蛋白质结构解析技术研究现状与方向

1、蛋白质结构解析技术研究现状与方向摘要：蛋白质是生物体维持生命活动不可或缺的功能性大分子物质，解析蛋白质结构对于人们了解蛋白质的 生物学功能及其生理特性具有重要意义。近些年来，蛋白质结构解析技术不断发展，除了传统意义上的 X射线晶体衍射法和核磁共振技术等，具备高分辨率的冷冻电镜技术的出现令此领域有了革命性的进 步。文章分析及比对了蛋白质结构解析技术的作用机制、技术进展以及它们未来的研究方向。关键词：蛋白质结构；X射线晶体衍射；核磁共振；冷冻电镜蛋白质是生物的生命进程中的主要功能性大分 子物质，结构生物学即利用蛋白质分子空间结构的 解析来分析蛋白质生物学功能，并进一步研究生物 体生命活动分子机制囚

2、。故解析蛋白质分子结构是日 前较为热门的研究方向$现阶段对蛋白质分子空间 结构的解析方法主要有较为传统的核磁共振技术 (nuclear magnetic resonance)X 射线晶体衍射法(X- ray crystalline diffraction)以及近期研究较多的冷冻 电镜技术(Cryo-Electron Microscopy)2等 $一、X射线晶体衍射法自从1895年伦琴发现X射线后，物理学家们就 开始探索X射线的特性及其应用方向叫在1934年， 贝尔纳和克劳福特得到了第一张蛋白质(胃蛋白酶) 晶体的X射线衍射图片$ 1953年，蛋白质晶体学家 佩鲁茨通过将重金属粒子引入蛋白晶体里

3、，进行同 晶置换来解决蛋白晶体X射线衍射相位问题，提出 了蛋白质晶体分子结构可测定型的理论基础，并进 行了低分辨率的蛋白晶体衍射解构凯历史上，用X 射线晶体衍射法第一个测定蛋白质大分子结构并对 其分子结构进行解释的是布莱克和菲利普斯，他们 分别测出了溶菌酶的三维空间结构并解释了其分子 作用机理叫后期，X射线大多由同步辐射光源产生。X射线衍射法测定蛋白质空间结构时，需要先 对目标蛋白进行纯化及结晶$解析蛋白晶体结构所 涉及的X射线波长约为1A，这是因为蛋白晶体结构 中的分子均为规律性分布，且晶体内原子间的距离 与此波长范围的数量级相同时$当光打到蛋白晶体 上，蛋白晶体内每个原子都产生次生射线相互

4、叠加 且干涉，且形成强X射线衍射成像。其晶体衍射状况 和晶体自身结构相关，具备强烈的规律性及特征性$ 其衍射强度与单位晶胞中的重金属原子排列周期及 方式等特性相关，衍射的方向和单位晶胞的大小及 形状等相关e$人们利用晶体中衍射位点的间距及排 列分析蛋白晶体结构的排列规律及方式，并通过计 算机辅助计算，利用衍射强度的不同，分析蛋白空间 结构中单个原子的坐标位点%8，以此解构蛋白晶体$二、核磁共振技术核磁共振包括固相和液相技术，其最大特点是 液相核磁共振技术$固相核磁共振技术主要用于不 可溶蛋白结构，而液相核磁共振技术的应用更为广 阔，它可以在液相环境中，在各类如温度、离子浓度 及pH值等因素接近

5、生理条件情况下，对蛋白进行解 构。1978年，核磁共振技术首次被用于蛋白质结构的 解析，获得首个高分辨率病毒衣壳蛋白三维结构(西 红柿丛矮病毒泪；在2008年，利用固体核磁共振技 术辅助电子显微镜，科学家获得了 ！片层结构的淀 粉样纤维蛋白的完整结构，此蛋白与阿尔茨海默病 关联紧密，有助于人们对此病症分子机理及诊疗手 段的研究网;核磁共振技术中取得重要进展领域之一 是通过核磁共振技术无损获得细胞中分子结构信 息，2009年，有研究显示，核磁共振技术展示了泛素 在细胞内外质子交换速率之差，以及细胞中蛋白 FKBP12与免疫抑制剂相互作用方式明，令人类社会 进一步了解了分子及原子水平中生物大分子功

6、能 ， 以及蛋白质结构和功能的关系&在应用液相核磁共振技术对蛋白结构进行研究 的过程中，首先需要通过同位素对蛋白样品进行标 记，主要是在培养基中利用15N对氮源标记、利用13C 对碳源标记，用同位素标记的碳源或氮源为唯一碳 素或氮素的来源&通过核磁共振技术处理后，需要指 认核磁共振谱图上的化学位移，即得到蛋白结构中 可形成核磁共振记号的每个原子化学位移的数值& 包括主链上及侧链上每个原子的化学位移&化学位 移指认可通过主链试验HNCA、HN （CO）CA等或侧 链特殊实验（HB）CB（CGCD）HD等确认$12&。正确选择 原始结构是后续步骤的重要基础，通过一些自动化 软件，如CYANA中的C

7、ANDID软件包，或ARIA等问, 确认NOE约束归属而获得粗糙的蛋白原始折叠空 间构像&在此基础上，继续研究，获得其结构约束，进 一步通过如 ANSO、SANE、Xplor-NIH 或 CYANA 等 软件计算结构，结构确认后最后通过如AMBER、 CHARMM以及INSIGHT等模拟分子动力学的软件 进行蛋白结构的精修。三、冷冻电镜技术冷冻电镜技术，即冷冻电子显微镜技术网,通过 将样品迅速冷冻固定于玻璃态不定型溶液里，用透 射电镜在低温条件下显像，再通过图形处理及后期 计算解析样品空间结构。此法具有样品无须结晶、可 研究的生物分子跨度达到12个量级、所需样品量 少、样品分辨率已至（近）原子

8、水平等优点，突破了研 究生物大分子的各类难题&近几年，冷冻电镜技术的 长足发展一是来自硬件的更新DDD （Direct electron detector，自接电子检测相机）的出现，DDD 具备高分辨的成像装备，能直接检测电子二是来 源于图形图像处理软件的进步， 可分辨较低分子量 的小分子蛋白和细胞器，并可对于样品漂浮而产生 的偏差进行纠正&冷冻电镜技术包括了样品分离纯化、 电镜样品 的制备、蛋白数据搜集及处理等步骤。冷冻电镜中所 需样品纯度需为90%至95%以上，对于纯化较困难 的蛋白样品，后期可进行软件数据模拟纯化以区别 不同状态样品。制备电镜样品时，通过液氮冷却的（ 烷将含水样品速冻，将

9、水分子转为玻璃态非晶体冰, 样品悬浮于其中，用于减少电子辐射，保持其天然构 像闽。然后通过电镜进行数据的收集，数据的收集量 来源于被测蛋白样品的均一性、分辨率、对称性及成 像质量等，对于均一性差、分辨率差以及不对称分子 通常需要采集大量粒子数据，约收集5到15万个数 据才可达到近原子分辨率&粒子数据收集后需要进 行进一步的处理，首先要先确定粒子的参数，每个粒 子图需确定5类参数，分别为平移的自由度X和Y （两个平面中）、旋转的自由度及！（两个离开平面 中）和#（一个平面中）$切，其中从旋转的自由度获得 了粒子空间三维数据，利用对位可消除一个平面中 的自由度,可通过重构软件SPIDER、XMIP

10、P及E- MAN2等的计算用以确认每个粒子相关参数&然后， 根据K均值聚类等算法进行二维分类，用以估算粒 子分布及取向、粒子数据质量等，二维分类后通过中 心截面原理利用共价线、RCT等方法重构样品的空 间三维结构，而后进行三维分类和模型的精修&三维 分类可确认不同粒子的空间取向、空间构像及组成 和结构等，而获取高分辨率空间结构，常用FRE- ALIGN和RELION软件闽。对模型进行精修时，可利 用投影匹配的方法进行比对，最终大幅度提高物质 空间结构的分辨率&最后通过FSC曲线对分子结构 的分辨率进行评估，通常分辨率在15A以上，可分辨 蛋白亚基的分界线；分辨率在10A以上可辨认二级 结构密度

11、;分辨率在4A以上可分辨蛋白主链；当分 辨率在3A左右，即可辨别氨基酸残基侧链基团等四。四、未来方向发展蛋白结构解析技术对于蛋白分子的结构、生物学 功能及其生理特性的了解和应用具有重要的意义& 近年来，多种蛋白结构解析技术的并行发展，同样对 结构生物学的发展发挥了重要的作用&X射线晶体衍射法较为主流和经典，2009年世 界上第一台X射线自由电子激光装置建成刖，自由电 子激光形成的射线是具备短时间高强度的脉冲，对不 能结晶的蛋白结构、超小晶体以及受损晶体可获得衍 射成像，使人们对生物大分子结构通过X射线衍射 法的解析方式有了另一种不同且全新的理解，在 RCSB Protein Data Bank

12、中通过X射线晶体衍射法解 析的蛋白结构占比约88%。但依赖于大分子晶体的 制备，对于许多无法结晶的物质存在着结构的难度。 利用同步辐射光源解析的主要是静态或者微动态蛋 白晶体结构，利用X射线自由电子激光解析的则是 ps甚至fs量级的蛋白动态空间构型四，被认为有可能 为生物大分子解构方式带来大跨步的跃进。核磁共振技术可获得蛋白的静态和动态结构， 在20世纪末期，只有相对分子质量较小(25k)的蛋 白空间结构可通过核磁共振技术解构。后因核磁共 振设备的不断更新，以及新的核磁脉冲和蛋白标定 技术的发现，核磁共振技术以及可以解构的蛋白已 远大于25k,甚至可解构超大蛋白，如分子量大小为 几十万的蛋白空

13、间结构。不光如此，液体核磁共振技 术更大的优越性表现在可解构蛋白分子在溶液环境 中的动态结构，它可利用核磁弛豫现象研究原子水 平下的多位点的蛋白动力学性质。在生物体中，蛋白 大多具备功能性，故静态空间结构的解构往往不能 完全反映蛋白功能性，故蛋白动态结构的解析是对 于蛋白生物学活性研究的关键一环$近些年核磁共 振技术发展到可研究更高分子量的蛋白大分子的动 态结构，如选择性标记或C代样品制备24，可获得更 多长程约束,提高解构质量,如TROSY(Transverse Relaxation Optimized Spectroscopy，横弛豫优化脉冲) 的出现，可指认化学位移及解析解构四。但多测定

14、的 为分子量较小的大分子类物质，可解析的蛋白结构 有限。故核磁共振技术，特别是液相技术可研究蛋白 动态结构、功能及其动力学特性，有其独到之处，虽 然如此，但由很多实验技术还不够成熟，不具备普适 性，还需要继续分析和改进$最近发展迅猛的冷冻电镜技术，可测定非晶体 生物大分子类物资，通过冷冻电镜技术可利用其高 分辨率能观察到小分子物质、解析小分子蛋白以及 不对称样品等。冷冻电镜对蛋白质结构解析技术的 发展在医学领域做出重要贡献。20世纪末，因冷冻电 镜对生物对称性样品特有的高度解析性，张景强得 到了分辨率仅为0.8nm的家蚕质多角体病毒，在病 毒蛋白结构研究及针对病毒致病机制对应药物研制 方面功不可没四;清华大学研究团队在2016年第一 次利用冷冻电镜获取了线粒体中呼吸链超级复合蛋 白空间结构，指明了以其为靶向物质药物的研究方 向；中国科学院生物物理研究所李国红和朱平研究 组合作获得了 30nm染色质左手双螺旋高分辨率三 维结构，有助人类对癌症等病症分子机制研究，并 为人类基因组计划做出了重要贡献$同时冷冻电镜 技术伴随着人类社会对生命科学领域研究的重视而 逐渐发展起来，清华大学王宏伟研究组于2017年首 次提出且利用冷冻电镜成像理论新方法过焦成像技 术得到高分辨蛋白质空间结构(30)$ 2018年浙江大学 冷冻电镜中心首次解析了蛋白质原