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文档简介

1、一主要步骤包被ELISA 基本步骤和主要试剂、材料注意：本步骤为间接 ELISA 步骤取所要包被的物质，提前设计好所需浓度，根据包被孔数计算所需包被物的量， 用包被液稀释至所需体积，分加至各孔中。:ELISA 4过夜;372 4过夜。洗涤包被结束后弃掉包被液,用 PBST 进行洗涤，方法为PBST 加满每孔，静置 510 min，弃掉洗液，重新加满，重复洗涤 35 次，最后拍干 ELISA 板等待下一步封闭. 3 封 闭常用 10%小牛血清，取第 2 步的 ELISA 板加封闭液至每孔，体积至少为所加包437ELISA 可能不同。4 洗 涤封闭结束的 ELISA 板进行洗涤，方法同步骤 2.最

2、后拍干等待加入一抗。5 加入一抗一抗即为你要检测的物质，一般加之前需要稀释,具体稀释倍数不同实验 不同需要自己摸索.一抗样品一般用包被液稀释，稀释到所需浓度后加入到相应孔中.反应条件为 37孵育 2h。洗涤具体同步骤 4。HRP-标记的商品化二抗HRP-标记的二抗(如一抗为鼠源物质则对应加抗鼠二抗），一般也用封闭液稀释,反应 5h。洗涤具体同步骤 4.显色OPD作为显色底物,OPDTMB8进行到一半使配置显色液,10ml底物0015g OPD（OPD有毒不方便称量故只需稍微加入一点即可OPD8150ul 3%过氧化氢溶液加入之前配10mlELISAELISA板置于3710min。终止将 ELI

3、SA 板取出，每孔加终止液（2mol/L 硫酸溶液）上读数（OPD490nm，TMB450nm）。二 材料、试剂ELISA板EILSAELISA81296孔式,需要购买.常用聚苯乙烯和聚氯乙烯材料。注意：聚苯乙烯材料目前只有进口，特点是孔大,加满约 300ul,此时实验中所加各试剂（液等）均为 100ul 体积。而聚氯乙烯多为国产，孔较小，加满约 200ul，此时各试剂 50ul体积即可。各试剂配制包被液（PH6。3 的碳酸盐缓冲液无水Na2CO30.1696gNaHCO30。SW100ml完全溶解至 4，一周内使用PBST配方NaCl8。0gNa2HPO4。12H2O2。KCl0.2gKH2

4、PO40.24gTW200.5mlSW1000ml底物缓冲液Na2HPO43.682g柠檬酸1.02gDW200ml不需灭菌，4保存4）3% H2O230%H2O2SW900ml5）显色剂底物缓冲剂10ml 3H2O2OPD15mgH2O2最后加6)终止液浓硫酸：SW = 1：8SW 中，并搅拌散热三注意事项包被所谓 37反应，一般取一个 37的水浴锅,在水面放一较大泡沫板，将 ELISA 37反应操作同此；ELISA过程中所有需要较长时间等待的步骤（二抗孵育）ELISA 包起来再放入冰箱或水浴锅中,EP 手套套起来即可.洗涤最常规的洗涤步骤是洗涤 3 次,每次间隔 5min，具体实验可能会微调,36 5-10min 不等;ELISA 3显 色3ELISA板中，即在加过氧化氢前要完全完成

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