生化实验技术专题课件

1、生化实验技术专题 主要内容和要求：以蛋白质分离纯化为例介绍生物大分子分离纯化的一般步骤和注意事项；介绍层析技术、电泳技术、离心技术的原理及其应用；总结蛋白质、核酸、酶、氨基酸测定的主要方法。目录第一节 生物大分子物质的制备第二节 几种主要的生物化学实验技术第三节 生物分子的检测第一节 生物大分子物质的制备一一般过程二注意事项三纯化方案的设计和评价例：宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化材料的选择和处理确立测定方法细胞的破碎有效成分的抽提有效成分的浓缩生物大分子分离纯化的一般步骤层析法 电泳法 超离心法 超滤盐析（硫酸铵盐析）等点电沉淀有机溶剂沉淀透析前处理 粗分级 细分级 材料选择与处理细胞破碎（

2、机械破碎、溶账和自溶、酶解、化学处理）生物组织无细胞提取液粗产品结晶几种主要沉淀方法比较注意事项1控制适当的pH2控制低温3注意提取过程中的溶液环境4防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化 纯化步骤 总蛋白 总活力 比活力 纯化倍数 回收率 （mg） （U） （U/mg蛋白） （%）1、粗酶液 80 4320 54 1 1002、乙醇沉淀 29 3585 123 2.27 833、醋酸钙沉淀 21 2980 141 2.64 694、盐析 4 1771 464 8.52 415、丙酮沉淀 1 1166 1104 20.29 276、结晶 0.12 130 1072

3、 19.70 3一层析技术（chromatography）1层析技术一般原理2层析技术分类及应用层析技术原理 层析技术是一种物理的分离方法。无论何种层析，其系统通常由互不相溶的两个相组成：一是固定相（固体或吸附在固体上的液体），一是流动相（液体或气体）。层析时，利用混合物中各组分理化性质（如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、溶解度等）的差异，使各组分不同程度地分布在两相中，随着流动相从固定相上流过，不同组分以不同速度移动而最终被分离。样品在层析时的移动速度可用迁移率Rf值表示： 样品原点到斑点中心的距离 Rf= 样品原点到溶剂前沿的距离层析法分类（按装置分类 ） 纸层析 薄膜层析

4、柱层析洗脱液样品填充物分部收集玻璃柱层析法分类及原理（按分离原理分类 ） 吸附层析分配层析凝胶过滤（分子筛层析）离子交换层析亲和层析 聚焦层析各类层析的原理和载体类别 分离原理 基质或载体吸附层析 化学、物理吸附 硅胶、氧化铝 、羟基磷酸分配层析 两溶剂相中的溶解效应 纤维素、硅藻土 、硅胶凝胶层析 分子筛效应的排阻效应 sepharose 、sephadex离子交换层析 离子基团的交换反应 离子交换树脂 、纤维素、 葡聚糖亲和层析 分离物与配体之间有 带配基的sepharose 特殊亲和力 或sephadex聚焦层析 等电点和离子交换作用 多缓冲交换剂（与带有多种电 荷基团的配体相偶联的 s

5、epharose 6B）分配层析原理： 分配层析实际上是一种连续抽提方式。如纸层析中滤纸的结合水为固定相，以水饱和的有机溶剂为流动相（展开剂）。当流动相沿滤纸经过样品点时，样品点中的溶质在水和有机相中溶解度不同而不均匀地分配在两相中，各种组分按其各自的分配系数进行不断分配，从而使物质得到分离和纯化。载体 ： 纤维素 硅藻土 硅胶应用：各种生化物质的分离鉴定分子筛层析（gel-filtration chromatography）原理基质 葡聚糖凝胶（sephadex） 琼脂糖凝胶（sepharose）应用 测定分子量 脱盐和浓缩 分离提纯生物大分子 除去热原物质离子交换层析（ion-change

6、 chromatography）原理基质 疏水型离子交换剂；亲水型离子交换剂应用 制备纯化生物物质 定量、定性测定混合物中各组分1.平衡阶段:离子交换剂与反离子结合2.吸附阶段：样品与反离子进行交换3、4. 解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质5.再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，既可重复使用12345原始缓冲溶液的反离子样品溶液梯度浓度亲和层析（affiuity chromatography）应用 分离纯化酶、 抗原、抗体 分离纯化核酸 研究酶的结构与功能+待纯化分子配体a. 待纯化分子和配体间具有亲和性+基质b. 活性基质与配体结合产生亲和吸附剂+杂质c.

7、待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离+d. 偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子原理：基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、 sepharose、sephadex聚焦层析（Chromatofocusing） 该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。 pH梯度的形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成)是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成pH梯度的层析柱上时，由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地 迁移到与它等电点相同的pH处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在

8、等电点pH时被洗出。在聚焦层析过程中，一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出，并且有一定的时间进行聚焦，剩余样品还可以加到柱上，其聚焦过程都能顺利完成。层析时的聚焦效应示意图pH梯度溶液的形成示意图蛋白质1（pI=7）蛋白质2（pI=8）流速移动速率几种主要层析方法比较电泳的一般原理 电泳是带电颗粒在电场作用下向着与其电荷相反的电极移动的现象 。许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子组成、性质及其所在介质的pH。如果混合物中各组分的结构组成不同，在某一pH溶液中，各组分所带电荷性质、电荷数量不同，加之其分子量不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异，而达到分离鉴定各组分

9、的目的。电泳技术分类（按实验装置分类） 纸电泳 薄膜电泳 凝胶电泳 毛细管电泳垂直板凝胶电泳毛细管电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 凝胶聚合反应及催化系统 不连续PAGE 可产生的三种效应： 电荷效应、 分子筛 效应、 浓缩效应SDS原理： 当SDS（Sodium Dodecyl Sulfate）与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别就降低乃至消除了。与此同时蛋白质在SDS的作用下结构变得松散，形状趋向一致，所以各种SDS -蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映了分子量的差异。在此条件下，样品分子量的对数与其在凝胶中的

10、迁移率呈直线关系。可用下式表示： Log M=a b应用: 测定蛋白质分子量 测定蛋白质亚基数等电点聚焦（isoelectric focusing）原理: 在一定抗对流介质（如凝胶）中加入两性电解质载体(Ampholyte,是一种多氨基多羧基的混合物，由异构物和同系物组成，其pK和pI值各自相异却又相近），当直流电通过时，便形成一个由阳极到阴极pH值逐步上升的梯度。两性化合物在此电泳过程中，就被浓集在与其等电点相等的pH区域，从而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。应用： 高效率分离纯化蛋白质 测定蛋白质分子量免疫电泳immunoelectrophoresis 微量多槽免疫电泳 火箭免疫电泳

11、毛细管电泳 毛细管电泳又称毛细管区带电泳，它是在毛细管（2-75m）中装入缓冲液，从其一端注入样品，在毛细管两端加高压直流电实现对样品的分离，分离后的样品依次通过设在毛细管一端的检测器检出。该法克服了传统区带电泳的热扩散和样品扩散的问题，实现了快速和高效分离。 毛细管电泳是近年来发展起来的一项新技术，被认为是90年代最有影响的分离手段之一。目前已广泛用于氨基酸分析、蛋白质高效分离、指纹图谱研究、分离合成的寡核苷酸、 DNA序列测定及PCR产物的分析鉴定等。毛细管电泳装置示意图高压电源光源光电倍增管数据采集毛细管缓冲液-样品缓冲液三、 离心技术1离心机类别 普通离心机 6000转/分 高速离心机 2-3万转/分 超速离心机 3万转/分2沉降系数（S）概念3超离心法类别 沉降速度法（sedimentation velocity） 沉降平恒法（sedimentation eguilibrium）超速离心机工作原理图解光源转轴转头样品池光学系统液面沉降界面沉降物质平衡池沉降界面峰浓度对距离的图谱沉降系数（S） 生物大分子在单位离心力场作用下的沉降速度称为沉降系数。即沉降系数是微颗粒在离心力场的作用下，从静止状态到达极限速度所需要的时间。其单位用Svedberg，即S表示，S=110-13秒。沉降系数（S）与分子量（M）的关系M