微生物检验在儿科临床的应用

1穿过细菌外膜、肽聚糖或细胞膜，到达作用部位，并与作用靶位接合2经受住细菌产生的各种灭活酶的攻击3与参与细菌基本功能的结构相互作用，并充分地抑制该功能抗菌药物抑制细菌生长，必须具备的条件：

第一页，共四十三页。细菌耐药性的概念致病微生物对于抗菌药物作用的耐受性或对抗性概念是抗菌药物、细菌本身及环境共同作用的结果第二页，共四十三页。1：按遗传物质分类固有耐药获得性耐药2：按耐药现象分类交叉耐药多重耐药细菌耐药性的分类：第三页，共四十三页。细菌耐药性的产生机制

分子遗传机制生化机制

第四页，共四十三页。

细菌耐药的遗传性变异是基因结构发生改变。结构改变主要通过基因突变和基因的转移与重组。分子遗传机制：第五页，共四十三页。一、细菌的抗菌药物作用靶位的改变二、细菌产生灭活酶（水解酶或修饰酶）三、药物累计不足生化机制：第六页，共四十三页。细菌产生诱导酶对抗生素的作用靶位进行化学修饰基因突变造成靶位变异使抗菌药物不易或不能与靶位结合一、抗菌药物作用靶位的改变产生耐药细菌的生理功能正常第七页，共四十三页。青霉素结合蛋白的改变核糖体靶位酶亲和力的下降:导致细菌对氨基糖苷类、磺胺类、红霉素类、四环素类、氟喹诺酮类抗菌药物耐药。Ⅱ型拓扑异构酶或DNA解旋酶的改变:导致金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肠杆菌科细菌和假单胞菌等对氟喹诺酮类抗生素耐药。二氢叶酸代谢酶的改变：细菌改变二氢叶酸合成酶构型，可使该酶与磺胺类抗菌药物的亲和力大为降低，导致细菌对磺胺药耐药。肠球菌对万古霉素的耐药机制：主要是其作用靶位，细胞壁五肽末端的D-丙氨酰-D-丙氨酸突变为D-丙氨酰-D乳酸或D-丙氨酸而导致耐药。第八页，共四十三页。PBP：是β－内酰胺类抗生素的作用靶位蛋白具有转肽酶或羧肽酶活性位于细胞膜上，参与细胞壁合成

在正常情况下：β－内酰胺类抗生素与PBP结合，可干扰细菌肽聚糖的正常合成。在异常情况下：当某些细菌获得外源性DNA时，编码产生新的低亲和力的PBP或PBP本身发生修饰改变，对抗菌药物亲和力降低，从而导致该细菌对β－内酰胺类抗生素产生耐药。

如：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌:（MRSA）

产生一种新的低分子量的PBP2a，当有β－内酰胺类抗生素存在时，细菌表面5种正常的PBP被抑制，不能发挥正常生理功能，而PBP2a不被抑制，可作为转肽酶完成细胞壁的合成，使MRSA对所有β－内酰胺类抗生素产生耐药。

例如：青霉素结合蛋白（PBP)的改变第九页，共四十三页。

β－内酰胺酶

氨基糖苷类钝化酶

氯霉素乙酰转移酶

红霉素酯化酶二、细菌产生的灭活酶（水解酶或修饰酶）第十页，共四十三页。β－内酰胺酶:

细菌产生的以β－内酰胺类抗菌药物为水解产物的多种不同类型的降解酶，可使β－内酰胺键断裂造成β－内酰胺类药物失去活性。目前已知的β－内酰胺酶有200多种。β－内酰胺酶类抗菌药物:包括青霉素与头孢菌素类等,为临床最常用的抗菌药物之一。这类药物的化学结构中均有β－内酰胺环,可抑制细菌细胞壁的合成,此环与他们的抗菌作用密切相关,当环被打开,则抗菌活性消失。第十一页，共四十三页。β－内酰胺酶的分类功能分类(Bush)结构分类(Ambler)作用底物酶抑制剂EDTA名称（代表酶）1C头孢菌素--头孢菌素酶(G－杆菌的AmpC酶)2aA青霉素+-青霉素酶(G＋球菌的青霉素酶)2bA青霉素；一、二代头孢菌素+-广谱酶(TEM-1,TEM-2,SHV-1)2beA青霉素；一、二、三代头孢菌素；单环类+-超广谱酶(TEM-3至TEM-26;SHV-3至SHV-5)2brA青霉素+/--耐酶抑制剂酶(TEM-30至TEM-36)2cA青霉素；羧苄西林+-羧苄西林酶(PSE-1,PSE-3,PSE-4)2dD青霉素；苯唑西林+/--苯唑西林酶(OXA-1至OXA-27,PSE-4)2eA头孢菌素+-普通变形杆菌的可诱导的头孢菌素酶2fA青霉素；头孢菌素；碳青霉烯类+-非金属碳青霉烯酶(阴沟杆菌的NMC-A,粘质沙雷菌的Sme-1)3A绝大多数β－内酰胺类，包括碳青霉烯类-+金属酶(铜绿假单胞菌的IMP-1,VIM-1)4B青霉素--洋葱伯克霍尔德菌的青霉素酶第十二页，共四十三页。超广谱β－内酰胺酶（ESBLs）主要由大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的广谱酶TEM-1、TEM-2和SHV-1突变形成。使细菌的耐药谱从青霉素和一、二代头孢菌素扩大到青霉素和一、二、三代头孢菌素及单环类，但对头霉素、碳青酶烯类及酶抑制剂敏感。AmpC酶为染色体介导的头孢菌素酶，几乎所有肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌都产生此酶。当此酶大量表达时，可导致细菌对除第四代头孢菌素、碳青酶烯类之外的所有β－内酰胺类抗生素耐药。且对β－内酰胺酶抑制剂及EDTA均不敏感。金属β－内酰胺酶是一群能水解碳青酶烯类抗生素的酶，能被金属螯合剂螯合，不被酶抑制剂抑制。到目前为止至少发现了28种。第十三页，共四十三页。药物吸收减少由于细胞壁的有效屏障或细胞膜通透性的改变，阻止药物吸收，使抗生素无法进入体内发挥作用主动外排泵作用在某些细菌外膜上存在特殊的能量依赖性的药物泵系统，能将进入菌体内的药物不断泵出，使菌体内的药物浓度不足以发挥抗菌作用而导致耐药三、药物累计不足第十四页，共四十三页。细菌名称抗菌药物主要耐药机制葡萄球菌青霉素产生β－内酰胺酶耐酶青霉素青霉素结合蛋白改变氟喹诺酮类DNA解旋酶、药物外排泵红霉素核糖体保护蛋白的产生肺炎链球菌β－内酰胺类青霉素结合蛋白改变红霉素核糖体保护蛋白的产生肠球菌β－内酰胺类青霉素结合蛋白改变氨基糖苷类钝化酶糖肽类结合蛋白改变流感嗜血杆菌淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌青霉素产生β－内酰胺酶氯霉素乙酰转移酶肠杆菌科细菌β－内酰胺类产生β－内酰胺酶氨基糖苷类钝化酶氟喹诺酮类DNA解旋酶、药物外排泵铜绿假单胞菌β－内酰胺类β－内酰胺酶、外膜通透性改变氨基糖苷类钝化酶氟喹诺酮类DNA解旋酶、药物外排泵、外膜通透性改变磺胺类双氢叶酸合成酶改变临床常见细菌对常见抗菌药物的主要耐药机制第十五页，共四十三页。供临床选择治疗药物疗效差，考虑更换抗菌药了解病原菌耐药性的变迁评价新药抗菌谱及抗菌活性抗菌谱有助于某些菌种鉴定药敏试验的目的第十六页，共四十三页。细菌耐药性监测

以临床细菌标本的药敏试验为基础，分析所在医院或地区常见病原菌耐药性的变迁。第十七页，共四十三页。

2008年我院细菌耐药性监测药名头孢唑啉头孢他啶头孢噻肟青霉素头孢曲松名次11234药名G－肠杆菌（24株）耐药率％名次头孢呋辛95.8（23）1头孢曲松95.8（23）1头孢他啶62.5（15）2氨苄西林/舒巴坦62.5（15）2哌拉西林/他唑巴坦25.0（6）3环丙沙星25.0（6）3头孢吡肟16.7（4）4丁胺卡那12.5（3）5头孢哌/舒巴坦4.2（1）6亚安培南4.2（1）6药名G＋球菌（13株）耐药率％名次青霉素G76.9（10）1红霉素76.9（10）1苯唑西林61.5（8）2环丙沙星46.2（6）3庆大霉素38.5（5）4洛美沙星38.5（5）4万古霉素15.4（2）52008年7-9月G-杆菌耐药率2008年抗生素使用排名2008年1-6月G+球菌耐药率药名G－肠杆（22株）耐药率％名次头孢唑啉90.1（20）1哌拉西林86.4（19）2阿莫西林/棒酸77.3（17）3氨苄西林63.6（14）4庆大霉素54.5（12）5亚胺培南45.4（10）6环丙沙星36.4（8）72008年1-6月G-杆菌耐药率第十八页，共四十三页。2008年10-12月细菌耐药性监测药名G－肠杆菌（19株）耐药率％名次头孢呋辛78.9（15）1头孢曲松73.7（14）1头孢他啶57.9（11）2氨苄西林/舒巴坦36.8（7）2头孢吡肟21.1（4）3哌拉西林/他唑巴坦15.8（3）3环丙沙星15.8（3）4头孢哌酮/舒巴坦10.5（2）5丁胺卡那5.3（1）6亚安培南5.3（1）6培养出的细菌数量（株）来源科室肺炎克雷伯菌9新生儿科8株；产一科1株大肠埃希菌6新生儿科6株铜绿假单胞菌1新生儿科1株阴沟杆菌2新生儿科2株克吕沃尔菌1新生儿科1株金黄色葡萄球菌2产一科2株表皮葡萄球菌2新生儿1株；产一科1株注：

超广谱β－内酰胺酶（ESBLs）检测19株G－肠杆菌，14株阳性，阳性率为73.7％。培养出的细菌种类第十九页，共四十三页。特殊细菌的耐药菌株检测试验耐甲氧西林葡萄球菌检测1超广谱β－内酰胺酶检测2AmpC酶的检测3耐万古霉素肠球菌检测4第二十页，共四十三页。1.耐甲氧西林葡萄球菌检测(MRSA)由染色体mecA基因介导产生对苯唑青霉素等β－内酰胺类抗生素亲和力很低的青霉素结合蛋白（PBP2a）。包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌（MRCNS）。苯唑西林纸片法：MRSA≤13mm，MRCNS≤18mmMRSA阳性结果应注意：该菌对所有青霉素类、头孢菌素类、碳青酶烯类、氨基糖苷类、大环内酯类和含酶抑制剂的复合剂为耐药，不论检验报告的结果是否敏感。第二十一页，共四十三页。2.超广谱β－内酰胺酶检测（ESBLs）ESBLs可与β－内酰胺环的羧基共价结合，使其酰胺键水解。主要由大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的广谱酶TEM-1、TEM-2和SHV-1突变形成。使细菌的耐药谱从青霉素和一、二代头孢菌素扩大到青霉素和一、二、三代头孢菌素及单环类，但对头霉素、碳青酶烯类及酶抑制剂敏感。采用双纸片扩散法，即头孢他啶与头孢他啶/棒酸，头孢噻肟与头孢噻肟/棒酸组合，任何一组药物的抑菌直径之差≥5mm时判断ESBLs阳性。

第二十二页，共四十三页。3.AmpC酶的检测AmpC酶为染色体介导的头孢菌素酶，优先作用底物是头孢菌素。几乎所有肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌都产生此酶。当此酶大量表达时，可导致细菌对除第四代头孢菌素、碳青酶烯类之外的所有β－内酰胺类抗生素耐药。且对β－内酰胺酶抑制剂及EDTA均不敏感。5种纸片初筛试验：头孢他啶、头孢他啶/棒酸、头孢西丁、亚胺培南和头孢吡肟，前三种耐药，后两种敏感。第二十三页，共四十三页。4.耐万古霉素肠球菌检测（VRE）：耐万古霉素肠球菌（VRE）可分为VanA、VanB、VanC三种类型。由于MRSA增加，万古霉素使用大幅上升，导致临床VRE感染病人增加；VRE治疗比较困难，没有特定规律；可供选择的有四环素、氯霉素、喹诺酮类，泌尿系可考虑呋喃妥因或磺胺类。第二十四页，共四十三页。微生物检验在儿科临床的应用

沟通理解合作第二十五页，共四十三页。血培养标本的采集和运送1.血培养的数量研究结果一套血培养的阳性率为65％二套血培养的阳性率为80％三套血培养的阳性率为96％CLSI建议方针对于每位需要血培养的患者需采取2至3套。对于成年患者的血培养，只采单一的血培养是不允许的。因为单一血培养的结果的临床意义很难解释。采血培养后的2至5天内，不需要重复采血培养，因为治疗后的2至5天内血液中的感染细菌不会马上消失。第二十六页，共四十三页。2.血培养的采血量和时间对于成年患者，每套血培养瓶推荐的采血量为１0至２0ml对于婴幼儿患者，采血量不超过患者总血量的1％（≤1kg采血2ml;1.1-2kg采血2ml；采血4ml;，采血10ml）采血尽量在寒战或发热后及未使用抗生素之前完成。在评估可疑新生儿败血症时，除发热或低烧外，很少培养出细菌的，应该补充尿液和脑脊液培养。第二十七页，共四十三页。3.标本的运送血培养瓶在采血接种后必须马上送检血培养瓶在采血接种后在室温中不得超过数小时血培养瓶不得在采血接种后放入冰箱或冷冻第二十八页，共四十三页。4.培养时间与阳性率

BACTEC9240需氧瓶中5天的培养结果•孵育5天后共检出1133株有临床意义的菌株–907株(80.0%)在24小时内检出–162株(14.3%)在24-48小时检出–18株在96小时以后检出•在第5天检出的细菌S.aureus4E.faecalis1Klebsiellaspp.5Serratiaspp.1Brucellaspp.2Candidaspp.3C.neoformans1第二十九页，共四十三页。痰标本的采集和运送小儿取痰方法用压舌板向后压舌，用棉拭子伸入咽部，小儿经压舌刺激咳嗽时，可喷出肺部或气管分泌物粘在拭子上，取后立即送检。第三十页，共四十三页。痰标本的检验与临床痰中可分离到的三大类呼吸道感染的病原菌结核杆菌、白喉棒状杆菌、百日咳杆菌——公认的病原菌肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡它布拉汉菌——逐渐被认识的CAP病原菌肠杆菌科细菌、非发酵菌、葡萄球菌等——条件致病菌第三十一页，共四十三页。痰中检出结核杆菌,白喉棒状杆菌,百日咳杆菌属于确诊报告痰中培养出肺炎链球菌,流感嗜血杆菌,卡他布拉汉氏菌基本上可以确诊为社区获得性肺炎的病原菌.除此以外的其他革兰阴性杆菌,革兰阳性球菌,真菌属参考报告.参考的价值约30%.第三十二页，共四十三页。

目前，痰中分离出的细菌种类大致排位是：绿脓杆菌，不动杆菌，肺炎克雷伯菌，阴沟肠杆菌，变形杆菌，大肠杆菌，某些少见的肠杆菌科细菌及非发酵菌，葡萄球菌，念珠菌，粪肠球菌,肺炎链球菌,流感嗜血杆菌….

几乎全部是条件致病菌第三十三页，共四十三页。条件致病菌的几种身份病原菌：患者由这类菌引起感染，用细菌报告提示的抗生素治疗，疗效明显定植菌：①用细菌报告提示的抗生素治疗，该菌消失，感染症状依然存在②或是由于该菌泛耐药，临床凭经验联合用药，感染症状好转，但该菌依然存在上述两种现象说明，细菌报告中的病原菌与感染毫无关系污染菌：留取标本过程中，污染了非感染部位的细菌第三十四页，共四十三页。某种情况：患者的感染已基本治愈，做痰检的目的是希望得到一张阴性报告做为停止治疗,出院的凭证。培养：生长大量阴性杆菌，较常见的是绿脓杆菌和不动杆菌

患者已接受了较长时间的抗生素治疗，在清除了病原菌的同时，上呼吸道的正常菌同时被杀伤，定植抗力削弱，医院中常见的绿脓杆菌，不动杆菌由于耐药性极强，有机会在上呼吸道大量生长。这类细菌致病力较弱，与宿主形成和平共处的状态，这是典型的定植现象。清除这些不应在呼吸道大量生长的定植菌最佳的手段是停用抗生素，让呼吸道正常菌群重新生长，拮抗定植菌。第三十五页，共四十三页。粪便标本的采集和运送自然排便法：自然排便后，挑取有脓血、黏液部位的粪便2－3克，液状粪便取絮状物盛于无菌的容器内送检。直肠拭子方法：如不易获得粪便时或排便困难的患者及幼儿，可采取直肠拭子方法采集，取出后插入灭菌试管内送检。

以肥皂，水和70﹪的酒精，将肛门周围洗净，然后用一根浸过无菌生理盐水的棉拭子，插入肛门约５mm处，轻轻旋转，使之与直肠黏膜表面接触，然后取出置于无菌试管中立刻送至微生物室．第三十六页，共四十三页。粪便标本的检验和临床粪便检验主要是患者出现腹泻症状，而引起腹泻的原因主要有：1.细菌感染2.食物中毒3.菌群失调患者吃了不清洁的食物，出现腹泻、呕吐、发热等症状前来就医医生根据患者主述，大便常规检验,诊断为菌痢或肠炎治疗：静脉补液加抗生素这种有效的治疗方法至今还在延用第三十七页，共四十三页。但下述情况，此方法无效：住院长期使用抗生素的患者，出现腹泻症状（每日次数增多，大便呈糊状），腹部不适，食欲欠佳。其本质原因是治疗其他感染性疾病所使用的抗生素在发挥治疗作用的同时伤及肠道正常菌群，数量上占优的原籍菌被杀灭或抑制，而某些耐药的少数菌乘机大量繁殖，引起肠道生态失调。第三十八页，共四十三页。肠道生理菌群的主要种类及分布紧贴肠黏膜：以双岐杆菌、乳酸杆菌为主中间层：类杆菌、真杆菌、消化球菌和消化