生物技术制药-第五章 植物细胞工程课件

1、第五章 植物细胞工程制药第一节 概述植物细胞工程的定义：以植物细胞为基本单位，应用细胞生物学、分子生物学等理论和技术，在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种、制造新品种、加速繁育植物个体或获得有用物质的一门科学或技术称为植物细胞工程。植物细胞工程包括：上游工程：细胞培养、细胞遗传操作和细胞保藏下游工程将已转化的细胞应用到生产实践中用以生产生物产品的过程动物细胞工程和植物细胞工程的区别植物细胞工程常用技术手段：植物组织培养，植物体细胞杂交。理论基础：植物细胞的全能性。 植物组织培养植物组织培养技术的应用范围：快速繁殖、培育无病毒植物，

2、通过大规模的植物细胞培养来生产药物、食品添加剂、香料、色素和杀虫剂等。植物体细胞杂交 植物体细胞杂交是用两个来自于不同植物的体细胞融合成一个杂种细胞，并且把杂种细胞培育成新的植物体的方法。动物细胞工程常用的技术手段：动物细胞培养、动物细胞融合、单克隆抗体、胚胎移植、核移植等（动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础） 动物细胞培养动物细胞能够分泌蛋白质，如抗体等。但是单个细胞分泌的蛋白质的量是很少的，要借助于大规模的动物细胞培养获得大量的分泌蛋白。动物细胞培养技术的应用生产许多有重要价值的蛋白质生物制品，如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。 动物细胞融合动物细胞融合技术最重要的用途，是制备单

3、克隆抗体。 1、植物细胞工程发展简史1902年，德国Haberlandt提出了细胞全能性学说，并进行了植物叶肉细胞、髓细胞、腺细胞、气孔保卫细胞、表皮细胞的培养试验,奠定了细胞工程的基础。至30年代，建立了基本的植物组织培养技术80年代后，高速发展时期分子生物学技术改变植物遗传特性植物细胞培养技术进行有药用价值的天然产物的工业化生产和直接生产次生代谢产物成为主流目前，我国处于此方面的领先2、植物细胞工程制药目的植物细胞的药用成分市售中成药的25%来源于植物提取药物或半合成药物一类为植物后含物，为细胞储液或废弃物，包括生物碱、挥发油和有机酸。一类为生理活性物质，如酶、维生素、植物激素、植物杀菌素

4、等利用组织和细胞培养技术生产药用成分植物组织及细胞培养过程中，所产生的次生代谢物常存在于细胞内，可以收获细胞进行提取，因所含色素等杂质较少，所以提取过程相对于从原植物中提取要简单一些。植物培养细胞中有效成分含量高于原植物中的含量培养周期短，有利于节约成本大规模生产与哺乳动物细胞培养系统相比，植物表达系统具有耗费极低而生产蛋白复合物量大的潜力，而且植物表达系统不存在来自动物、细菌或者病毒病原体的污染问题。第二节基本概念1. 植物细胞的全能性2. 植物组织和器官培养3. 植物的分化4. 脱分化5. 再分化6. 植物无菌培养7. 细胞培养8. 分生组织培养9. 外植体10. 无性繁殖系11. 突变体

5、12. 继代培养13. 次级代谢作用和次级代谢产物植物细胞有全能性，而动物细胞也具备全能性吗?高度分化的植物细胞仍然有发育成完整植株的能力，也就是保持着细胞全能性。而高度特化的动物细胞，从整个细胞来说，它的细胞全能性受到限制。但是，它的细胞核仍然保持着全能性，这是因为细胞核内含有保持物种遗传性所需要的全套遗传物质。 无论是高度分化的植物细胞还是高度分化的动物细胞，都有全能性。只不过植物细胞的全能性更容易表达出来，而动物细胞的全能性的表达能力就还远赶不上植物细胞。因此，任何一个植物细胞可以很容易的在培养环境下发育成原来的植物。而动物细胞却没有这种能力。注意植物细胞全能性的相对性不是所有基因型的所

6、有细胞在任何条件下都具有良好的培养反应；动、植物细胞全能性的表现程度存在明显差异。细胞全能性并不意味着任何细胞均可以直接产生植物个体。植物细胞分化基因的差异性表达，即为细胞分化；具体表现为内部生理变化和外部形态变化。细胞分化使细胞功能趋于专门化，更有利于提高生理功能的效率。因此,分化是进化的表现,越高级的植物类群,分化水平越高,细胞分工越细,机体代谢水平也越高。植物的分化高等植物的分化可以分为胚胎发生和器官发生两个阶段。前者是从精子与卵细胞结合开始，分化为幼胚，进而发育为成熟胚和种子。种子在适宜的条件下萌发，通过器官分化过程，形成根、茎、叶、花和果实。细胞脱分化（dedifferentiati

7、on)指特定条件下，分化细胞被诱导，基因活动模式发生变化，改变原有的发育途径，失去原有的分化状态，转变为具分生能力的胚性细胞。细胞脱分化阶段启动阶段，表现为细胞质增生，并开始向细胞中央伸出细胞质丝，液泡蛋白体出现；演变阶段，此时细胞核开始向中央移动，质体演变成原质体；脱分化终结期，细胞回复到分生细胞状态，细胞分裂即将开始。已分化的细胞要表现全能性，首先要脱分化形成分生细胞，然后再分化形成胚胎发育成植株脱分化条件：创伤和外源激素。简言之，脱分化是指已经分化的细胞、组织和器官在人工培养的条件下又变成未分化的细胞和组织的过程。分化与脱分化区别见p177表5-1再分化通过脱分化诱导形成的愈伤组织在适宜

8、的培养条件下可再分化成为胚状体或直接分化出器官。愈伤组织形成胚状体一般有两个途径：由体细胞或性细胞，通过脱分化形成胚状体通过愈伤组织直接形成胚状体。但不论何种途径，均可进一步发育成同母体相同的植株，即所谓的植物细胞全能性。愈伤组织再分化为胚状体是由不正常分化又回到正常分化，表明植物细胞、组织、器官具有很大的可塑性，这种特性为利用植物细胞工程来改良植物提供了可能性。植物无菌培养植物培养，即幼苗和较大植株的培养技术愈伤组织培养，即植物体的各种组织、器官等外植体，经过脱分化而形成的细胞聚集体的培养悬浮培养，即能够保持良好分散性的单细胞和较小细胞团的液体培养器官培养，即植物离体器官如茎尖、根尖、叶片、

9、花器官各部分原基或未成熟的花器官各部分以及未成熟果实的培养。胚胎培养，即未成熟或成熟的胚胎的离体培养。 分生组织培养分生组织培养又称生长锥培养，是指在人工培养基上培养茎端分生组织细胞。外植体外植体是指用于植物组织（细胞）培养的器官或组织（的切段）。植物的各部位如根、茎、叶、花、果、穗、胚珠、胚乳、花药和花粉等均可作为外植体进行组织培养。无性繁殖系无性繁殖系又叫克隆，在植物细胞工程中是指使用母体培养物反复进行继代培养时，通过同一外植体而获得越来越多的无性繁殖后代而言，如根无性系、组织无性系、悬浮培养物无性系等。继代培养由最初的外植体上切下的新增殖的组织，培养一代时间而称之为第一代培养。连续多代的

10、培养即为继代培养。次级代谢产物以前，人们把除了核酸、核苷、核苷酸、氨基酸、蛋白质及糖类（这些成分通常称为初级代其生谢产物）以外，具有如下特征的成分称为次级代谢产物：有明显的分类学区域界限。是生命活动的多余成分。缺乏明确的生理功能。生物合成需在一定的条件下才能发生。次级代谢作用是由特异蛋白质调控产生的内源化合物的合成、代谢及分解作用的综合过程。该作用的结果导致了次级代谢产物的产生。次级代谢产物作用：保持植物的抗逆性，抗病性和抗虫性，及担当信号分子。 次级代谢产物种类很多，主要有生物碱、黄酮体、萜类、有机酸、木质素等。随着科学技术的不断发展，很多过去认为“无用”的次生代谢成分（如萜类、多元酚类、皂

11、苷类等）也显示出其明显（甚至独特的）的生理活性。第三节 植物细胞的形态及生理特性一 植物细胞的形态二 植物细胞的结构特征三 植物细胞的主要生理活性物质及其他化学组分四 植物培养细胞的生理特性植物细胞的形态植物细胞的结构特征植物细胞的亚显微结构 （质膜）洋葱表皮细胞显微结构细胞壁细胞核液泡细胞质模式植物细胞构造 细胞壁胞间层初生壁次生壁后含物 原生质体贮藏物质晶 体细胞膜细胞质细胞器细胞核模式植物细胞 模式植物细胞是由细胞壁、原生质体、后含物三大部分组成质体线粒体液泡内质网核糖体高尔基体动植物细胞区别细胞壁、质体、液泡三部分是植物细胞特有的结构，动物细胞没有。植物细胞是完整的 一个健全的植物细胞

12、通过分化与增殖可发于成一株完整的植物 但动物细胞不可以 。植物细胞的主要生理活性物质及其他化学组分 生理活性物质生理活性物质是一类对细胞内的生化反应和生理活动起调节作用的物质的总称。包括：酶、维生素、植物激素抗生素等。其他成分：生物碱：是一类含氮的有机化合物，广布于植物界。多种生物碱具有显著生理活性，广泛应用于临床。 糖苷类：是指某些有机化合物和糖经苷键结合而成的化合物，例如黄酮苷是黄酮苷元和糖连接而成。很多糖苷化合物对疾病有很好的治疗作用。如紫草宁是紫草中蒽醌类化合物的总称，具有很好的抗癌活性。挥发油：是一类具有芳香气味，在常温下易于挥发的油类。有机酸：是糖类代谢的中间产物。常见的植物有机酸

13、有苹果酸、柠檬酸等。植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目植物组织培养动物细胞培养原理培养基性质培养基特有成分培养结果培养目的细胞的全能性细胞增殖固体培养基液体培养基蔗糖 植物激素葡萄糖 动物血清植物体细胞株、细胞系快速繁殖、培育无病毒植株、制造人工种子获得细胞或细胞分泌蛋白植物培养细胞的生理特性植物培养细胞生长阶段及特征：延迟期：细胞数量不变，核酸及蛋白合成较快加速期：细胞快速生长期。干重恒定，细胞数、DNA和蛋白质浓度增加，有丝分裂活性、RNA含量和蛋白质合成能力减少对数期：介于最大生长率和蛋白质合成完全停止期之间。增加细胞鲜重、干重及RNA酶活性，蛋白质合成能力完全减退稳定期：细胞数稳

14、定。细胞高液泡化，极度脆弱，高度分化及有机化合物的高浓度植物细胞有独特的培养时间及特征：重量的增加在对数期，次生代谢产物在稳定期积累植物细胞很少单一细胞生长，对数生长后期分泌量蛋白和粘多糖，以非均相集合的细胞团悬浮生长。植物细胞培养应注意问题：1、易形成细胞团：影响传氧传质；产生原因：一是细胞分裂之后没有进行细胞分离；二是在间歇培养过程中细胞处于对数生长后期时，开始分泌粘多糖和蛋白质，或以其他方式形成粘性表面，从而形成细胞团。2、植物细胞好气，培养过程中需供气及搅拌，但纤维素细胞壁使得其外骨架相当脆弱，表现为抗张力强度大，抗剪切能力小，传统的搅拌式反应器极易损伤细胞壁3、植物细胞培养基黏度比较

15、高，同时部分细胞在培养过程中易产生黏多糖，也导致培养液黏度增加。而细胞密度高、黏度大时很容易产生混合和循环不良问题。4、所有植物细胞都是好气的，但培养时不需要很高的气液传质速率，而是要控制氧量，以保持较低的溶氧水平。5、培养过程中的泡沫性质不同于发酵，气泡大，黏度也大（含有蛋白质或黏多糖所致），细胞易被包埋在气泡中，并从循环的营养液中带出来，造成非均相培养，通常要采用化学或机械方法加以控制。6、培养过程中细胞可能会黏附于反应器壁上，电极或挡板上。该方面的特性尚不清楚第四节 植物细胞培养的基本技术植物细胞培养从植物组织培养而来，植物组织培养主要用于形成组织和再生成植株细胞培养主要生成次生代谢产物

16、基本技术：植物材料的准备培养基制备培养方法的选择一 植物材料的准备最重要的是无菌。 植物组织培养的外植体必须是无杂菌材料。培养前要进行严格的灭菌处理。植物组织培养时表面处理的常用灭菌剂（表5-5）原则：灭菌后易除去或易分解；敏感的外植体灭菌时间不宜长，不敏感的则应适当延长。不同器官的灭菌方式不同（表5-6）二、植物细胞培养基植物细胞生长代谢特点：（1）需大量无机盐（2）需多种维生素和植物生长激素（3）无机氮源，硝酸盐，铵盐为主。（4）以蔗糖为碳源培养基是“无菌土壤”，营养成分可以根据代谢特点进行调控。常用培养基MS、N6、B6、LS、RM-1964、H、T、B5、DBMII、米勒、改良怀特、尼

17、许等。MS培养基是目前应用最多最普遍的培养基。无机盐的浓度较高，能保证组织培养生长所需的矿物营养。并且因为离子浓度高，在配制、贮存、消毒过程中，即使有些成分略有出入，也不致影响培养基中的离子平衡。B5含有较低的盐离子，这个成分可能对很多培养物的生长有抑制作用。White的无机盐含量较低，适于生根培养。植物组织和细胞培养所用培养基种类较多，但通常都含有无机盐碳源有机氮源植物生长激素维生素等化学成分。1. 无机盐 大量元素和微量元素之分。大量元素是指使用浓度大于30mg/L的无机元素。包括：N、S、P、K、Mg、Ca、Cl、Na微量元素是指浓度低于30mg/L的无机元素，包括：Fe、B、Mn、I、

18、Mo、Cu、Zn作为辅因子或对酶合成而言，都是必需的，2. 碳源细胞培养过程中不进行光合作用，人们经常使用糖类、肌醇作为碳源。此外，某些天然提取物对愈伤组织的诱导和培养也有重要意义，如椰子乳（椰子的液体胚乳），常用浓度为10 ；也可使用0.5的酵母提取物或510的番茄汁等。3. 植物生长调节剂是用于调节植物生长发育的一类农药，包括人工合成的化合物和从生物中提取的天然植物激素。已发现具有调控植物生长和发育功能物质有生长素、赤霉素、乙烯、细胞分裂素、脱落酸、油菜素内酯、水杨酸、茉莉酸和多胺等，而作为植物生长调节剂被应用在农业生产中主要是前6大类。借生长激素调控生长分化，以及细胞培养时，获得最大量的

19、次生代谢产物生长素用来诱导细胞的分裂、愈伤组织形成和根的分化。组织培养中常用的生长素有吲哚乙酸 (IAA)：第一个被发现和人工合成的激素二氯本氧乙酸 (2,4-D)；萘乙酸 (NAA)；吲哚-3-丁酸 (IBA)；萘氧乙酸 (NOA)；对氯苯氧乙酸 (P-CPA)NAA、IAA、IBA易引起生根，2,4-D有利于愈伤组织的诱导和生长细胞分裂素主要促进细胞分裂和由愈伤组织上或器官上分化不定芽。常用的有：6-苄基嘌呤 (BAP)6-苄基腺嘌呤 (6-BA)激动素（呋喃氨基嘌呤、Kinetin、KT）玉米素 (zeatin、zt)异戊烯氨基嘌呤 (2-ip)细胞分裂素既可促进也可抑制体细胞胚的发生,

20、这主要取决于植物的种类及其基因型。一般而言,细胞分裂素对于促进体细胞胚的成熟有显著作用,特别有利于子叶的发育。另外有研究表明,不同的外植体对于细胞分裂素的需要可能具有不同的专一性,如在胡萝卜的研究中发现,虽然激动素对胚胎发生过程表现抑制作用,但浓度为0.1M的玉米素却能促进这个过程,而6-BA对胡萝卜则是促进其愈伤组织的增殖,但不形成胚性愈伤组织。植物培养物的生长取决于生长素和分裂素的比例：高浓度生长素和低浓度分裂素刺激细胞分裂 低浓度生长素和高浓度分裂素刺激细胞生长但是，过量赤霉素和酚类化合物能掩盖该现象！对植物培养细胞而言，绝大多数植物组织和细胞培养基中都需加入一定量的生长调节剂。少数培养

21、物经历多次继代培养后也能成为激素自养型，而这样的驯化细胞具有表型不稳定特征（不是体细胞突变！）。4. 有机氮源 有机氮源为蛋白质水解产物（如谷氨酰胺）或各种氨基酸。对细胞的早期生长有利。但苏氨酸、甘氨酸和缬氨酸可通过灭活位于叶绿体和细胞质上的谷氨酸合成酶而降低氮的利用；而精氨酸通常具有补偿此灭活作用的能力。5. 维生素植物细胞通常是维生素自养型的，但大多数情况下，其自身合成的量均不能满足植物细胞的需要，即或是光合成活性细胞或组织也是如此。故对大多数培养基而言，除了必须加入的B 族维生素（如B1，B6和泛酸）外，通常还需加入一定量的生物素和肌醇。6、诱导子刺激植物细胞合成防御性次生代谢产物的物质

22、, 可以通过改变次生代谢途径中催化酶的酶活力,引起代谢通量和反应速率的改变, 提高次生代谢产物的产量。非生物诱导子：水杨酸，茉莉酸等,稀土及重金 属盐类生物诱导子：微生物类，如真菌孢子，菌丝体 真菌培养物滤液等三、植物细胞的获得和培养方法（一）植物细胞的获得1.外植体直接分离法:机械切割、组织破碎直接从植物外植体中分离2.愈伤组织分离法：从愈伤组织制备小细胞团或单细胞悬液3.原生质体再生法：纤维素和果胶酶混合处理外植体或愈伤组织，分离原生质体，再生培养基中培养，原生质体细胞壁再生获得植物细胞单细胞分离途径一：由完整的植物器官分离单细胞叶片是分离单细胞的最好材料。机械法、酶解法途径二：由培养组织

23、中分离单细胞撕去下表皮露出叶肉细胞用解剖刀刮下细胞途径一之 机械法第一种方法：用刀片刮叶片第二种方法：叶片研碎、离心研碎成粉加研磨介质过滤、离心只有薄壁组织排列松散，细胞间结触点很少时用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。途径一之 酶解法Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞加果胶酶过滤、离心途径二：由培养组织分离单细胞茎段步骤：(1) 诱导产生愈伤组织；(2) 愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性；摇床用于振荡继代悬浮(3)（Suspension culture)将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物15ml medium/1g120rpm

24、 culturetransfer 1time/3d 3 weeks100-130目网过滤Centrifuge(离心） isolation注意： 选择适宜的外植体：幼胚、胚轴、子叶是最常使用的外植体。 选择适宜的培养基：较高浓度激素浓度，特别是生长素，必要的附加物质，例如水解酪蛋白、Pro、Gln。 继代多次，以获得均匀一致疏松的愈伤组织。 （二）单细胞培养技术植物单细胞培养的意义1）建立单细胞无性系 悬浮培养细胞间细胞间在遗传、生理和生化上存在差异，这些差异反映在它们的产量、品质、抗病虫性和抗逆性等方面。如果能将高抗、高产、高品质的细胞株筛选出来，无疑会带来巨大的经济效益。2）排除体细胞的干扰

25、3）利于对细胞活动跟踪观察 单细胞培养的方法1）细胞平板培养概念：将制备好的单细胞悬浮液，按照一定的细胞密度，接种在1mm左右的薄层固体培养基上进行培养，称之为平板培养主要技术要点：单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不能超过6个细胞，因此过滤时网筛的网眼要选择合适。单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤2次以后，调整密度为5105/ml植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份35的固体培养基充分混合均匀，然后均匀的平铺与培养皿中，其厚度为1-2mm。待植板后的培养基完全凝固后，用石蜡或parafilm封口膜将培养皿封严以防污染在25黑暗条件下培养3周即可长出肉眼可见的愈伤组织。

26、植板率评估：它以能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例来表示。 植板率()(形成的细胞团数/接种的细胞数)100计算式中每个平板新形成的细胞团数的计数方法有两种：一是直接计数法，注意计量时要掌握合适的时间，即细胞团肉眼已能分辨，但尚未长合到一起的时候。二是感光法，在暗室的红光下将一印相纸放于欲计数的培养皿下，其上放一光源使培养皿中细胞团印到相纸上，冲洗照片计数。2）看护培养nurse culture 在单细胞的生长环境里加入愈伤组织同时培养。愈伤组织提供促细胞分裂的物质等，传递生物信息，使持续分裂增值等，即愈伤组织看护单细胞3）微室培养概念：人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培

27、养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法，称微室培养。特点：（1）能在显微镜下追踪单细胞分裂增殖形成细胞团的全过程（2）培养基少，营养和水分难以保持，pH值变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。4）其它单细胞培养技术A饲养层培养基技术将饲养细胞先用射线辐射处理，然后将饲养细胞和培养细胞混合植板，经过照射的细胞对于培养细胞起到一个饲养作用。B双层滤纸植板培养方法培养基饲养层细胞看护滤纸层转移碟滤纸培养细胞单倍体细胞的培养 单倍体细胞的培养（花药培养）：指将植物单倍体细胞培养成单倍体植株或纯和二倍体植株一般采取花药作为单倍体细胞的培养对象用花粉在固体培养基上培养愈伤组织培养愈伤组织既是组织又是细胞，为脱分

28、化细胞，具再分化的能力，可用于次生代谢物的生产，也可再生为植株。毛状根诱导和培养一些次生代谢产物只有在根里生长发根农杆菌感染双子叶植物，RI质粒诱导产生毛状根。形态方面：Ri质粒诱导快速生长的、非定向性、高分支的毛状根的形成代谢方面：Ri质粒转化根能合成与原植物相同或相似的次生代谢物，并且发根合成次生代谢物具有遗传稳定性。毛状根生长快速和次级代谢产物含量高，特别适用于从木本植物和难于培养的植物中得到较高含量的次级代谢产物。毛状根具有如下特点：激素自养，不必加外源激素；次级代谢产物含量高且稳定；增殖速度快。用发根农杆菌经直接注射法，外植体接种感染，原生质体共培养法诱导毛状根发根农杆菌转化后，经筛

29、选鉴定低盐浓度下生长，培养（三）细胞悬浮培养cell suspension culture 细胞悬浮培养的概念和意义： 悬浮培养是将单个游离细胞或小细胞团悬浮在液体培养基中进行培养增殖的技术。Bioreactor for continuous cell suspensionsShaker for suspension cultureCulture wheel 悬浮细胞培养：（1）细胞可以不断增殖，形成高密度 的细胞群体，适于大规模培养；（2）能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。Cell suspensionPlantsArtificial seedsSeconda

30、ry productsIsolation protoplastsMutation select细胞悬浮培养的应用 细胞悬浮培养的方法培养基：对于用愈伤组织制备的悬浮细胞培养的培养基以原愈伤组织继代时的培养基除去琼脂为好。为了提高细胞的分散度，对于生长素和细胞分裂素的比例需要进行一些调节。 培养细胞的起始密度及细胞记数（1）最低有效密度的概念 在悬浮细胞培养中，使悬浮培养细胞能够增殖的最少接种量称为最低有效密度或者临界的起始密度。 最低有效密度由于培养材料、原种培养条件，原种保存时间长短、培养基的成分不同而有差异，一般为104105细胞/ml（2）细胞记数要保证细胞培养的最低有效密度，在细胞游离

31、后要对分离的单细胞进行记数，可用血球记数板。（3）活细胞测定除测定细胞密度外，尚需要测定活细胞率以作为测定起始密度的参考活细胞率（%）=（5个视野中的活细胞数/5个视野中的细胞总数）*100%活细胞测定的方法：A、醋酸酯荧光素（FDA）染色法FDA本身无荧光，无极性，可自由通过原生质体膜进入细胞内部，进入后由于受到活细胞内脂酶分解，而产生有荧光的极性物质荧光素。因此有活力的细胞便产生荧光，而无活力的原生质体不能分解FDA，因此无荧光产生，故在荧光显微镜下观察到荧光的是有活力的，反之无活力。具体操作：取0.5ml细胞悬浮液放入到小试管中，加入FDA溶液，使最后浓度达到0.01%，混匀，室温下作用

32、5min，荧光显微镜观察。B、酚藏红花染色法先配制0.1%酚藏红花溶液，溶剂为培养液。检查时将悬浮细胞取一滴放在载玻片上，滴一滴0.1%酚藏红花，盖上盖玻片，染成红色的是死细胞，无色的是活细胞。悬浮培养细胞数目的增殖变化细胞生长各个时期的特点：滞后期（延迟期）:细胞很少分裂，其长短与接种量大小和继代时原种细胞所处的生长期有关对数生长期:细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长速率保持不变直线生长期:细胞生长和发育最明显的时期缓慢期:生长逐渐缓慢,培养液消耗将尽，有毒代谢物质增多，氧气减少静止期:生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚至开始死亡。注意A、滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细胞所处

33、的生长期和转入细胞数量的多少。B、加入条件培养基可以缩短滞后期。 条件培养基：曾培养过一段时间组织或细胞的培养基。C、缩短两次继代时间间隔，则可使悬浮培养的细胞一直保持对数生长期。 D、如果使处在静止期的细胞悬浮液保持时间太长，则会引起细胞的大量死亡和解体。操作注意事项：对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径要小，只能通过单细胞或小细胞团（2- 4细胞），使用吸管或注射器。继代前，培养容器静置短时间，大细胞团沉降，再吸上层悬浮液。依此，多次，可建立良好的细胞悬浮培养物。（4）细胞生长的测定对于任何一个建立的细胞悬浮系都应该进行动态的测定，以掌握其生长的基本规律，为继代培养或其他研究提供依据。A、细

34、胞记数注意：由于悬浮培养的细胞并不会呈游离单细胞，因此 通过培养瓶中直接取样很难进行可靠的细胞记数。可用5%8%铬酸或0.25%的果胶酶对细胞团进行处理生长速率pP=（lnx-lnX0）/tX为t时间的细胞密度，X0为起始细胞密度B、细胞大小的测定技术（用显微测微计）C、细胞体积：将一定量的细胞悬浮液放入放入15ml刻度离心管中于2000g离心5min。以每毫升培养液中细胞体积的毫升数来表示。D、细胞的干重和鲜重。将一定量的细胞悬浮液加到预先称重的尼龙布上，用水冲洗并抽滤除去细胞粘着的多余水滴，然后称重，两者差就是细胞的鲜重。干重一般是将离心收集的细胞转移到预先称重的滤纸片上，然后在60烘12

35、h，在干燥器中冷却后称重。细胞的干重和鲜重一般以每毫升悬浮培养物的重量表示。E、有丝分裂指数在一个细胞群体中，处于有丝分裂的细胞占总细胞的百分数称为有丝分裂指数，指数越高，分裂进行的速度越快。一般用孚尔根染色法，先将组织用1molHCl在60水解后染色，常规镜检，统计500个细胞，计算。一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般23天甚至更短时间便可增加一倍。悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在3050个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单

36、细胞组成的植物细胞悬浮系。（5）影响悬浮细胞生长的因素：起始愈伤组织的质量：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。接种细胞密度：接种初期的细胞密度过低往往使延迟期加长，悬浮细胞的起始密度一般在0.52.5105个细胞/毫升，低于这一密度则会使细胞生长延迟。 培养条件：方式、温度、继代周期（6）悬浮细胞的同步化细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。 同一培养体系中，细胞不同步使悬浮细胞的分裂、代谢以及生理、生化状态等更趋复杂化，所以人们一直希望通过一定的技术途径，使同一培养体系中的细胞能保持相对一致的细胞学

37、和生理学状态，工作中常用的处理方法：A、物理方法a）分选法通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。 b）冷处理法。低温处理可以提高培养体系中细胞同步化的程度B、化学方法a）饥饿法悬浮培养细胞中，若断绝供应一种细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1或G2期，经过一段时间的饥饿之后，当在培养基中重新加入这种限制因子时，静止细胞就会同步进入分裂。 b）抑制剂法 通过一些DNA 合成抑制剂处理细胞，使细胞停留在DNA 合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期的细胞。 常用的抑制剂有5-氟脱氧尿苷，5-氨基尿嘧啶、羟基尿等。

38、c）有丝分裂阻抑用秋水仙素处理指数生长的悬浮培养物，浓度一般控制在0.2%，处理时间以4-6小时为宜无论何种细胞同步化处理，对细胞本身或多或少都有一定的伤害。如果处理的细胞没有足够的生活力，不仅不能获得理想的同步化效果，还可能造成细胞的大量死亡，因此在进行同步化处理之前，细胞必须进行充分的活化培养。用于处理 的细胞系最好处于对数生长期。(四) 培养方法培养对象：原生质体培养、单倍体细胞培养培养基类型：固体培养和液体培养培养方式：悬浮细胞培养和固定化细胞培养固体培养固体培养包括利用琼脂作为支持物的固体培养和固定化细胞培养。固体培养是在培养基中加入一定的凝固剂如琼脂，加热溶解后，分别装入培养容器中

39、，冷却后凝结成固体培养基。优点：简便易行、培养占空间小缺点：外植体或愈伤组织仅有一部分与培养基接触，导致该部分营养物质迅速吸收而形成培养基中营养物质的浓度差，产生愈伤组织生长的不平衡。外植体基部插入固体培养基中，该处呈现气体交换不畅，阻碍了组织呼吸作用的正常进行，同时会堆积生长过程中排出的有害物质。静止状态下，由于重力作用，以及光线从上部或侧部射入，因而在愈伤组织细胞间出现极化现象，导致细胞群体的不均匀状态。固体培养物有时需要测定生理生化指标，必须将其转入液体中，此时组织会很快膨胀，从而改变了组织在固体培养基中所具有的形态及生理状态。常用固化剂有琼脂、藻酸盐、角叉藻聚糖、明胶、羟乙基纤维素、聚

40、丙烯酰胺、淀粉和硅胶等。其中琼脂是最常用的固化剂，最适浓度0.6%1.0%；明胶的使用浓度通常为10%。固体培养和液体培养互相配合是组织/细胞培养的常规操作。温度保持25度左右；光照因材料不同而异，一般为日光灯照射，每天16h为宜。液体培养包括小规模的悬浮培养和大规模的成批培养、半连续培养和连续培养。悬浮培养分静止和震荡两种方式，静止培养也简单易行，还不会出现营养物质浓度差的问题；震荡培养可以克服静止培养的许多问题，培养基占容器体积的2030%，可以用磁力搅拌或摇床等分批培养法、半连续培养法、连续培养法、固定化培养法（了解掌握）植物组织培养技术的流程植物细胞培养工业化存在的问题生长缓慢,通常完

41、成一次生产周期需4-5周次级代谢物含量低培养细胞不稳定等多数产物积累于胞内不耐受剪切力一般的说，只有当次级代谢产物的价格高于1000美元/kg时，才考虑采用植物细胞培养方法。四、植物细胞生物反应器植物细胞易聚集化，比较脆弱，代谢途径和代谢产物累积与细胞生长关系比较复杂，选择合适的培养方法和反应器直接影响到产物产量。细胞培养周期长，次生代谢产物含量相对较低，提取困难，生物反应器技术还有待深入各种生物反应器性能比较植物细胞生物反应器应根据细胞株系的不同而异。除了考虑低剪切力及有效传氧外，还要注意反应器内环境的控制、规模放大以及操作的难易等。总的说来选择生物反应器要考虑如下因素：供氧能力和气泡分散程

42、度剪切力大小对细胞的影响高密度培养时培养液的混合程度温度、pH及营养物质浓度的控制能力细胞团大小的控制能力易于放大不同类型的生物反应器各有其优缺点，而改进的搅拌式生物反应器和气升式反应器可能更适合植物细胞的培养。一般来说，悬浮培养的细胞在干重不大于20g/L时，以气升式反应器为宜，而当干重超过20g/L时，则改进的搅拌式生物反应器优于其它类型的反应器我国发明的“气升内错流”式植物细胞培养反应器，能够适应植物细胞培养周期长，培养液随培养进程而蒸发减少的生物反应过程；可抑制气泡的聚合，减弱气泡在液面破裂时产生的冲击力对细胞的损伤；可提高降液区气含率，消除降液区缺氧现象，并强化混合与氧传递，大大降低

43、反应器高度。使用这种反应器培养新疆紫草细胞，培养结束时细胞量达到12gdwL，紫草宁含量达到了细胞干重的10，是天然植株含量的28倍 第五节 植物细胞大规模培养与次生代谢产物生产概述培养系统植物细胞规模培养技术要点技术要点提高细胞次生代谢产物的途径细胞规模化培养中的有关技术问题IntroductionPrimary metabolites are compounds needed in the basic processes that keep the plant alive, such as carbohydrates, proteins and lipids. Secondary meta

44、bolites are compounds produced in plants that are not necessary for the plants basic functions. Some secondary metabolites are produced as chemical defense against microbes and animals.Type:Secondary metabolites are used in the pharmaceutical industry, as flavourants and dyes, and in perfumery. Seco

45、ndary metabolites include terpenes, cardiac glycosides, steroidal compounds, alkaloids and many more.2植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义。李时珍（1593）在本草纲目中所开列的1892种药物绝大多数是植物药物，目前仍有约25的法定药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产物。产品成分用途年销售额（亿美元）长春花碱（长春花）治疗白血病1820（美国）阿吗灵循环系统障碍药525（全世界）奎宁（金鸡纳树）治疗疟疾510（美国）致热素杀虫剂20（全世界）毛地黄心脏病药2055（美国

46、）许多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和名贵化妆品原料。有些是生物毒素的主要来源，可以用于杀虫、杀菌，而对环境和人畜无害，是理想的环保产品。例如：从胡萝卜、万寿菊提取色素从黄菊提取芳香油栀子提取果酸：果酸含有大量的维生素，如维生素C、柠檬酸等。主要用作食品的调味剂，化妆行业用于制作护肤品和洗发香波等，美容院用作换肤液。 3规模化细胞培养是生产植物次生产物的理 想途径 保护生态环境 提高生产效率 发展新型生物技术产业生产方式生产周期紫草宁含量（干重）完整植株23年12植物细胞培养3周14来自于植物体和细胞培养的紫草宁含量比较 影响植物次级代谢产物积累的因素影响因素主要有：生物条件：外植体、季节

47、、休眠、分化等物理条件：温度、光照、通气、pH、渗透压等化学条件：无机盐、C源、植物生长调节剂、维生素、氨基酸、核酸、抗生素等工业培养条件：培养罐类型、搅拌通气和培养方法等重点介绍外植体选择和培养条件的影响外植体选择不同外植体的悬浮细胞培养物，其最大次级代谢产物的累积时间各异，分别有在细胞生长的延迟期、加速期、对数期和稳定期，因此同一化合物可以在不同外植体的不同生在阶段中积累。影响因素外因内因遗传性状生理状态营养条件环境条件无机盐有机物激素天然复合物渗透压酸碱度湿度温度光照培养条件的影响两步培养法由于同时获得最佳生长和最佳此生代谢产物产量非常困难，人们提出两步培养法。第一步使用适合细胞生长的培

48、养基，称为生长培养基，第二步使用适合于次级代谢产物合成的培养基，称为生产培养基。两种培养基各有特点：生长培养基是为了实现细胞的高生产率，生产培养基通常具有较低含量的硝酸盐和磷酸盐，并含有较低的糖分或较少的碳源。目前很多有用物质的两步培养法已经建立进行大规模培养生产。实例见p157表5-11 4、植物细胞培养的特性1植物细胞较微生物细胞大得多，有纤维素细胞壁细胞耐拉不耐扭，抵抗剪切力差；2培养过程生长速度缓慢，易受微生物污染，需用抗生素；3细胞生长的中期及对数期易凝聚为团块，悬浮培养较难；4培养时需供氧，培养液粘度大：5具有群体效应；6 因为有细胞壁, 培养细胞产物滞留于细胞内，产量较低；7细胞

49、培养过程具有结构与功能全能性,因而易分化,从而导致目的产物低于原植物体内的浓度；8 悬浮培养中要求有一定的细胞浓度，否则不生长（2500050000个/ML）。 5、植物细胞培养需要解决的问题 （1）氧和二氧化碳的控制，过多氧过少氧均不利于生长；（2）营养物的供应；（3）细胞密度过高引起细胞团聚甚至分化；（4）培养过程中细胞的分化的防止； （5）细胞取得中微生物的去除；（6）细胞壁脆性的存在要求培养体系剪切力要小；培养系统1.悬浮培养系统机械搅拌式培养系统 机械搅拌式生物反应器通常是根据植物细胞的特性在微生物发酵罐的基础上作如下改进：搅拌装置要减少剪切，一般改叶轮式为螺旋式因为植物细胞生长周期

50、长，需要随时补充水分和营养，因此必须设计加液装置；由于植物细胞的生理活动需要新鲜空气，且细胞代谢也可能产生有害气体，所以必须设计通气装置； 为便于取样观察，一般还设计有取样口。机械搅拌式培养系统气压搅拌式培养系统 考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用难以避免，同时搅拌器转动的中轴往往是容易使培养物污染的部位，因此，发展出空气提升式生物反应器，但其缺点是搅拌不均匀。 旋转式培养系统一般用于产品中试或某些必需裂解细胞才能获得目的产物的培养，其优点是控制精确，处理灵活，缺点是培养体积较小。 2、固定化培养系统In many callus and suspension culture systems it

51、 has been found that the cells do not produce the secondary metabolites found in the mother plant. However, when differentiation takes place, either shoot/root organogenesis or somatic embryogenesis, the differentiated tissues start producing the same secondary metabolites as the mother plant.细胞固定化培

52、养技术按照其支持物不同可以分为两大类：包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐b、聚丙烯酰胺等；附着式固定化培养系统：支持物采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。（1） 平床培养系统。本系统由培养、液罐和动泵等构成。新鲜的细胞被固定在床底部由聚屏烯等材料编织成的无菌平垫上。无菌液罐被紧固定在培养床的上方，通过管道向下滴注培养液。培养床上的营养液再通过动泵循环送回中，本系统设备较简单，比悬浮培养体系能更有效地合成次生物质。不过它占地面积大，累积次生代谢物较多的滴液区所占比例不高；而且在这密封的体系中氧气的供应时常成为限制因子，经常还得附加提供无菌空气的设备。（2）立柱培养系统本方

53、法将植物细胞与琼脂或褐藻酸钠混合，制成一个个1-2 cm3的细胞团块，并将它们集中于无菌立柱中。这样，下滴的营养液流经大部分细胞，亦即“滴液区”比例大大提高，次生物质的合成大为增强，同时占地面积大为减小。这一技术的优点在于： 细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所处的状态，相互间接触密切，可以形成一定的理化梯度，有利于次生产物的合成； 由于细胞固定在支持物上，培养基可以不断更换，可以从培养基中提取产物，免除了培养基中因含有过多的初生产物对细胞代谢的反馈抑制，也由于细胞留在反应器中，新的培养基可以再次利用这些细胞生产初生产物，从而节省了生产细胞所付出的时间和费用； 正是由于细胞固定在一定

54、的介质中，并可以从培养基中不断提取产物，因此，它可以进行连续生产。可以较容易地控制培养系统的理化环境，从而可以研究特定的代谢途径，并便于调节；植物细胞固定化培养时必须考虑以下几个问题： 所选用的植物细胞的次生代谢产物的产量是否很高，细胞生长速度是否较慢并能维持较长时间的生活能力； 所选用的固定支持物对细胞的存活是否有影响，对产物的合成是否有阻碍； 终产物是否能释放到培养基中，如果产物不释放到培养基中，是否能采用物理(电击)或化学(离子渗透法)方法使其释放而又不影响细胞生活力。植物细胞规模培养技术要点1.细胞系的建立和选择悬浮细胞系 单细胞养与筛选 种细胞增殖有效成分分析2.优良细胞系的增殖培养

55、所选择的优良细胞系，进行大规模繁殖，得到足够的细胞是建立细胞规模化培养体系的中间环节。 3.大规模培养体系的建立 一步法逐级放大：对于细胞生长与目的产物合成同步的类型，一般采用此方法建立大规模培养系统。两步法：用于目的产物合成在细胞生长发育到一定时期进行，细胞生长和产物合成需要不同的培养基的类型。先在细胞生长培养基中培养大批量细胞，当细胞生长至合成产物的阶段后，再将其转入到产物合成培养基中培养。如果采用固相培养方式生产次生产物，一般均需采用两步法建立体系。 提高细胞次生代谢产物的途径1明确植物细胞生长与产物合成的关系 生长偶联型 产物合成与细胞生长成正比。如长春花属植物中的长春花碱的合成、烟草

56、细胞的烟碱合成、薯蓣属植物中的薯蓣皂甙的合成等； 中间型 产物仅在细胞生长下降时合成，细胞处于指数生长期或停止生长产物都不合成。蒽醌类物质合成的植物细胞，托品类生物碱类合成的植物细胞等属于此类型； 非生长偶联型 产物合成在细胞生长停止以后。如紫草宁的合成。 2、选择适宜的起始材料首先必须选择能够高效合成目的产物的植物种类。在此前提下，起始培养材料还应考虑器官和组织特异性，通常选取自然状态下能够积累次生产物的部位，这样的细胞经过培养后常具有合成目的产物的能力，或比较容易诱导合成目的产物。同时要筛选高产、稳产的细胞株系。3、选择合适的培养基成分一般来说，增加培养基的N，P、K的浓度能促进细胞生长，

57、而适当增加糖浓度有利于次生产物的合成。培养基的成分包括培养条件要通过一定的实验才能选择出既有利于细胞大量生长繁殖又有利于次生代谢产物大量产生的培养基。4、 precursors By feeding a precursor, often cheap and freely available, the yield of secondary metabolites can be increased. The precursor is converted using the same biosynthetic pathways as in the intact plant. However, som

58、etimes cell cultures convert precursors into new compounds not found in the plant.5、激发子的应用植物细胞次生代谢除了自身的遗传或发育基础外，通常还与诱导因子有关。在一些不良环境或有微生物侵入的情况下，细胞次生代谢活动显著增强。因此，人为合理的应用这些诱导因子，就有可能提高目的产物的产量。激发子也称诱导子，是指能够诱导植物细胞中一个反应，并形成细胞特征性自身防御反应的分子。A、非生物激发子，如辐射、金属离子等B、生物激发子，（外源激发子，多来源于微生物，内源激发子，来源于植物本身的物质，如降解细胞壁的酶类，细胞碎

59、片、寡聚糖等。）6、培养技术的选择包括对反应器的选择和对培养方式的选择，就目前的技术基础来讲，固定化培养是植物细胞规模化生产较为理想的系统。为了同时满足细胞生长和产物合成的需要，通常需要在不同阶段使用不同的培养基，即两阶段培养为了解决产物对合成的反馈抑制可以采用两相培养技术，液-液系统：分离相常用的有液体石蜡、烷类化合物、甘油等液-固系统：常用的有活性炭、硅酸镁载体、沸石、蚕丝、树脂等。一般来说，提取相的选择目标是具有较大的分离能力，同时对于没有毒副作用，不影响产物的化学稳定性。植物细胞规模化培养中的有关工程技术问题 1悬浮培养系统必须适应植物细胞特性2植物细胞培养液的流变特性植物细胞培养液的

60、流变特性常用粘度来描述培养过程中培养液的粘度变化可由细胞密度和细胞分泌物以及细胞状态引起。如烟草培养液的表观粘度培养过程中主要是由培养细胞密度的增加引起的，当细胞密度低于7gL-1时，培养液的粘度基本保持不变，而当细胞密度高于此值时，培养液的粘度即增加。长春花细胞培养，当细胞密度在10 gL-1时，培养液属于假塑性流体，此时，培养液的粘度依赖于细胞年龄、形态和细胞团的大小。在相同物质浓度下，大细胞团的营养液表观粘度明显大于小细胞团培养液的表观粘度。 3植物细胞培养过程中的气体调节O2：KLa（体积氧传递系数，单位时间、单位体积氧量）：如在4L的气升式反应器中进行长春花细胞培养时，KLa在20h