备课素材：重组DNA分子的筛选与鉴定-高二下学期生物人教版选择性必修3

重组DNA分子的筛选与鉴定

重组DNA导入受体细胞以后，必须使用各种筛选与鉴定手段区分转化子（接纳载体或重组分子的转化细胞）与非转化子（未接纳载体或重组分子的非转化细胞）、重组子（含有重组DNA分子的转化子）与非重组子（仅含有空载载体分子的转化子），以及期望重组子（含有目的基因的重组子）与非含期望重组子（不含目的基因的重组子）。

重组DNA分子的阳性克隆被称为重组子。重组子的筛选方法有平板筛选法、电泳筛选法、PCR、核酸杂交等。（一）平板筛选法1、双抗生素抗性基因的双筛选例1.(2016·全国卷Ⅰ)某一质粒载体如图所示,外源DNA插入Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因,Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后,与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合,加入DNA连接酶进行连接反应,用得到的混合物直接转化大肠杆菌,结果大肠杆菌有的未被转化,有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种,分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题:(1)质粒载体作为基因工程的工具,应具备的基本条件有(答出两点即可)。而作为基因表达载体,除满足上述基本条件外,还需具有启动子和终止子。(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选,在上述四种大肠杆菌细胞中,未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的,其原因是二者均不含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均不生长;并且含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒(或含有重组质粒)的细胞也是不能区分的,其原因是二者均含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均能生长。在上述筛选的基础上,若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落,还需使用含有四环素的固体培养基。(3)基因工程中,某些噬菌体经改造后可以作为载体,其DNA复制所需的原料来自。实验方法——影印平板培养法2、AmpR表示氨苄青霉素抗性基因和LacZ基因的双重筛选蓝白斑筛选（选择性必修3第98页）

大肠杆菌本身是能够表达β-半乳糖苷酶的（有乳糖存在下）。正常的大肠杆菌在含有X-gal的培养基上都是蓝色，根本不需要蓝白斑技术来筛选。能够用来进行蓝白斑筛选的菌株我们把它叫做β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。也就是这个菌株不能表达出完整的β-半乳糖苷酶，它形成的菌落为白色。

LacZ基因上酶切位点，外源目的基因插入其中，LacZ基因完整性遭到破坏，就不能产生的β-半乳糖苷酶，不能将培养基中X-gal分解产生蓝色物质，菌落为白色。

实验中，通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的。含X-gal的平板培养基中同时含有一种或多种载体所携带抗性相对应的抗生素，这样，一次筛选可以判断出：未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。3.插入表达法

有些质粒携带一个cI基因，它是表达基因（如抗生素基因）的负控制系统，当cI基因产物与操纵子结合，终止所有基因转录。在cl基因的位点中插入外源DNA片段，将导致cl基因失活，表达基因解阻遏而表达。4.噬菌斑筛选法

以λDNA为载体的重组DNA分子经体外包装后转染受菌体，转化子在固体培养基平板上被裂解形成噬菌斑，而非转化子正常生长，很容易辨认。

如果在重组过程中使用的是取代型载体，噬菌斑中的λ噬菌体即为重组子，因为空载的λDNA分子不能被包装，在常规的转染实验中不会进入受体细胞产生噬菌斑。

在插入型载体的情况下，此时筛选重组子必须启用载体上的标记基因，如lacZ等。当外源DNA片段插入到lacZ基因内时，重组噬菌斑无色透明，而非重组噬菌斑则呈蓝色。5.营养缺陷型筛选法

利用营养突变株的标志补救（markerrescue)特性来筛选重组子。如果载体分子上携带有某些营养成分（如氨基酸或核酸）的生物合成基因，而受体细胞中因该基因的突变不能合成这种生长所需要的营养物质，则两者构成营养缺陷型的正选择系统。又如克隆的基因能够在宿主细胞中表达，而且表达的产物能与宿主菌的营养突变互补，就可利用营养突变株进行筛选。将待筛选的细菌培养物涂布在缺少该营养物的合成培养基上，长出的菌落即为转化子，而重组子筛选仍需要第二个选择标记，并通过插入灭活的方法进行第二轮筛选。通常在酵母中表达的基因，常利用这种营养突变互补进行选择。例2.

白细胞介素-2(IL-2)是主要由活化的CD4+细胞产生的免疫调节因子,对机体的免疫应答和抗病毒感染等有重要作用。科学工作者将含IL-2基因的DNA片段和质粒pPIC9K构建成重组质粒,并导入酵母菌GS15(组氨酸缺陷菌株,不能合成组氨酸)中,筛选到了能分泌IL-2的工程菌株。请回答:(1)构建重组质粒需要用到的酶有_______,质粒上的启动子的作用是__________。根据上图分析,为了构建重组质粒应该选用_______(填酶)分别切割含有IL-2基因的DNA片段和质粒。(2)已知用不含组氨酸的培养基进行筛选,培养基中有导入了质粒pPIC9K和导入了重组质粒的两种酵母菌细胞。这两种类型的细胞能否被区分出来，若能,则说明区分的原理;若不能,则说明区分的措施。___________________________________(3)制备能分泌IL-2的工程菌株宜用酵母菌作为受体细胞,而不适合用大肠杆菌。从细胞结构与功能的角度分析,原因是___________________________答案：(1)限制酶和DNA连接酶(2分)

作为

RNA聚合酶识别并结合的位点,驱动基因转录(2分)

EcoRI酶和NotI酶(2分)

(2)不能(1分)

先在不含组氨酸的培养基上筛选，然后再向培养基中加入四环素进一步筛选(2分)

(3)酵母菌是真核细胞,其含有的内质网和高尔基体能对蛋白质进行加工修饰(3分)二、电泳筛选法平板抗生素与颜色的阳性重组体筛选，虽然很重要但并不精确，平板上许多菌落是假阳性的情况，如载体DNA缺失后自我连接引起的转化，非特异性片段插入组建载体的转化，而真正阳性重组体只有很小一部分。所以必须利用电泳法即从转化子中利用碱变性法提取质粒，通过琼脂糖凝胶电泳法确定它们的大小，并且酶切后电泳进一步验证质粒的重组情况(图5-17）。但对于插入片段是大小相似的非目的基因片段，电泳法仍不能鉴别这样的假阳性重组体。三、PCR筛选法利用扩增靶基因的引物，挑选平板筛选菌落直接进行PCR确认阳性克隆例3.(2019·江苏高考·节选)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图,载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题:

(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落,采用含有不同抗生素的平板进行筛选,得到A、B、C三类菌落,其生长情况如表(“+”代表生长,“-”代表不生长)。根据表中结果判断,应选择的菌落是(填表中字母)类,另外两类菌落质粒导入情况分别是、。

菌落类型平板类型ABC无抗生素+++氨苄青霉素++-四环素+--氨苄青霉素+四环素+--(3)BA类菌落含有P0C类菌落未转入质粒(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒,拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置,PCR鉴定时应选择的一对引物是。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段,原因是。

(4)乙丙目的基因反向连接四、测序确认对于原核或真核系统表达型重组子，其插入片段的序列正确性是非常关键的，有必要对其进行序列测定，确定插入基因的ORF以及确认是否具有碱基突变或表达被截断的问题。测序引物利用质粒上的通用引物，以确认靶基因的融合情况。五、报告基因检测法绿色荧光蛋白（green-fluorescentprotein，GFP）基因表达一种腔肠动物所特有的生物荧光素蛋白，能在一定波长的紫外线激发下发出绿色荧光。其优点是：①适用于各种生物的基因转化；②检测方法简便，无需底物、酶、辅助因子等物质；③便于活体内基因表达调控的研究检测。六、核酸探针筛选法核酸分子杂交法是根据核酸序列的同源性，利用探针检测某一特定的DNA或RNA分子的方法，也可以用来筛选重组的质粒，检测重组DNA分子中插入的外源DNA是否是原供体（细胞或菌株）中与探针同源的DNA序列或某一基因片段。标记的探针与带有DNA片段的薄膜进行分子杂交；DNA片段经杂交后即用底物显色，显出带纹（酶切图谱），分析图谱上特异DNA片段存在情况例4.(2019·天津高考·节选)(12分)B基因存在于水稻基因组中,其仅在体细胞(2n)和精子中正常表达,但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响,设计了如下实验。(4)获得转基因植株过程中,以下鉴定筛选方式正确的是(多选)。

A.将随机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交B.以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交C.以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交D.检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光答案：BCD分析：完整的基因才能制备探针使用,A项不可取。由于将B基因与Luc基因连接成融合基因,所以可以通过检验Luc基因的存在与否,检测B基因的存在,B项可行。以B基因为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交,可以鉴定筛选转基因植株,C项可行。由于Luc基因表达的酶可催化荧光素产生荧光,D项可行。例5.科研人员研究调控蔗糖转移酶基因（SUC2）的两种蛋白质Snf1和Snf2之间的相互作用的原理如下：真核细胞起始基因转录需要有转录激活因子的参与。酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的，由DNA结构功能域（BD）和转录激活结构域（AD）组成。两个结构域分开时不能激活转录，只有当两者空间上接近时，才具有GAL4转录因子活性。BD与基因上游激活序列UAS结合后，激活AD与启动子结合，使启动子下游基因转录。如图为研究相互作用的X蛋白和Y蛋白的机制模式图。（1)操作中，需要用

酶将目的基因分别插入到酵母表达载体中，得到两种融合表达载体（如下图）。酶切时通常选用两种不同的酶，这样做的目的是

（2）酵母染色体上能被GAL4激活转录，显示两种蛋白质相互作用的基因称为报告基因。若用AUR1-C（抗生素AbA抗性基因）和HIS3（组氨酸合成基因）作为报告基因，那么作为被转化的酵母细胞在抗生素抗性和营养需求上应满足的条件是

。转化后需要在添加

的培养基上培养筛选。除此之外，还要将酵母的GAL4基因敲除，原因是

。

（3）LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色；否则菌落为白色。科研人员采用LacZ作为报告基因，根据上述原理，验证了蛋白质Snf1和Snf2之间存在相互作用。写出实验思路并预期结果及推论。参考答案.(除注明外，每题1分，共12分）（1)限制酶和DNA连接

产生不同的黏性末端，保证目