毕业论文-长非编码RNA的作用

1、- -殖细胞系衍生物的潜能。在哺乳动物胚胎发育的过程中，多数性仅限于胚胎细胞，到囊胚期时只有少数细胞组成的短暂存在的内细胞团具有多能性，在原长胚形成及随后的胚胎发育中逐渐失去多能性并获得特异性。1.2 长非编码区RNAZRANB2-AS2结构与功能的预测过程简介本文研究的是长非编码RNA ZRANB2-AS2结构与功能的预测。首先在NONCODE数据库中找到lncRNA ZRANB2-AS2转录本的表达谱共16个，由于到后续三级结构分析的长度限制（小于500nt),故在16个转录本中选择了满足其条件的NONHSAT003891转录本，然后在RNAfold中进行二级分析，然后在Composer数

2、据库中预测出三级结构并对其进行分析，然后再通过starBase找到与之相互作用的蛋白，然后通过RCSB获得相互作用蛋白的三维结构图。再通过NPDock结合protein-RNA的CLIP-Seq数据结果通过分子对接预测ZRANB2-AS2与相关蛋白可能的相互作用模式。最后，整合数据库资源分析ZRANB2-AS2的潜在功能分析。1.3 本课题研究的意义首先，最近的转录组研究透露大约人类3/4基因有转录能力的，但蛋白质编码区仅仅占基因的2%，所以绝大多数的转录序列都没有编码成蛋白质，这些RNA就叫做非编码区RNA,其中长度大于200nt的就是长非编码RNA。积累的证据表明lncRNA在多方面生物进

3、程中充当着关键的角色。如印迹控制，电路系统控制的潜能性和变异，免疫应答和染色体动力学。LncRNA与编码区RNA对于细胞的结合同等重要。其次，高通量测序方法的发展已经减少了RNA测序的开销，因此新定义的lncRNA带来了爆炸式的增长，也给对lncRNA的研究提供了很多基础。第三，癌症已成为目前威胁人类健康和生命的重要疾病之一，研究癌症的分子机制，探索新型肿瘤标志物是目前本领域的研究热点之一。并且近年来大量的研究已经证实，ncRNA具有重要的生物学功能。所以对长非编码区RNA结构和功能的计算研究是很有必要的。2 材料与方法2.1 材料2.1.1 数据来源ZRANB2-AS2，相互作用的蛋白，数据

4、库中的蛋白2.1.2 相关分析工具及平台1）NONCODE。NONCODE是一个致力于非编码区的RNA的综合信息数据库（不包括tRNA和rRNAs）现在在NONCODE中有16个物种（人，鼠，奶牛，鸡类，果蝇，斑马鱼，线虫等)网站： HYPERLINK 2）RNAfold web server:预测单链RNA和DNA序列的二级结构，目前限流是7500nt分区函数的计算和10000碱基最小自由能的唯一预测网站。网址: http:/rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi 3）RNAComposer:对三维RNA结构的了解是生物分子研

5、究的各个领域关键作为对实验研究的补充,在世界各地的几个实验室发展了新的计算方法,以预测和模拟第三代RNA结构。该平台提供了一个新的用户友好的rnacomposer接近全自动大型RNA三维结构预测。方法是基于机器翻译的原理和操作上的RNA frabase数据库作为有关RNA二级结构和三级结构元素的数据库。网址： HYPERLINK http:/rnacomposer.cs.put.poznan.pl http:/rnacomposer.cs.put.poznan.pl4）starBase：是预测长非编码区RNA，miRNA,ceRNA的相互作用网络的数据库，MicroRNA、竞争性内源RNA (

6、 cernas )、RNA结合蛋白(限制性商业惯例)和mrna的大规模剪辑(支安打、par、iclip、碰撞)数据和肿瘤样本的相互作用网络( 14种癌症类型, 6000个样本)；StarBase同时还发展用于解释蛋白质- RNA和mirna-靶相互作用,如蛋白质lncrna、蛋白质sncrna、蛋白质mrna、蛋白质假基因、微小RNA、微小RNA、微小RNA、微小RNA、微小RNA相互作用和采尔纳网络,从108个片段数据集；并且StarBase提供了mirfunction和cernafunction的web工具来预测微小RNA (采尔纳)调控网络中ncrnas ( MicroRNA、lncrn

7、as、pseduogenes)和蛋白质编码基因的功能。5）RCSB PDB:这个资源来源于蛋白质数据银行储存关于蛋白质，核酸，等复杂元件的三维结构，从而帮助学生和研究人员从健康和疾病的蛋白质合成上了解生物医学和农学的方方面面。RCSB PDB的数据建立在创建工具和资源研究以及在分子生物学，结构生物学，计算生物学的基础上，甚至超越。目前该网站支持3D结构的可视化，选择4中模式任一种方式(NGL,PV,Jmol,protein,Workshop)这四种模式提供不同的方式和分析方法来展示3D结构。网址： HYPERLINK / /6）Cytoscape软件：cytoscape是一个开源的软件平台，用

8、于图形化显示蛋白质互作网络数据并进行分析和编辑。它支持多种网络描述格式，也可以用以Tab制表符分隔的文本文档或Microsoft Excel文件作为输入，或者利用软件本身的编辑器模板直接构建网络，它还能为网络添加丰富的注释信息，并且可以利用自身以及第三方开发的大量的功能插件，针对网络问题进行深入分析，它是根据基础的数据构建可视化的网络，因子，分子，蛋白质用点表示，而两点间的相互作用则用边来表示。本实验是通过与长非编码区RNA ZRANB2-AS2相互作用的蛋白作为RNA来找出与之相互作用的蛋白，进而构建相互作用的蛋白与长非编码区RNAZRANB2-AS2相互作用的关系网络图。2.2 方法2.2

9、.1 长非编码RNA ZRANB2-AS2的选取（1）进入NONCODE网站主界面，在搜索框中检索ZRANB2-AS2（2）点击“search”，进行搜索，将得到16个转录本从中选择了长度小于500nt转录本进行后续具体分析，选择的是NONHSAT0038912.2.2 长非编码区RNA ZRANB2-AS2二级结构的分析（1）进入RNAfoldWebServer网站，在“paste or type your sequence here”下面直接粘贴要分析的NONHSAT003891序列，其他选项保持不变，由于有些电脑受到网速的限制分析时间过长，可以输入自己的邮箱地址，分析完后网站会发邮件，点

10、击proceed建进行二级结构的分析。（2）得到结构分析后，在二级结构下方中Vienna Format单击右键从链接另存文件到记事本，保存二级结构用来分析三级结构。2.2.3 长非编码区RNA ZRANB2-AS2三级结构的分析进入RNAcomposer网站（Popenda, M., Szachniuk, M., Antczak, M., Purzycka, K.J., Lukasiak, P., Bartol, N., Blazewicz, J., Adamiak, R.W. Automated 3D structure composition for large RNAs,Nucleic

11、Acids Research,2012, 40(14):e112 (doi: HYPERLINK /content/40/14/e112 10.1093/nar/gks339).在you are in interactive mode中Load example的三个例子中任选一个将2.1.2中获得的二级结构替换例子中的二级结构，其余不变。（2）选择右下角的“Email results to”选项，填入用来接收三级结构的邮箱，单击compose。（3）程序开始运行，运行的结果将会发至邮箱，然后将邮箱的三级结构保存到自己论文文件夹即可。2.2.4 RNA ZRANB2-AS2相互作用蛋白的获取（1

12、）进入starbase数据库，选择Protein-LncRNA interaction 界面（2）然后在“clade”、”genome”、“assembly”选择填入”Mammal”human”,”hg19”,接着在lncRNA Gene symbol “填入“ZRANB2-AS2”,单击search，得到与之相互作用的蛋白。（3）进入RCSB PDB 网站在GO中输入要查找的蛋白质，然后运行程序，得到相关蛋白的三维结构，并保存在选择好的文件夹中的。（4）安装查看蛋白质三维结构的软件，安装顺序是python-2.7.8 - numpy-1.9.0-win32-superpack-python2

13、.7-biopython-1.62.win32-py2.7-pymol-.win32-py2.7.exe，pymol用于查看三维结构。2.2.5 ZRANB2-AS2与相关蛋白分子对接的预测（1）在NPDock中点击“submit your job”进入与RNA相互作用的蛋白界面，在NPDock界面，在submit中输入相关的信息，“job title ”，“E-mail address”中输入项目的标题和接受结果的邮箱地址（可以用自己的邮箱）（2）选择“docking”栏，在下拉栏中选择我们所需要的“RNA-protein”接着在“protein”中选择我们保存的蛋白的pdb格式，在“RNA

14、”中选择保存的RNA三级结构pdb格式，然后其余默认。（3）然后点击submit提交，即可让程序运行，提交结果后以邮件的形式发到你之前保存的邮箱。2.2.6 预测GNG12-AS1可能存在的潜在功能，并利用Cytoscape软件建立相互作用的关系网络图（1）进入starBase数据库（HYPERLINK / /）中的miRNA-mRNA中选择miRNA-target intersections进入界面；（2）进入miRNA-target intersections界面后，在“Gene Symbol”中输入与GNG12-AS1相互作用的蛋白，以此蛋白作为RNA的名称，然后单击“search”寻找

15、与之相互作用的蛋白；（3）利用Cytoscape软件建立蛋白-RNA-GNG12-AS1相互作用的功能网络图。3结果3.1 ZRANB2-AS2转录本表达谱的分析长非编码区RNA ZRANB2-AS2转录本具有16个，由于后续三级结构的分析受到了长度的限制（小于500nt），所以从16个转录本中选择了NONHSAT003891.2来进行分析。图3.1 选取的NONHSAT003891.2转录本图3.2 NONHSAT003891.2转录本从该转录本的表达谱中我们可以看出是通过FPKM值来反映该RNA表达的程度。FPKM值反映的是每1百万个map上的reads中map到外显子的每1K个碱基上的r

16、eads个数。假如有1百万个reads映射到了人的基因组上，那么具体到每个外显子呢，有多少映射上了呢，而外显子的长度不一，那么每1K个碱基上又有多少reads映射上了呢，这就是对FPKM值的直观解释。该表达谱在脂肪，肾上腺，大脑，大肠，包皮，心脏，HLF-1,HLF-2,肾脏，肝脏，淋巴结，胎盘，中均未表达，而在大脑，胸腺，肺，前列腺，睾丸，甲状软骨，白细胞中均有表达（即外显子的映射）其中在胸腺中FPKM值最大。3.2 ZRANB2-AS2转录本的分析cagagtttcgctctttttgaccaagctggagtgcaatggcgtgatctcggctcgctgcaatctctgccttcc

17、aggttcaagtgattctcctgcctcagccttctgagtagttgggattacagGTGGCTTTTCTACAATATAAAGATGGAAATGGGAAGAAGATGTTCATTGCAAATTAAGGAAGCTCTTCCACGAGTTCACGAATGGAAATAACATCAAGAGTTTTTCATCTTCTTAGTGTGCAAGGTA3.3 ZRANB2-AS2的NONHSAT003891.2的二级结构的分析从上个步骤中获得的二级结构，然后用RNA FOld Webserver网站获取二级结构，然后对其分析。3.3.1 最小自由能的预测结果最佳的二级结构dot-bracket

18、符号自由能最小为58.60千卡/摩尔，如图所示。其中颜色表示碱基互补配对的概率，如图所示。1 CAGAGUUUCGCUCUUUUUGACCAAGCUGGAGUGCAAUGGCGUGAUCUCGGCUCGCUGCAAUCUCUGCCUUCCAGGUUCAAGUGAUUCUCCUGCCUCAGCCUUCUGAGUAGUUGGGAUUACAGGUGGCUUUUCUACAAUAUAAAGAUGGAAAUGGGAAGAA160 GAUGUUCAUUGCAAAUUAAGGAAGCUCUUCCACGAGUUCACGAAUGGAAAUAACAUCAAGAGUUUUUCAUCUUCUUAGUGUGCAAGGUA

19、1 .(.)(.(.(.().).).).(.(.().).).(.(.(.(160 (.(.(.().).).).).).无任何颜色的版本如图所示1 CAGAGUUUCGCUCUUUUUGACCAAGCUGGAGUGCAAUGGCGUGAUCUCGGCUCGCUGCAAUCUCUGCCUUCCAGGUUCAAGUGAUUCUCCUGCCUCAGCCUUCUGAGUAGUUGGGAUUACAGGUGGCUUUUCUACAAUAUAAAGAUGGAAAUGGGAAGAA160 GAUGUUCAUUGCAAAUUAAGGAAGCUCUUCCACGAGUUCACGAAUGGAAAUAACAUCAAG

20、AGUUUUUCAUCUUCUUAGUGUGCAAGGUA1 .(.)(.(.(.().).).).(.(.().).).(.(.(.(160 (.(.(.().).).).).).我们将维也纳格式保存下来，以备之后的三级结构使用。3.3.2 总热力学的预测结果总热力学自由能63.78千卡/摩尔，MFE结构的频率是0.02%，总差异是56.59，下面给出的是最小自由能51.60千卡每摩尔的中心二级结构的中心结构。其中颜色表示碱基互补的概率，如图所示。 1CAGAGUUUCGCUCUUUUUGACCAAGCUGGAGUGCAAUGGCGUGAUCUCGGCUCGCUGCAAUCUCUGCCUUC

21、CAGGUUCAAGUGAUUCUCCUGCCUCAGCCUUCUGAGUAGUUGGGAUUACAGGUGGCUUUUCUACAAUAUAAAGAUGGAAAUGGGAAGAA160 GAUGUUCAUUGCAAAUUAAGGAAGCUCUUCCACGAGUUCACGAAUGGAAAUAACAUCAAGAGUUUUUCAUCUUCUUAGUGUGCAAGGUA1 .(.)(.(.(.().).).)(.(.().)(.(.(.(160 (.().).).).).无任何颜色的版本如图所示：1 CAGAGUUUCGCUCUUUUUGACCAAGCUGGAGUGCAAUGGCGUGAUCUCGGC

22、UCGCUGCAAUCUCUGCCUUCCAGGUUCAAGUGAUUCUCCUGCCUCAGCCUUCUGAGUAGUUGGGAUUACAGGUGGCUUUUCUACAAUAUAAAGAUGGAAAUGGGAAGAA160 GAUGUUCAUUGCAAAUUAAGGAAGCUCUUCCACGAGUUCACGAAUGGAAAUAACAUCAAGAGUUUUUCAUCUUCUUAGUGUGCAAGGUA1 .(.)(.(.(.().).).)(.(.().)(.(.(.(160 (.().).).).).3.3.3 图像输出 图3.3a MFE二级结构 图3.3b 质心结构MFE结构表示的是最小

23、自由能的结果，质心结构是用来比较预测的RNA茎区的集合，还可以预测假结的位置，图中颜色越偏像红色的表明碱基处于配对的概率越大。这里用峰状图来代表MFE结构图，RNA热力学结构图，和图心图。关于碱基配对的概率。下面的结构为碱基配对的概率，未配对地区的颜色表示未配对的概率。图3.4 碱基配对的概率3.3 ZRANB2-AS2三级结构的分析通过RNA Composer 网站来对三级结构进行检索，但是三级结构图的查看必须在安装了pymol软件的情况下才能看到，结果如图3.5所示，图3.5 ZRANB2-AS2三级结构图3.4 与ZRANB2-AS2相互作用蛋白的分子获取及分子对接的预测3.4.1 与Z

24、RANB2-AS2相互作用的蛋白本文采用的是starBase平台对ZRANB2-AS2蛋白的预测，预测结果如图3.6.图3.6 与ZRANB2-AS2相互作用的蛋白然后通过网站RCSB PDB,对这四种相互作用的蛋白的三级结构进行搜索，由于每种蛋白结构在许多文章中都有采用，所以我们选择其中一种蛋白进行分子对接。1）IGF2BP3蛋白本（选择的其中一种蛋白本) 2）FUS蛋白本 图3.7 IGF2BP3蛋白本（选择的其中一种蛋白本) 图3.8 FUS蛋白本3）U2AF65蛋白本 4） TIAL1 蛋白本 图3.9 U2AF65蛋白本 图3.10 TIAL1 蛋白本3.4.2结合protein-R

25、NA的CLIP-Seq数据结果通过分子对接预测ZRANB2-AS2与相关蛋白可能的相互作用模式，分别是以下四种相互作用的模式图,其中，ZRANB2-AS2 RNA三级结构与这四种蛋白对接相互作用，其对接的编号对应分别是：1）IGF2BP3对应2e44 2）FUS对应21a6 图3.11 IGF2BP3对应2e44 图3.12 FUS对应21a63）U2AF65对应5EV1 4）TIAL1对应1x4g 图3.13 U2AF65对应5EV1 图3.14 TIAL1对应1x4g5）IGF2BP3与ZRANB2-AS2相互作用的MC评分 6)FUS蛋白本与ZRANB2-AS2相互作用的MC评分图3.1

26、5 IGF2BP3与ZRANB2-AS2相互作用的MC评分 图3.16 FUS蛋白本与ZRANB2-AS2相互作用的MC评分7）U2AF65与ZRANB2-AS2相互作用的MC评分 8）TIAL1与ZRANB2-AS2相互作用的MC评分图3.17 U2AF65与ZRANB2-AS2相互作用的MC评分 图3.18 TIAL1与ZRANB2-AS2相互作用的MC评分3.5 ZRANB2-AS2功能网络的构建对ZRANB2-AS2相互作用的蛋白作为其调控的上游RNA，与之相互作用的MiRNA，在StarBase中，选用miRNA-mRNA中miRNA-Target来匹配到与之相互作用的miRNA，构

27、建一个miRNA-蛋白ZRANB2-AS2的相互关系网络图，在StarBase中我们筛选出分别与IGF2BP3、FUS、U2AF65、TIAL1相互作用的miRNA,结果如下图3.19所示。与IGF2BP3相互作用的miRNA情况如下所示：图3.19 IGF2BP3相互作用的miRNA与FUS相互作用的miRNA情况如下所示：图3.20FUS相互作用的miRNA与U2AF65相互作用的miRNA情况如下所示：图3.21 U2AF65相互作用的miRNA与U2AF65相互作用的miRNA情况如下所示：图3.22U2AF65相互作用的miRNA以上是四种mRNA与相应的miRNA相互作用的情况，据

28、此我们可以构建相互的功能网络图，由前面我们已经得到长非编码RNA ZRANB2-AS2与之相互作用的蛋白IGF2BP3、FUS、 U2AF65、TIAL1 具有相互作用关系，在StarBase平台上我们也得到了以各种蛋白作为RNA并与之相互作用的miRNA，由此我们可以构建miRNA-蛋白- ZRANB2-AS2相互作用的功能网络图，来清晰展示其相互作用关系，有利于我们从各节点，各条关系中任意找出相互作用连线，对于我们以后的各种miRNA参与怎样的调控途径有较清晰的了解，同时对于同一种miRNA可能参与不同的调控途径也提供了很好的借鉴，功能网络图如下所示：图3.23 ZRANB-AS2的功能网

29、络图在Cytoscape 软件中通过将上述相互作用关系的miRNA、mRNA与ZRANB2-AS2文本导入后，对于任何一种相互作用关系的节点我们都可以清晰找出，对于ZRANB2-AS2相互作用的miRNA我们也通过软件得出，于是我们发现与ZRANB2-AS2相互作用的miRNA同样的会与编码与ZRANB2-AS2相互蛋白的mRNA相互作用，至于对于这些蛋白的表达量是促进还是抑制，需要我们进一步去探索与进一步挖掘。4 讨论与总结本实验是在阅读大量文献资料的基础上，所进行的对于当前生物学领域新兴起的对于长非编码RNA的一项探索实验；本研究在众多分析软件的帮助下，通过查找文献资料针对人类长非编码RN

30、A ZRANB2-AS2进行研究的一项具有深刻指导作用的研究。通过软件分析我们得到了ZRANB2-AS2具有多个转录谱，本实验选择了转录本NONHSAT003891进行研究，为了后续三级结构及相互作用，本研究选择了500nt的序列进行进一步的分析，在RNAfold Webserver对序列进行二级结构的预测，从而得到其二级结构；得到其二级结构后，我们又利用RNAComposer软件通过二级结构预测到了其三级结构；其三级结构由于链是单链，所以在有些碱基之间的相互作用力下，形成了一定的空间结构。然后，本研究旨在研究长非编码RNA与蛋白是怎么一种作用方式，于是本研究通过StarBase软件预测了与Z

31、RANB2-AS2相互作用的蛋白，并对进一步分析与蛋白的分子对接打下了基础，在RCSB PDB得到与各个蛋白相互作用的蛋白的后，对得到的蛋白与ZRANB2-AS2相互作用的蛋白分析得出，这些蛋白哪些链在其中发挥作用，并通过PyMol软件将这些蛋白相互作用相关的链分离出，这也大大降低了我们对于分子对接结果的得到。将这些分离出的肽链与GNG12-AS1的三维结构提交到NPDock中得到分子对接的结果，并且也得到了MC评分，通过用MC细化na，仿真步骤的数量定义了模拟的长度。长时间的模拟允许分子移出局部极小值，并允许更广泛的采样的构象景观。从而可以让我们在MC评分中找到最佳模型的位置，帮助我们分析蛋白和RNA相互作用的哪些位置可能是最佳的位置，便于我们进一步分析出哪些基团在其中发挥着作用，为我们提供了很好的参照。在获得最佳作用模式与蛋白和RNA的MC评分。对于各种相互作用的蛋白和RNA我们已经有了较深的理解。为了进一步分析出这些