骨髓间质干细胞与Ⅱ型胶原修饰的 PLGA黏附性的观察

1、骨髓间质干细胞与型胶原修饰的 PLGA黏附性的观察【关键词】骨髓间质干细胞PLGA组织工程Keyrds：bnearresenhyalsteell;PLGA;tissueengineering组织工程修复受损组织的根本方法就是将种子细胞种植于生物支架材料上，经体外培养一定时间后再植入体内到达修复和重建受损组织的目的，所以细胞与生物支架材料的黏附性就成了构建组织工程化组织和器官的关键问题之一。本研究将体外提纯，扩增的BSs种植到经型胶原修饰的PLGA材料上结合培养，扫描电镜观察其黏附情况，观察型胶原修饰的PLGA材料的细胞亲和性，探究以BS为种子细胞，以型胶原修饰的PLGA为生物支架材料构建组织工

2、程的可行性，为临床组织工程的应用研究提供理论和实验数据。1材料和方法1.1材料和仪器SD大鼠(广东省动物中心)；PLGA(济南迈康公司，分子量10万单位)；胎牛血清(FBS)、淋巴细胞别离液(天津TBD公司)；DE(Dulbediniuessentialediu)干粉培养基、胰蛋白酶、型胶原(Siga公司)；流式细胞仪FASAria(美国BD公司)；D29FIT、D44FIT、D106PE、D34PE和D45FIT(Anell公司)；PI(Siga公司)；扫描电镜(日立公司，日本)。1.2PLGA的制备合成及扫描电镜观察7025的PLGA溶解于二氧六环匀速搅拌3h，溶液浇铸平皿上，-20放置过

3、夜，放入质量比为3070的酒精溶液中萃取8h，连续3次，将结块样品放入真空机冷冻枯燥。制备成10105大小的样品，将上述得到的样品10个放入含5g型胶原的5lPBS溶液中振荡混合1h，入真空机冷冻枯燥。质量法测定其孔隙率1。取小块PLGA材料，固定于2的戊二醛24h，0.1l/LPBS(pH7.2)洗3次，不同梯度酒精逐级枯燥，样品镀金，电镜扫描。1.3BSs的体外培养1个月龄SD大鼠，脱颈处死，取双侧股骨，剔净软组织，75酒精浸泡消毒5in，PBS洗2次，剪断股骨一端后，用带5号针头的注射器将体积分数为10胎牛血清的DE(含100Ul青霉素、100gl链霉素和20Ul肝素)冲洗股骨骨髓腔，取

4、混合骨髓液4l缓慢注入事先准备好的含6l的淋巴细胞别离液的离心管内，800g离心20in，取出中间层的单核细胞接种于252培养瓶，37、52培养箱静置培养。5d后首次换液，以后每隔3d换液，长满后传代，取P3细胞进展实验。1.4BSs的形态学观察原代及传代培养的细胞，用倒置相差显微镜逐日观察细胞生长、增殖情况及形态特征。1.5BSs的鉴定FAS检测BSs的外表抗原，将对数生长期的P细胞消化别离(37，35in)，搜集细胞制成1106个细胞l的细胞悬液。参加500l适当稀释度的FIT标记抗人D29、D44、D45单克隆抗体，PE标记抗人D34和D106单克隆抗体，反响30in后检测。1.6BSs

5、的生长曲线，细胞周期及活力的检测取P1、P3、P5的细胞以104个细胞l接种于24孔培养板内，每天同一时间消化3孔计数，连续计数8d绘制生长曲线。搜集P3细胞，制成1106个细胞l的细胞悬液，FAS对BSs的细胞活力和细胞周期进展检测。1.7BSs与型胶原修饰的PLGA复合取P3细胞，调整浓度为106个细胞l。已制作好的支架材料经60消毒后用无菌DE培养基反复冲洗，培养箱内晾干，把PLGA放于24孔板的孔底，滴加100l的细胞悬液，培养1h后翻转，再在另一面滴加100l细胞悬液，培养1h后加培养基吞没整个基质材料，每周换液2次，体外培养2周，分别在复合后1、7、14d取材，作扫描电镜观察。2结

6、果2.1型胶原修饰的PLGA扫描电镜观察合成的复合PLGA为多孔的三维立体构造，电镜扫描可见：PLGA内部形成大小不一的大孔和互连的小孔，彼此互相交通，支架四处均可见白色的微小型胶原颗粒(图1)。应用质量法测得的孔隙率为90，孔径在50200之间，平均孔径为100。2.2BSs形态学观察原代细胞的观察：刚接种的细胞呈球形悬浮于培养液中，810h开场逐渐沉降贴壁，48h少数贴壁细胞呈成纤维细胞样外形，35d贴壁细胞开场增殖呈克隆生长，57d后局部细胞成细胞团簇，细胞多为梭形，胞核明显为卵圆形或圆形。可见13个核仁，胞质丰富、胞浆明晰。原代培养12d可长满瓶底。培养液中的渣滓随换液被逐渐去除。转贴

7、于论文联盟.ll.传代细胞的观察：传代后的细胞增殖迅速，24h开场贴壁，68h贴壁根本完全，于3d细胞数量开场明显增多，56d可长满瓶底，交融成片状，细胞排列更加整齐，细胞均匀分布，生长较均匀一致，杂细胞已较少(图2)。传6代以上的细胞可见胞体增大，胞质稀薄，细胞的增殖速度较以前已有所减慢。传至910代细胞已出现衰老死亡现象。2.3BSs鉴定流式细胞外表抗原标志，D29表达为97.98，D106表达为63.38，D44表达为52.61，D34表达为0.66，D45表达为0.57(图3a、b、)。2.4BSs生长曲线，细胞周期及活力的检测2.4.1生长曲线P1、P3、P5BSs在接种的01d细胞

8、处于埋伏期，2d细胞开场增殖，3d进入快速生长期，从5d开场进入平台期(图4)。2.5BSs与型胶原修饰的PLGA复合及增殖扫描电镜观察发现BSs复合到型胶原修饰的PLGA支架后2d，即在PLGA基质材料上黏附和伸展，呈成纤维样细胞。7d时细胞数量已明显增多，与支架材料结合较严密(图7)。14d时，细胞增殖，互相间交融，并有大量的细胞外基质分泌，大局部材料颗粒被覆盖(图8、9)。3讨论BSs是一种存在于骨髓网状间质内的非造血干细胞，具有分化成各种间叶组织的功能。近年来研究说明BSs体外别离培养后，在一定的诱导条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、脂肪细胞、心肌细胞、肝细胞等定向分化的才能7

9、，BSs为贴壁细胞，它外表标志并非单一性，它表达间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的外表标志，BSs可以不断自我复制而不分化，在其增殖分化过程中外表标志不断变化。一般认为整合素家族成员D29,黏附分子D44,D106等是BSs保持未分化状态时较为特异性的外表标志8，虽然BSs与造血细胞共同存在于骨髓中，但不表达造血系统的标志，如D14、D34及白细胞共同抗原D45。本实验从骨髓中别离贴壁生长的BSs,流式细胞仪分析第4代BSs强表达D29，表达D44和D106，而不表达D34、D45，证实其为BSs应用单核细胞别离液从骨髓中别离贴壁生长的BSs是一种经济、简单、有效的别离方法。本实验中别离所得的BS

10、s在低糖DE培养基中扩增较迅速，具有较强的增殖才能，体外培养至第8代仍保持未分化状态，为体外组织工程成骨提供了足够的准备时间。BSs作为骨组织工程中首选的种子细胞，具有取材方便，增殖才能、成骨才能强9，免疫原性弱10，11，基因容易导入等优点，在目前骨组织工程中应用非常普遍12。细胞与基质材料的互相作用也是组织工程研究的主要领域，其中细胞与材料的黏附是根底，细胞必须与材料发生适当的黏附，才能进展迁移、增殖和分化。实验结果说明：BSs接种到支架材料上后24h就已贴附、伸展。本实验通过扫描电镜观察发现：复合PLGA支架上的BSs在3d已结实地附着于材料外表，分泌胞外基质，至复合后14d，BSs增殖明显，细胞和分泌的胞外基质已覆盖材料大局部颗粒，提示BSs复合于PLGA后，其黏附、增殖和分化特性未受明显影响。综上所述，本实验采用相别离法合成PLGA，经型胶原修饰后其大体形态、微构造等方面都令人满意。BSs在体外复合PLGA后，通过形态学观察，发现BSs可