基因毒性杂质

1、基于风险评估的药物杂质研究分析方法开发策略&杂质研究常见问题解析汇报人：杨爔炎2019.03一、药品杂质研究评估策略二、痕量杂质定量分析方法的建立提 纲三、案例分析与讨论四、未知杂质分离鉴定案例分析一、药品杂质研究评估策略1.药品杂质研究的法规依据2.药品杂质评估一般步骤3.药品杂质来源途径分析4.药品杂质毒性判别方法5.药品杂质研究限度策略6.药品杂质风险评估的分析方法建立策略6杂质是指药物中存在的无治疗作用或者影响药物的稳定性、疗效，甚至对人体的健康有害的物质产品质量重点关注杂质：工艺杂质、 降解杂质安全性重点关注高毒性杂质：致癌、致突变类杂杂质中国药典、美国药典、欧洲药典、日本药典等各国

2、药典ICH Q3A(R2): 新型原料药中的杂质问题 (2006.10) ICH Q3B(R2): 新型药品中的杂质问题 (2006.06)ICH Q3C(R6):杂质：残留溶剂的指导原则 (2016.10)ICH Q3D:元素杂质的指导原则 (2014.12)ICH Q11:原料药开发和生产（化学实体和生物技术生物实体药物）(2012.05)ICH M7(R1):评估和控制药物中DNA 反应性（致突变）杂质以限制潜在的致癌风险 (2017.03)化学药品注射剂与包装材料相容性研究技术指导原则（塑料、玻璃、弹性体密封件）杂 质 研 究 相 关 法 规1.药品杂质研究的法规依据重点关注：法规适用

3、范围2.药品杂质评估一般步骤杂质引入方式限度制定已有研究的文献报道警示结构提示计算机模拟毒性评估体外点突变和染色体畸变试验动物毒性评估起始物料及其杂质溶剂及其杂质中间体反应副产物辅料杂质降解杂质生产设备引入包装材料引入环境污染引入一般杂质致癌致畸杂质PDE控制（存在报道）PDE控制 （存在报道）TTC控制ICH Q3 A/B/C/D杂质毒性分类判定致癌、致突变关于PDE法与TTC法PDE法适用于有阈值效应的遗传毒性杂质；已有证据表明，该物质只有在超过一定限度时才会产生遗传毒性。杂质安全性限度的确定可以参照残留溶剂限度的计算方法，根据相关动物的无可见效应剂量（No-Observed Effect

4、 Level）计算其可接受的日暴露量（Permissible Daily Exposure）,再根据药品的最大日剂量计算出杂质的接受限度。关于PDE法与TTC法TTC法无阈值效应的遗传毒性杂质；引入了毒理学关注的阈值（Threshold of Toxicological Concern）。TTC是在接受患者终生用药的癌症发生概率不超过10万分之一的基础上，从高浓度下进行的致癌性实验数据线性外推倒极低浓度得到的一个理论值。对于无阈值效应的遗传毒性杂质，如果每日摄入量低于1.5ug，那么患者因服药导致癌症发生的额外风险可以忽略不记。8按属性有机杂质无机杂质按来源工艺杂质降解杂质3.药品杂质来源途径

5、分析路线1 路线2 路线3溶剂1，催化剂A+BC(A)时间、温度、pH(C)SI 溶剂杂质溶剂2，试剂RI 试剂杂质DS(DS)(D1,D2)(BP1,BP2)辅料制剂(D3,D4,E11,E12,)容器中的浸出物A，B=起始物料C=中间体R=试剂/催化剂 DS=药用辅料A=潜在的起始物料杂质产生C和DSBP=反应副产物 D=降解产物 SIRI IE=溶剂杂质=试剂杂质=辅料杂质EI 辅料杂质9药品杂质来源途径分析-容器中的浸出物来源10药物杂质致癌致畸信息获取来源常见报道高毒性杂质具有警示结构杂质11药物杂质致癌致畸信息获取来源毒理学实验毒理学计算软件各类毒理学数据库已有文献报道获取TD50

6、、NOEL、ADI、PMTDINOEL值与致癌致畸没有必然联系查询的毒性研究文献全面性以及毒性实验数据的解读需要专家的确认The Carcinogenic Potency Database (CPDB)联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂专家委员会评价（JECFA）加利福尼亚州65号提案(安全饮用水和有毒物质强制法令)欧洲化学品管理局（ECHA）12常见物质的PDE数值举例在检索剂量数据前需要全面检索该物质是否有致癌致畸性，例如氯乙酸CPDB数据TD50显示阴性盐酸盐的药物在重结晶过程中的接触醇类容易产生氯代烷烃，单一卤代物在M7中有36ug/day指导规则关注环氧丙醇、环氧氯丙烷、3-氯-

7、1,2-丙二醇三者之间的转化关系毒性数据会被不断的更新，更多的研究数据会被不断的上传NameCASPDE(ug/day)Note氯甲烷74-87-31361ICH M7氯乙烷75-00-31810ICH M7氯异丙烷75-29-655500ECHA氯乙酸79-11-83000ECHA/CPDB甲醛50-00-01.35 or 10000CPDB/ICH M7乙醛75-07-0153CPDB丙二醛542-78-9122CPDB（钠盐）环氧丙醇556-52-54ICH M7环氧氯丙烷106-89-82.96CPDB（TD50）3-氯-1,2-丙二醇96-24-2PMTDI ：4ug/kg/dayW

8、HO/FAO1,3-二氯-2-丙醇96-23-110NTP13最大日剂量报告限度鉴定限度界定限度2g0.05%0.10%或1.0mg（取最小值）0.15%或1.0mg（取最小值）2g0.03%0.05%0.05%报告限度最大日剂量1g1g限 度0.1%0.05%最大日剂量10mg 2g2g鉴定限度限 度1.0%或5ug(取最小值)0.5%或20ug(取最小值)0.2%或2mg(取最小值)0.10%最大日剂量100mg2g2g界定限度限 度1.0%或50ug (取最小值)0.5%或200ug (取最小值)0.2%或3mg (取最小值)0.15%原料药Q3A药物杂质的控制限度计算（）制剂Q3B新药

9、与仿制药研究策略有显著差异限度=PDE/日最大剂量PDE=TD50*体重/50000PDE=NOEL*体重/(F1*F2*F3*F4*F5)限度=TTC/日最大剂量由ppm推算NOEL （ICH Q3C）由LD50推算NOEL其他ICHQ3&M714PDE法计算限度实例(以三乙胺浓度限度计算为例) （错误案例解析）公式1. NOEL=LD5070/2000（该公式来源于 EMEA关于清洁验证的指导原则）公式解释：NOEL（NOAEL）数据如果能直接查到就不需要计算了， 直接进入到第2个公式；其中60是指的人体平均体重为60Kg；2000 是一个安全系数。查询美国TOXNET数据库，大鼠经口的L

10、D50=460mg/Kg，则NOEL= 46070/2000=16.1 mg/Kg/day （错误推算）PDE=NOEL（mg/Kg/day）Weight Adjustment（Kg）/(F1F2F3F4F5)PDE=16.1 mg/Kg/day50Kg/(510511)=3.22mg/day浓度限度（）PDE（mg/day）/（1000dose（g/day）100对于原料药而言，dose均定为10g/day浓度限度（）=3.22/(100010) 100=0.0322%（322ppm）F1：种属之间的换算系数，代表由物种差异推导的变异系数，与体表面积相关 F1=5:从大鼠剂量推断人用剂量的系

11、数；F1=12:从小鼠剂量推断人用剂量的系数 F1=2:从狗剂量推断人用剂量的系数；F1=2.5:从兔剂量推断人用剂量的系数F1=3:从猴子剂量推断人用剂量的系数；F1=10:从其他动物剂量推断人用剂量的系数 对于三乙胺，上述LD50是以大鼠为试验得来的数据，所以F1=5。F2：代表个体间的变异系数，其值为F2=10； F3：为短期接触急性毒性研究的可变系数：F3=1，研究时间至少为动物寿命的一半（鼠、兔1年，猫、狗、猴7年） F3=1，器官形成的整个过程的生殖研究F3=2，对啮齿类动物个月研究或非啮齿类动物3-5年的研究 F3=5，对啮齿类动物个月研究或非啮齿类动物年的研究 F3=10，更短

12、时间的研究。在所有情况下，对研究时间介于上述时间点之间的研究，应用较大的系数， 如对啮齿类动物个月毒性研究，其系数用。以上大鼠经口的LD50值为急毒数据，根据欧盟数据经验，这个研究时间在3-6个月之间，因此，F3=5。F4：产生严重毒性情况的系数，如非遗传致癌毒性、神经毒性或致畸性，研究生殖毒性时，用以下系数：F4=1 与母体毒性有关的胎儿毒性; F4= 无母体毒性的胎儿毒性 F4= 受母体毒性影响的致畸反应; F4=10 无母体毒性影响的致畸反应 因为三乙胺为非严重毒性，所以这里F4=1。F5：一个可变系数，用在无毒性反应的剂量（NOEL）值时F5 = 1 for a NOEL ； F5 =

13、 1-5 for a NOAEL ；F5 = 5-10 for a LOEL；F5 = 10 for a Lowest-observed-adverse-effect level (LOAEL)因为NOEL已经确定，所以这里F5=1。当研究没有区分NOAEL和NOEL，且依据确定的PDE值选择剂量时毒性不被认为是“副作用”，则使用F5等于1，NOAEL用于多数元素的口服PDE值设定。三乙胺在ICH Q 3C中属于三类溶剂，限度： 0.515由LD50推算PDE值建议原料药工厂中清洁验证指南一文中的NOEL 的单位是mg/天，而不是上文公式中的mg/kg/天LD50计算NOEL的公式：NOEL=

14、LD5070/2000，公式中的70是欧洲人的评价体重如果需要用LD50计算NOEL用于计算PDE，推荐公式应该是NOEL=LD50/2000 （见参考文献）不推荐在基因毒物质研究中使用推荐在包材研究的剂量计算中使用参考文献： D.W. Layton;B.J. Mallon;D.H. Rosenblatt;M.J. Small Deriving allowable daily intakes for systemic toxicants lacking chronic toxicity data.Regulatory Toxicology &Pharmacology ,1987 ,7 (1)

15、:96-112药品杂质引入风险评估常见已知杂质引入途径起始物料及已知杂质中间体试剂&溶剂&催化剂反应副产物、降解杂质常见未知杂质引入途径起始物料引入未知杂质、起始物料杂质产生的杂质、生产设备引入的杂质包材浸出物杂质环境引入杂质（生产用水等）需要重点做风险评估工作17已知杂质研究策略讨论结构已知的杂质研究：起始物料及其已知杂质、中间体、试剂、反应副产物、降解产物根据工艺路线梳理出产品待研究的杂质清单进行毒性杂质评估分类：文献报道、软件预测根据各国药典及ICH Q ABC规则分别建立有关物质和溶剂残留方法建立满足专属性和灵敏度的方法（LOQ30%限度浓度），收集多批次API中目标杂质含量基于已有的

16、有关物质方法和溶剂残留方法，增加供试品浓度或改变检测器基于杂质检出情况制定杂质添加实验，考察工艺的杂质的去除能力基于杂质分类、毒性评估、产品检出情况制定方法学验证策略及产品控制策略18潜在及未知杂质研究策略讨论潜在及未知杂质来源：起始物料引入未知杂质、溶剂中杂质、包材浸出物杂质、辅料引入杂质、生产设备引入根据供应商提供的工艺路线梳理杂质清单及潜在杂质，分别对元素杂质和有机杂质进行分类研究针对元素杂质采取ICPMS全质量数扫描（69种）和 35种元素半定量扫描针对挥发及半挥发杂质采用GCMS进行全质量数扫描（谱库匹配）及半定量分析（SIM模式）针对不挥发杂质采用LCMS 或 LC-MSMS进行全

17、质量数扫描及半定量分析（SIM模式）购买疑似或近似杂质进行分析比对，确定研究目标根据杂质结构评估杂质的毒性，确定杂质的研究限度对比多批次中起始物料及其关联的原料药中杂质的检出情况根据杂质的来源风险及检出情况，制定杂质的控制策略二、痕量杂质分析方法的建立1.痕量杂质分析的挑战与目标2.基于结构特性的分析方法决策思路3.痕量分析方法建立步骤4.痕量物质定量方法的要素1.痕量杂质分析的挑战与目标痕量杂质分析的挑战含量低，选择性要求高，高灵敏度的仪器（GC-MS，LC-MSMS、ICPMS 等）杂质结构多样性和差异大，需要多种分析手段和方法样品基质复杂，需要合适的前处理方法进行分离，纯化， 富集有些杂

18、质具有“亚稳定性”的化学结构，在样品准备，制 备和分析过程中容易发生转化需要有经验的分析科学家好的分析方法简单容易操作，成本低通用性稳定性容易技术转移2.基于结构特性的分析方法决策思路易挥发分子?是GC条件稳定?否是HPLC条件稳定吗?是HPLC/UV HPLC/MS否化学衍生后引入质谱或紫外检测仪敏感基团:GC/MS, LC/UV, LC/MS等方法否HPLC条件 下稳定吗?否是碱性酸性富含杂原中性分子, 羟基,羰基,醚,酯等等富含共轭 键分子(+)电喷离 子化/质谱(-)电喷离 子化/质谱化学电离/质谱UV/质谱如不能达到检测灵敏度HS/GC/FID/MS如不能达到 检测灵敏度如不能达到

19、检测灵敏度3.痕量分析方法建立步骤色谱分离技术气相色谱液相色谱离子色谱毛细管电泳检测手段氢火焰(FID)紫外(UV)电子捕获(ECD)EI质谱(MS)ESI/APCI质谱(MS/MS)荧光检测(FLD)氮化学检测器（CND）样品制备技术直接溶解溶解后析出化学衍生法液-液萃取固相萃取选择何种组合的分析方法取决于：API性质（溶解性、化学活性）目标物性质（极性与挥发性、结构特征）检测器极限杂质溶液稳定性4.痕量物质定量方法的要素待测物限度=对照品浓度/样品浓度符合资质的对照品：适合包装、有COA有代表性的样品：中试样品、验证批次样品适合的色谱系统：各目标杂质及样品可以有效分离适合的检测器：具有高专

20、属性、高灵敏度适合的溶媒：色谱系统兼容、溶液稳定性、溶解能力具有合适的样品制备方式：直接溶解、溶解后沉淀、液液萃取、固体液萃取分析方法核心：准确度、耐用性三、案例分析与讨论5种测定甲磺酸酯分析方法比较5种测定水合肼分析方法比较3种测定氯代丙醇分析方法比较基因毒杂质开发实例甲磺酸甲酯等仪器设备样品处理及进样发生LOQ方法缺点LCMS三甲胺衍生后直接进样1 ng/ml存在基质不适用及潜在假阳性风险LC/MS/MS直接溶解进样10 ng/ml设备昂贵，不易获取GC-MS衍生后顶空进样10 ng/ml存在基质不适用及潜在假阳性风险溶解后直接进样20 ng/ml灵敏度低、基质效应强、耐用性差液液萃取后直

21、接进样20 ng/ml操作较为繁琐，局限于水溶性样品ORSOR O I+ORRSOI基因毒杂质开发实例肼常用分析方法样品处理LOQ方法缺点IC直接进样50 ng/ml设备不通用、灵敏度低 专属性差HILIC/LC/MS直接进样1 ng/ml质量数过小，方法稳定性不好LC/MS苯甲醛衍生后直接进样5 ng/ml衍生萃取操作比较繁琐LLE+GCMS苯甲醛衍生后，液液萃取后直接进样10 ng/ml衍生萃取操作比较繁琐LLE+HPLC/UV苯甲醛衍生后，液液萃取后 直接进样5 ng/ml衍生萃取操作比较繁琐HO+H2NH2NONN+H2NNH2H基因毒杂质开发实例氯代丙醇测定常用分析方法样品处理LOQ

22、方法缺点GCMS氯代丙醇直接进样30 ng/ml氯代丙醇响应低，耐用性差衍生GC/MS七氟丁酰基咪唑衍生后直接进样5 ng/ml衍生操作繁琐衍生LC/MS二甲胺衍生后直接进样1 ng/ml衍生操作繁琐制剂中两个未知杂质的分离及鉴定四、未知杂质分离鉴定案例分析项目介绍项目背景:某制剂样品在稳定性研究过程中出现的两个降解杂质色谱条件:C18,40mM磷酸盐水溶液/甲醇=23：77研究步骤:分析方法转换，置换成质谱兼容流动相液质联用分析,获取杂质分子量及获取制备中控方法制剂样品提取有效成分，利用制备液相分离杂质结构鉴定（TOF-MS、超低温探头600M 核磁）杂质定向合成赋值-QNMR（400M核磁

23、）相对校正因子测定定位MS（ESI-）分析方法转换甲醇萃取、过滤常温旋干甲 醇 复 溶、 制 备样品处理与制备分离冷冻干燥色谱定位、质谱确认分子量结合API结构推论杂质 结构通过TOFMS和核磁得到验证 杂质A：次甲基氧化生成醇杂质B：2号位甲甲基氧化成醛QNMR定量 杂质A：89.5%； 杂质B：85.6%未知杂质结构鉴定找不准研究对象选不好研究方法写不细质量标准看不懂发补意见234说不清依据缘由5管不住外包项目 6 1高比例发补的几条意见你有木有接到过这类令人心塞的发补通知？ “请结合本产品及起始原料工艺对杂质进行补充研究”“请补充提供或说明杂质检查方法与限度修改(制订)的依 据”“请使用

24、专属性更强灵敏度更高的方法对本品与原研的 杂质谱进行重新研究”1找不见研究对象选不好研究方法写不细质量标准看不懂发补意见24说不清依据缘由5管不住外包项目 6 31杂质研究有关物质检查！1有关物质起始原料中间体、副产物 异构体和聚合物 多晶型降解产物异构体和聚合物 多晶型3外源污染物微生物微粒物质-农药残留非法添加物2无关杂质试剂配位体、无机盐、溶剂重金属催化剂过滤介质、活性炭-酶残留重组人生长激素红霉素/麦迪霉素硫酸鱼精蛋白/肝素钠阿奇霉素/右旋糖酐铁三唑仑/七氟烷/十一烯酸重组发酵提取半合成合成更有新型生物技术/细胞产品多、全大、杂农药残留菌体蛋白残留酶培养液杂质元素（重金属）杂质1类金属

25、杂质（原料药）- 1A （ Pt、Pd ）- 1B（Ir、Rh、Ru、Os）- 1C（Mo、Ni、Cr、V）修订通则新增方法2341农药残留量测定法本方法为质谱法（通则0431）测定中药材中的农药残留量。 气相色谱串联质谱法 液相色谱串联质谱法提供了多品种通用的色谱及质谱条件仅仅中药材有 农药残留问题？各国药典列出的杂质与你产品的关系？曾见到有企业CTD格式申报资料中杂质分析章节 让人不知所云的神段子：国内标准目前未收载指定相关杂质，USP中收载有3个杂质，EP中收载有5个特定杂质，其中2个与USP不同，国内可以购买到EP的5种杂质对照品。呃.我弱弱的问您一句您想说什么？“请结合本产品及起始原

26、料工艺对杂 质进行补充研究”杂质研究怎样突出自己特色？中间体副产物A+BC;C+DEA+BCA+BC以合成路线为线索，顺藤摸瓜列表 自家工艺杂质！理论分析与实验数据相结合！ 以终为始确定重点！- 物料残留（反应物，试剂，溶剂，催化剂）A（1mol）+B（2mol）C（1mol）+B（1mol）列表自家产品中所有潜在杂质并分析来龙去脉杂质名称 引入点 去除方式 监控方法 预估量 属性A 合成第一步 反应完全TLC 检测限 工艺杂质过程中检测以下 起始原料B合成第一步水洗3次 uv 检测限 工艺杂质过程中检测以下起始原料合成第二步完C合成第一步 HPLC 工艺杂质全过程中检测中间体B合成第一步反应

27、结束或水洗工艺杂质 原料引入CChp.和USP中的杂质1合成第一步合成第二步HPLC过程中检测+终产品标准中检查工艺杂质 副产物/ 热降解物“请结合本产品及起始原料工艺对杂质进行补充研究”1找不准研究对象选不好研究方法写不细质量标准看不懂发补意见24说不清依据缘由 5管不住外包项目 631检测的方法因杂而异原研标准EP7.0USP34JP15杂质谱研究梯度洗脱色谱条件 210nm 254nm双波长检测梯度洗脱色谱条件 210nm 254nm双波长检测梯度洗脱色谱条件 210nm 254nm双波长检测等度洗脱色谱条件 210nm 检测等度洗脱色谱条件210nm单波长检测“请使用专属性更强灵敏度更

28、高的方法对本品与原研的杂质谱进行重新研究”杂质与主成分结构性质差异很大 国外使用TLC补充检测怎么判定你所用的方法不够好？-根据文献怎么判定你所用的方法不够好？-根据试验物质平衡考察/灵敏度试验/专属性试验有否漏检杂质 有否需校正杂质 需否补充方法根据组成根据结构根据性质/需求/法规怎么判定你所用的方法不够好？-综合分析举一反三触类旁通2015年版药典注射剂通则整合后补充的这 个项目给你什么提示？通则中新增的仪器与技术通则0412电感耦合等离子体质谱法重金属及有害元素山楂照铅、镉、砷、汞、铜测定法（通则2321原子吸收分光光度法或电感耦合等离子体质 谱法）测定，铅不得过5mg/kg;镉不得过0

29、. 3mg/kg;砷 不得过2mg/kg；汞不得过 0.2mg/kg；铜不得过 20mg/kg。中药注射剂已经在精密测定按日服药量限定 金属杂质，连化妆品都开始用ICP-MS检测 铅汞砷镉喽！而化药的静脉注射剂重金属就 一直用目视判断总量粗测？！重金属杂质监控是不是该升升级啦？新增通则中涉及的仪器与技术通则0531超临界流体色谱法supercritical fluid chromatography,SFC超临界流体色谱仪很多部件类似髙效液相色谱仪以超临界流体作为流动相。分析速度比HPLC提高3-10倍，溶剂成本是HPLC的1/3- 1/40，除可连接UV,DAD以及MS检测器外还可以连接气相的

30、FID检测器对手性化合物具有更好的分离能力新增通则中涉及的仪器与技术0532临界点色谱法LiquidChromatographyatCriticalCondition，LCCC仪器同HPLC当使用多孔填充材料作为固定相时，分子排阻色谱（Size exclusionchromatography，SEC）和相互作用色谱（Interactionchromatography，IC）的分离机制在分离聚合物 时同时发生作用。在某个特殊色谱条件（固定相、流动相的组成、 温度）下，存在两种分离机制的临界点，被称为焓熵互补点或色 谱临界条件（critical conditions）或临界吸附点（critical

31、 adsorptionpoint，CAP）。是对聚合物进行分离的一种色谱技术。与时俱进实事求是接轨国际体现特色 整体着眼细节入手1找不准研究对象选不对研究方法写不好质量标准看不懂发补意见23 4说不清依据缘由5管不住外包项目 6质控标准/方法与质量的关系美女与旗袍肥肥与束身衣需要严控的毒性杂质可以宽管的有效杂质校正因子差异大的杂质以及你想重点精密管控的杂质！结合试验结果写好标准溶剂选择的依据8小时标准中一般不需提示4小时需提示“临用现配”或“立即进样”2小时改换溶剂或明确给出“该溶液配制后应在1小时内使用”采用外标法时，通常取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，RSD2.0在质量标准中如果没有明确规定，就是2.0 注意：不要自己难为自己哦！应给予微量物质检测较宽松的指标！特别是在定量限附近时！ 要连续进样不