式复合体）26

Theinitialbindingofpol27Opencomplex（开放式复合体）

闭合式复合体向开放式复合体的转变theDNAstrandseparateoveradistanceof~14bp

(-11to+3)aroundthestartsite(+1site)DNA双链在转录起始位点周围大约14bp的距离内分开以形成转录泡transcriptionbubble（转录泡）

forms

27Opencomplex（开放式复合体）

闭合式复合体向DNA的展开使模板链得以释放。头两个核糖核苷酸被带入活性位点，排列在模板链上，并彼此结合然后聚合酶开始沿着模板链移动，解开聚合反应位点前方的DNA双螺旋并允许其在后面重新闭合最初大约10个左右的核糖核苷酸的结合是一个效率相当低的过程，在这一阶段聚合酶常释放出很短的转录物（每一个都短于10个左右的核苷酸），然后重新开始合成一旦超过10个bp,聚合酶就可以逃离启动子DNA的展开使模板链得以释放。头两个核糖核苷酸被带入活性位点29StableternarycomplexTheenzymeescapes

fromthepromoterThetransitiontotheelongationphase（起始阶段向延伸阶段的转变）Stableternarycomplex（稳定的三重复合体）=DNA+RNA+enzyme（RNA聚合酶）29StableternarycomplexTheen302.ElongationOncetheRNApolymerasehassynthesizedashortstretchofRNA(~10nt),transcriptionshiftsintotheelongationphaseThistransitionrequiresfurtherconformationalchangeinpolymerasethatleadsittogripthetemplatemorefirmly.需要聚合酶构象的进一步改变，以使其能够更牢固地与模板结合302.ElongationOncetheRNApol延伸阶段RNA聚合酶的功能:synthesisRNA（催化RNA合成）unwindstheDNAinfront,re-annealsitbehind（解开前方的DNA，又使后方的DNA重新复性）dissociatesthegrowingRNAchain

（在移动的同时，逐步分开正在延长的RNA链与模板的配对）执行校对功能延伸阶段RNA聚合酶的功能:323.TerminationAfterthepolymerasetranscribesthelengthofthegene(orgenes),itwillstopandreleasetheRNAtranscript（一旦完成转录，必须释放RNA产物）Insomecells,terminationoccursatthespecificandwell-definedDNAsequencescalledterminators（终止序列）.Some

cellslacksuchterminationsequences323.TerminationAfterthepolymFig12-3-ElongationandterminationTerminationElongationFig12-3-Elongationandtermin34Topic2

Thetranscriptioncycleinbacteria

（细菌的转录周期）34Topic2

Thetranscriptioncy352-1Bacterialpromotersvaryinstrengthandsequences,buthavecertaindefiningfeatures

（细菌的启动子在强度和序列上是多样的，但是具有某些明确的特征)原则上，细菌的核心RNA聚合酶可以在DNA上任何一点开始转录但是在细胞内，聚合酶只在启动子处起始转录—why?一个称为s因子的添加，使得核心酶转变为只在启动子处开始转录的形式--RNA聚合酶全酶（Holoenzyme）352-1Bacterialpromotersvary36Figure12-4,Holoenzyme=factor+coreenzyme

Incell,RNApolymeraseinitiatestranscriptiononlyatpromoters.Whoconfersthepolymerasebindingspecificity?--σfactorσfactorcoreenzyme36Figure12-4,Holoenzyme=Inc37

ThepredominantsfactorinE.coliiss70(大肠杆菌中最常见的s因子-s70）Promoterrecognizedbys70containstwoconservedsequences

(-35and–10regions/elements)separatedbyanon-specificstretchof17-19nt

-35区，-10区Position+1isthetranscriptionstartsite（转录起始位点定义为+1）PromotersrecognizedbyE.coli

sfactor37

Thepredominantsfactori38Fig12-5a:bacterialpromoterThedistanceisconserveds70promoterscontainrecognizable

–35and–10regions,butthesequencesarenotidentical2.Comparisonofmanydifferentpromotersderivestheconsensussequences（共有序列）

reflectingpreferred–10and–35regions

通过对许多不同启动子的比较，可以得到一个共有序列，共有序列反映了首选的-10和-35区域，被最适宜的长度（17bp)所分隔38Fig12-5a:bacterialpromote39BOX12-1Figure1Consensussequenceofthe-35and-10regionTTGACATATAAT39BOX12-1Figure1Consensuss-35element(-35box):TTGACA-10element(-10box):TATAAT-35element(-35box):TTGACA41Promoterswithsequencesclosertotheconsensusaregenerally“stronger”thanthosematchlesswell.(Whatdoes“stronger”mean?)

（具有与共有序列更近似的序列的启动子要比那些匹配较差的启动子“更强”）4.Thestrengthofthepromoterdescribeshowmanytranscriptsitinitiatesinagiventime.

（启动子强度指一个启动子在一定时间内可以起始多少个转录物）5.决定启动子强度因素：启动子最初与聚合酶的结合程度对异构化作用的支持效率聚合酶逃离启动子的难易程度41Promoterswithsequencesclo42Fig12-5bbacterialpromoterConfersadditionalspecificityUP-element（UP元件）isanadditionalDNAelementsthatincreasespolymerasebindingbyprovidingtheadditionalinteractionsiteforRNApolymerase在较强启动子中（如指导rRNA基因表达的启动子）存在一种额外的与RNA聚合酶结合的DNA元件--UP元件UP元件可以通过提供额外的相互作用位点来增强RNA聚合酶与DNA的结合42Fig12-5bbacterialpromoter43Fig12-5cbacterialpromoterAnotherclassofs70promoterlacksa–35regionandhasan“extended–10element”（延长的-10元件）

compensatingfortheabsenceof–35region43Fig12-5cbacterialpromoter结合自己博士阶段的研究工作讲解启动子的结构与功能结合自己博士阶段的研究工作讲解启动子的结构与功能本人博士阶段课题：来源于嗜盐古生菌的RM07DNA片段在三域模式生物中的启动子功能研究导师：沈萍教授（武汉大学）本人博士阶段课题：来源于嗜盐古生菌的RM07DNA片段在三2022/10/1446Woese三域(Domain)分类系统2022/10/1146Woese三域(Domain)分类系第五章-转录机制(Mechanisms-of-Transcription)课件三域生物的系统发育树：

Woese首先提出了生命的第三种形式-古生菌（Archaea），并将地球上的生物划分为三域（domain）：真细菌（Bacteria）、古生菌(Archaea)和真核生物(Eukarya)三域生物的系统发育树：古生菌域可分为三界：古生古菌界（Korarchaeota）、泉古生菌界（Crenarchaeota）、广古生菌界（Euryarchaeota）一般生活在其它生物难以存活的极端环境中，如高温（100℃以上）、高酸（pH1～4）、高碱（pH10～12）、高盐（2.5～5.2M）以及厌氧环境等，极端环境微生物古生菌的分类古生菌的分类(一）类似于真细菌的特征：原核生物，细胞内无定型细胞核，细胞形态和大小类似于真细菌双链闭合环状染色体结构，许多功能上相关的基因组成一个共转录的操纵元结构基因组大小一般在1.5-4.0×106bp范围内，大小和组织结构类似于真细菌二分分裂的方式进行繁殖代谢途径类似于真细菌古生菌奇妙的融合生命特征(一）类似于真细菌的特征：古生菌奇妙的融合生命特征（二）类似于真核生物的特征：DNA复制、转录和翻译等遗传信息传递系统DNA复制装置类似于真核生物，许多参与复制的蛋白质都与真核生物的同功能蛋白质具有同源性和相似性基本转录装置（包括RNA聚合酶、基本转录因子、启动子元件等）也与真核生物非常类似翻译起始蛋白质因子与真核生物的相关蛋白质具有同源性，氨酰tRNA合成酶也更接近于真核生物（二）类似于真核生物的特征：DNA复制、随着越来越多的古生菌全基因组序列的测定和体外转录系统的建立，人们在分子水平上对于古生菌的转录机制及其调控有了更加全面深入的认识古生菌实际上既具有类似于真核生物的基本转录装置，又具有类似于真细菌的转录调控机制（Belletal.,2001)。古生菌转录系统的融合特征古生菌转录系统的融合特征启动子（promoter)三域生物的启动子结构比较启动子（promoter)三域生物的启动子结构比较来源于嗜盐古生菌基因组的492bpRM07片段的DNA序列及其结构特征。含有典型的真细菌启动子-35和-10区特征序列和3个串联排列的嗜盐古生菌启动子特征序列—DPE（distalpromoterelement）。来源于嗜盐古生菌基因组的492bpRM07片段的DNARM07片段在真细菌（大肠杆菌）中的启动子功能研究（一）RM07片段以正反两个方向插入pKK232-8上携带的氯霉素抗性基因（cat）上游的质粒的构建RM07片段在真细菌（大肠杆菌）中的启动子功能研究（一）RM大肠杆菌启动子探针载体pKK232-8大肠杆菌启动子探针载体pKK232-8（三）三种转化子菌株中氯霉素抗性基因（cat）的表达检测I氯霉素抗性检测Cm:0μg/mlCm:25μg/mlCm:250μg/ml三种转化子菌株：HB101/pKK232-8、HB101/pKK232-07-1(+)和HB101/pKK232-07-1(-)的氯霉素抗性检测。Cm:氯霉素。1：HB101/pKK232-07-1(+)2：HB101/pKK232-83：HB101/pKK232-07-1(-)（三）三种转化子菌株中氯霉素抗性基因（cat）的表达检测III氯霉素抗性基因（cat）所编码的氯霉素乙酰转移酶（CAT）酶蛋白浓度的测定①HB101/pKK232-8、HB101/pKK232-07-1(-)菌株中均未能检测到CAT酶蛋白②HB101/pKK232-07-1(+)菌株产生的CAT酶蛋白浓度为2.55ng/mlII氯霉素抗性基因（cat）所编码的氯霉素乙酰转移酶①H总RNA提取。A:TotalRNAnotdigestedbyDNase；B,C:TotalRNAdigestedbyDNase。23SrRNA16SrRNA5SrRNAABCIII利用RT-PCR技术检测转化子菌株中cat基因的转录总RNA提取。A:TotalRNAnotdigesRT-PCR检测大肠杆菌转化子菌株中cat基因的转录。结果表明RM07片段在大肠杆菌中具有启动子活性，能够启动cat基因的转录。

泳道a：DL2000DNAmarker泳道b:HB101/pKK232-07-1（+）泳道c:HB101/pKK232-8（阴性对照）III利用RT-PCR技术检测转化子菌株中cat基因的转录RT-PCR检测大肠杆菌转化子菌株中cat基因的转录。结果表RM07片段的缺失突变分析RM07片段的缺失突变分析来源于嗜盐古生菌基因组的492bpRM07片段的DNA序列及其结构特征。含有典型的真细菌启动子-35和-10区特征序列和3个串联排列的嗜盐古生菌启动子特征序列—DPE（distalpromoterelement）。来源于嗜盐古生菌基因组的492bpRM07片段的DNA（一）RM07片段在大肠杆菌（真细菌）中的缺失突变分析

RM07不同缺失片段插入cat基因上游的质粒的构建PCR反应得到一系列含有RM07片段不同区域的缺失片段（一）RM07片段在大肠杆菌（真细菌）中的缺失突变分析RM1bp355bp395bp492bp492bpRM07fragmentE.coli

plasmid165bpCmresistancelevel(µgml-1)

pKK232-07-125050

DPEII-10boxpKK232-07-4200<4pKK232-07-3<4DPEIDPEIIICm:氯霉素pKK232-07-5-35boxpKK232-07-21bp355bp395bp492bp492bpRM07f缺失分析结果小结含有-35区和-10区特征序列的40bp区段(355bp-395bp)是RM07片段在大肠杆菌中具有基础启动子活性的重要功能区。缺失分析结果小结含有-35区和-10区特征序列的40bp区RM07片段的定点诱变分析RM07片段的定点诱变分析RM07片段中-35区序列的定点诱变.Cm:氯霉素。RM07片段中-35区序列的定点诱变.Cm:氯霉素。第五章-转录机制(Mechanisms-of-Transcription)课件RM07片段中-10区序列的定点诱变.Cm:氯霉素。RM07片段中-10区序列的定点诱变.Cm:氯霉素。SarkarG,SommerSS.ThemegaprimermethodofsiteDirectedmutagenesis.Biotechniques,1990,8(4):404~407.SarkarG,SommerSS.ThemegaRM07启动子可能的转录起始位点的定点诱变.Cm:氯霉素。RM07启动子可能的转录起始位点的定点诱变.Cm:氯霉素。利用定点诱变技术对RM07片段中的不同碱基进行了突变，检测了不同碱基突变对RM07片段在大肠杆菌中的启动子活性的影响。进一步确证了根据序列分析所推断的-35区和-10区序列是负责RM07片段在大肠杆菌中启动子活性的重要功能区。初步鉴定了可能的转录起始位点。总结利用定点诱变技术对RM07片段中的不同碱基进行了突变，检测了732-2Thesfactormediatesbindingofpolymerasetothepromoter

（s因子介导聚合酶与启动子的结合）Thes70factorcomprisesfourregionscalledsregion1tosregion4732-2Thesfactormediatesbi74Fig12-6:regionsofsRegion4recognizes-35elementRegion2recognizes-10

elementRegion3recognizestheextended–10element区域2.3复责DNA的解旋74Fig12-6:regionsofsRegion区域4内的两个螺旋形成一个常见的DNA结合基序（motif)---螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helixmotif）其中一个螺旋插入到-35区域的大沟（majorgroove)并与该区的碱基相互作用；另一个螺旋则从大沟的顶部横过，与DNA骨架接触-35区域仅是提供能量以确保聚合酶和启动子结合。但是-10区域在转录起始过程中有更为精细的任务-10区域处在闭合复合体向开放复合体转变时DNA解旋区。因此与-10区域相互作用的σ因子还参与其它功能。例如：参与识别-10区域的螺旋可以和非模板链上的碱基相互作用，以维持解旋DNA的稳定性区域4内的两个螺旋形成一个常见的DNA结合基序（motif)76Bindingof–35Twoheliceswithinregion4formacommonDNA-bindingmotif,calledahelix-turn-helixmotifFig5-20*Helix-turn-helixDNA-bindingmotifOnehelixinsertsintotheDNAmajorgrooveinteractingwiththebasesatthe–35region.Theotherhelixliesacrossthetopofthegroove,contactingtheDNAbackbone76Bindingof–35Twohelicesw77Interactionwith–10ismoreelaborate(精细)andlessunderstood

The-10regioniswithinDNAmeltingregionTheahelixrecognizing–10caninteractswithbasesonthenon-templatestrandtostabilizethemeltedDNA.77Interactionwith–10ismore78UP-elementisrecognizedbyacarboxylterminaldomainofthea-subunit(aCTD),butnotbysfactor

与启动子内的其它元件不同，UP元件并不被s因子识别，而是由聚合酶亚基的羧基末端域（CTD)来识别Fig12-7sandasubunitsrecruitRNApolcoreenzymetothepromoter（s和a亚基将RNA聚合酶核心酶募集到启动子上）78UP-elementisrecognizedby如何证明UP元件由聚合酶亚基的羧基末端域（CTD)来识别的？研究思路？？学习和借鉴！！如何证明UP元件由聚合酶亚基的羧基末端域（CTD)来研究论文（原始研究工作）的学习Athirdrecognitionelementinbacterialpromoters:DNAbindingbythealphasubunitofRNApolymerase

Science，1993，262：1407-1413

研究论文（原始研究工作）的学习Athirdrecogni强启动子：rrnBP1基因启动子，克隆到质粒上88：-88到+1位之间的野生型序列（包含UP）SUB：在-59到-41位之间含有取代UP元件的无关序列41：缺失-41位的UP元件lacUV5:无UP元件的lac启动子Vector:无启动子插入的质粒聚合酶亚基缺失C端的94个氨基酸质粒体外转录RNA聚合酶的亚基在UP元件识别中的重要性强启动子：rrnBP1基因启动子，克隆到质粒上聚合酶亚基82Fig12-5bbacterialpromoterConfersadditionalspecificityUP-element（UP元件）isanadditionalDNAelementsthatincreasespolymerasebindingbyprovidingtheadditionalinteractionsiteforRNApolymerase在较强启动子中（如指导rRNA基因表达的启动子）存在一种额外的与RNA聚合酶结合的DNA元件--UP元件UP元件可以通过提供额外的相互作用位点来增强RNA聚合酶与DNA的结合82Fig12-5bbacterialpromoter832-3TransitiontotheopencomplexinvolvesstructuralchangesinRNApolymeraseandinthepromoterDNA

（向开放式复合体的转变过程涉及RNA聚合酶和启动子DNA的结构变化）从闭合复合体到开放复合体的转变涉及聚合酶的结构变化，以及DNA双链的打开，暴露出模板链和非模板链相对于转录起始位点，这一“融化”发生在-11和+3之间的区域transitioniscalledIsomerization(异构化)它不需要从ATP水解中获得能量，而是DNA-酶复合体的构象自发地变成一种在能量上更具优势的形式的结果异构化作用本质上是不可逆的，一旦异构化完成，转录将会随后起始832-3Transitiontotheopenc84theopeningoftheDNAdoublehelix,called“melting”（融化）,atpositions-11and+3.ChangeofthepromoterDNA84theopeningoftheDNAdoubl852.4TranscriptionisinitiatedbyRNApolymerasewithouttheneedforaprimer

（转录由RNA聚合酶起始，不需要引物）起始的核糖核苷酸被带到活性位点内，并稳定地保持在模板上，同时下一个核苷三磷酸以正确的几何形态呈递，使聚合的化学过程得以发生RNA聚合酶的转录物大多是以腺嘌呤核苷酸（A）开始的，此核苷酸仅通过两个氢键与模板核苷酸（T）结合852.4Transcriptionisinitiat聚合酶必须与起始核苷酸建立特异性的相互作用，严格控制其处于正确的方向，使其可以对引入的核苷三磷酸开始进行化学反应此相互作用对于核苷酸（A）是特异的，因此只有以A开始的链才能以适于高效起始的方式固定聚合酶必须与起始核苷酸建立特异性的相互作用，严格控制其处于正Initiationrequires:TheinitiatingNTP(usuallyanA)isplacedintheactivesiteTheinitiatingATPisheldtightlyinthecorrectorientationbyextensiveinteractionswiththeholoenzymeInitiationrequires:882.5RNApolymerasesynthesizesseveralshortRNAsbeforeenteringtheelongationphase

（RNA聚合酶在进行延伸阶段之前会合成

几段短的RNA）一旦核苷酸进入活性位点并且RNA开始合成，接下来就进入“流产性起始”时期（Abortiveinitiation）聚合酶会合成一些长度小于10个核苷酸的RNA分子，但不会继续延伸，而是从聚合酶上脱离但是聚合酶并不从模板上脱离，而是重新开始合成RNA一旦成功合成了一条超过10个碱基的RNA，一个稳定的三重复合体就形成了，包括聚合酶、DNA模板和增长中的RNA----延伸阶段的开始，直至转录终止882.5RNApolymerasesynthesizAbortiveinitiation:theenzymesynthesizesandreleasesshortRNAmoleculeslessthan10nt.Abortiveinitiation:theenzym902.6TheelongatingpolymeraseisaprocessivemachinethatsynthesizesandproofreadsRNA

（延伸聚合酶是一个边合成边校对RNA的向前行进的机器）在延伸的任何一个阶段，增长中的RNA链只有8-9个核苷酸与DNA模板保持碱基互补状态，RNA链的其余部分则剥落并从RNA出口通道离开聚合酶902.6Theelongatingpolymeras91Pyrohosphorolyticediting（焦磷酸化编辑）:theenzymecatalyzestheremovalofanincorrectlyinsertedribonucleotidebyreincorporationofPPi.聚合酶利用它的活性位点，在一个简单的逆向反应中，通过重新加入焦磷酸，催化错误插入的核糖核苷酸的去除。然后聚合酶可以将另一个核糖核苷酸加入到增长中的RNA链的相应位置上以这种方式聚合酶既可以去除错误的碱基，也可以去除正确的碱基，但是它在不匹配的位置花的时间更长，所以更常去除前者ProofreadingbyRNApolymerase（RNA聚合酶的两项校对功能）91Pyrohosphorolyticediting（焦磷Hydrolyticediting（水解编辑）:theenzymebacktracksbyoneormorenucleotidesandremovestheerror-containingsequence.聚合酶倒退一个或更多个核苷酸并切开RNA，去除错误的序列ThisisstimulatedbyGrefactor,aelongationstimulationfactor（延伸刺激因子）增强水解编辑的功能确保聚合酶能够有效地延伸，并帮助克服转录在较难转录的序列处“停滞不前”—延伸刺激因子Hydrolyticediting（水解编辑）:th932.7TranscriptionisterminatedbysignalswithintheRNAsequence

（转录是由RNA序列内部的信号终止的）Terminators（终止子）:thesequencesthattriggertheelongationpolymerasetodissociatefromtheDNA终止子的序列引发延伸聚合酶从DNA上脱离并且释放出已合成的RNA链Rho-independent,alsocalledintrinsic(内在)terminator—不需要其它因子的参与就可以引发终止反应（Rho因子非依赖型终止子）Rho-dependent(requiresRhoprotein)—需要一个称为Rho的额外蛋白质来诱发终止反应（Rho因子依赖型终止子）932.7TranscriptionisterminaRho-independentterminator

containsashortinvertedrepeat(~20bp)andastretchof~8A:Tbasepairs.

转录物折叠形成终止发卡破坏终止子序列的突变Rho-independentterminatorcon两个序列元件：一段短的反向重复序列（大约20个核苷酸），其后是一段8个A：T碱基对的序列这些元件要到它们被转录后才会影响聚合酶，即它们是以RNA而不是DNA起作用的被合成的RNA能够通过链内碱基配对形成一个茎-环结构（stem-loop,发卡），此发卡结构通过破坏延伸复合体来引发转录终止发卡结构只有后面跟随着一段A：U碱基对才能有效地发挥终止子作用两个序列元件：一段短的反向重复序列（大约20个核苷酸），其后96Weakestbasepairing:A:U

makethedissociationeasiertranscriptiontermination96Weakestbasepairing:A:Utr由于A:U

碱基对是所有碱基对中最弱的，所以更容易被茎-环结构对转录聚合酶的作用所打断，RNA也因而更容易脱离下来由于A:U碱基对是所有碱基对中最弱的，所以更容易被茎-环结98Rho(r)-dependentterminatorsHavelesswell-characterizedRNAelements,andrequiresRhoproteinforterminationRhoprotein是一个具有6个相同亚基的环状蛋白质，在单链RNA离开聚合酶时与之结合此蛋白还有ATP水解酶活性，一旦与转录物结合，它就利用ATP水解产生的能量将RNA从模板和聚合酶上拽下来98Rho(r)-dependentterminatoRhoprotein是如何被引导到一个特定的RNA分子上的？它结合的位点有某种特异性，这些位点最理想的组成成分是几段约40个核苷酸不折叠为二级结构的序列，富含C碱基特异性的第二个层次是Rho无法与任何正在被翻译的转录物结合。Rho只会终止那些转录已超出一个基因或操纵子的末端但仍在转录的转录物Rhoprotein是如何被引导到一个特定的RNA分子上的100thertranscriptionterminator

Hexamer,OpenringRNAtreadtroughthe“ring”100thertranscriptionterminaMajorshiftsinprokaryotictranscription-Alternativeσfactor

Majorshiftsinprokaryotictr细菌经历逆境：饥饿，热激，缺氮；枯草芽孢杆菌的孢子形成等细菌通过转录的全局性变化对其环境变化作出应答，这些全局性的转录变化是通过RNA聚合酶的变化得以实现的细菌经历逆境：饥饿，热激，缺氮；枯草芽孢Question:Whatisthemechanismofthisshift?WhichpartofRNApolymeraseischanged?Question:WhatisthemechanismThebacterialRNApolymeraseThecoreenzymealonesynthesizesRNAaabb’wThebacterialRNApolymeraseThHoloenzyme=factor+coreenzyme

Holoenzyme=第五章-转录机制(Mechanisms-of-Transcription)课件RNA聚合酶的变化本质上是σ因子的变化，σ因子控制转录的特异性细菌通过转录的全局性变化对其环境变化作出应答，这些全局性的转录变化是通过RNA聚合酶的变化得以实现的RNA聚合酶的变化本质上是σ因子的变化，σ因子控制转录的特ExamplesofregulationbyalternativeσfactorExamplesofregulationbyalteSporulationinBacillussubtilis（枯草芽孢杆菌的孢子形成）研究论文（原始研究工作）的学习Example-1：AlternativeσfactorSporulationinBacillussubtilBacillussubtilis孢子：在饥饿或其它不利条件下形成的坚硬的休眠体Bacillussubtilis孢子：在饥饿或其它不利条件营养生长期形成孢子营养生长期形成孢子通过σ因子的转换来关闭营养生长期基因的转录，开启孢子形成期特异性基因的转录通过σ因子的转换来关闭营养生长期基因的转录，每种σ因子识别一组不同的启动子。营养生长期σ43识别的启动子非常类似于大肠杆菌的启动子，-10，-35区孢子形成的特异性σ因子识别完全不同的序列每种σ因子识别一组不同的启动子。营养生长期σ43识别的questionHowcanweprovethatσfactor(eg.σ29，σE)confersspecificityforsporulationspecificgene?

questionHowcanweprovethatResearchworkofRichardLosick(HarvardUniversity)/losick/ResearchworkofRichardLosicMicrobialDevelopmentTheLosicklaboratorystudiesdifferentiation,morphogenesisandmulticellularityinthespore-formingbacteriumBacillussubtilis.Weinvestigatehowaprogenitorcell(thevegetativebacterium)givesrisetodissimilarprogeny(thecellularcompartmentsofthesporangium)andhowthetwosporangialcompartmentscommunicatewitheachothersotocoordinatedevelopmentalgeneexpressionwiththecourseofmorphogenesis.Westudytheregulatorymechanismsthatgovernsporulationgeneexpressionandnovelpathwaysofintercellularsignaling.Wealsoinvestigatehowthemorphologicalfeaturesofthedevelopingsporeassembleandhowtheydosoattherighttimeandintherightplace.Weareelucidatingthecuesthatgovernproteinsubcellularlocalizationandassemblyofmacromolecularcomplexes.Finally,andtakingadvantageofthediscoverythat“wild”strainsofB.subtilisformarchitecturallycomplexcommunitiesofcellsinwhichsporeformationtakesplacepreferentiallyinfruitingbody-likeaerialstructures,weareinvestigatingthecircuitrythatgovernsmulticellularityandmechanismsthatlinksporeformationtomulticellularity.MicrobialDevelopment首先要证明σ因子赋予某一已知孢子形成基因的特异性在标记核苷酸存在下，用含有σE或者σA的聚合酶来体外转录含有枯草芽孢杆菌DNA的质粒p213σE：σ29，参与孢子形成σA：σ43，营养生长特异性Invitrotranscription:RNApolymerasecontainingdifferentσfactor

重要的是学习好的研究工作的研究思路！首先要证明σ因子赋予某一已知孢子形成基因的特异性在标记核苷酸质粒p213的部分图谱：两个启动子，一个是营养生长启动子（位于3050bp的蓝色片段内），一个是孢子形成启动子（位于770bp的红色片段内）营养生长启动子孢子形成启动子质粒p213的部分图谱：两个启动子，一个是营养生长启动子营养1:σ43(σA):vegetablepromoter2:σ29(σE):sporulationpromoterCell,1981,23(4):618σA只能转录营养生长基因，而σE既能转录营养生长基因，也能转录孢子形成基因---揭示了σ因子的特异性1:σ43(σA):vegetablepromoterquestionCanσ29(σE)

reallydirectthetranscriptionofknownsporulationspecificgene?

questionCanσ29(σE)reallydir失控转录实验spoIID基因是孢子形成所必需的基因，而且已被克隆失控转录实验spoIID基因是孢子形成所必需的基因，而且已被失控转录实验原理(run-offtranscription)run-offrun-offtranscript失控转录实验原理(run-offtranscription无G盒转录分析(G-lesscassetteassay)启动子活性越强，转录产物越多，放射自显影条带强度越强（不含GTP)无G盒转录分析(G-lesscassetteassay)promoterspoIIDgene+1SmaISmaIrun-offtranscription:RNApolymerasecontainingdifferentσfactor(σE,σB,σC

)700bppromoterspoIIDgene+1SmaISmaIr700bprun-offtranscriptσEcanreallydirectthetranscriptionofknownsporulationspecificgene差一个什么对照?σA只能转录营养生长基因700bprun-offtranscriptσEc多启动子基因多启动子基因spoVG:twopromotersspoVG:twopromotersP1(σB)-35P2-10P2P2(σE)

-35P1-10P1P1：上游启动子，被σB识别P2:下游启动子，被σE识别P1(σB)-35P2-10P2P2(σE)-35run-offtranscription:RNApolymerasecontainingdifferentσfactor(σBorσE)Detectionofdifferentlengthrun-offtranscriptP2spoVGgeneSmaIP1SmaI10bp120bp110bprun-offtranscription:RNApol192022120bp110bp192022120bp110bp纯化了σfactor(σBorσE)，与核心聚合酶结合进行检测，作失控转录分析纯化了σfactor(σBorσE)，与核心聚合酶结Run-offtranscription:RNApolymerasecontainingdifferentσfactor(σBorσE)Detectionofdifferentlengthrun-offtranscriptσEσBσB+σENotranscript:why?Run-offtranscription:RNApolP1(σB)-35P2-10P2P2(σE)

-35P1-10P1P1(σB)-35P2-10P2P2(σE)-35Regulationofexpressionofgenesinvolvedinnitrogenmetabolism(氮代谢),suchastheglnAgene(大肠杆菌谷氨酰胺合成酶基因的转录调控)TranscriptionofglnAbypurifiedEscherichiacolicomponents:coreRNApolymeraseandtheproductsofglnF,glnG,andglnL.PNAS198582(24)8453-8457研究论文（原始研究工作）的学习Example-2：AlternativeσfactorRegulationofexpressionofgeT7phageterminator300bp415bpTwopromoters:glnAP1,P2Gln(谷氨酰胺):1.必需氨基酸,参与蛋白质合成2.氮源T7phageterminator300bp415bglnAgene(谷氨酰胺合成酶基因)的两种转录方式氮源充足,碳源缺乏:70,glnAP1,weakpromoterglnAgene(谷氨酰胺合成酶基因)的两种转录方式氮源充氮源缺乏:54,glnAP2,strongpromoter氮源缺乏:54,glnAP2,strongproT7phageterminator300bp415bp氮源充足,碳源缺乏:70,glnAP1,weakpromoter,表达弱氮源缺乏:54,glnAP2,strongpromoter,表达强7054从弱启动子到强启动子的转换是由70被54取代所控制的T7phageterminator300bp415bExperimentalevidenceforproving54candirectthetranscriptionfromstrongpromoterRun-offtranscription:RNApolymerasecontainingdifferentσfactor(σ54orσ70)T7phageterminator300bp415bpExperimentalevidenceforprovRun-offtranscriptionresult1:corepolymerase(withoutσfactor)

2:corepolymerase+σ54factor3:corepolymerase+σ54factor+GlnG4:corepolymerase+σ54+σ70

300bp415bp300bp差一个什么对照?当两个σfactor(σ54

，σ70)同时存在时，σ54

起主导支配作用，主要从glnAP2启动子上开始转录。σ54能够与σ70竞争Run-offtranscription1:corep54candirectthetranscriptionfromstrongpromoterofglnA54isdefectiveσfactor

whichrequiresanotherproteinNtrCtohelpinitiatetranscription54candirectthetranscriptiNtrChasATPaseactivityandworksfromDNAsitesfarfromthegene(远端激活)NtrCcontrolsexpressionofgenesinvolvedinnitrogenmetabolism(氮代谢),suchastheglnAgeneNtrChasseparateactivatingandDNA-bindingdomains,andbindsDNAonlywhenthenitrogenlevelsarelow.NtrChasATPaseactivityandwLownitrogenlevels(低水平氮)NtrCphosphorylationandconformationalchangeNtrCbindsDNAsitesat~-150positionasadimerNtrCinteractswith54(glnAstrongpromoterrecognition)

NtrC

ATPaseactivityprovidesenergyneededtoinduceaconformationchangeinpolymerase(闭合开放)transcriptionstartsactivation