荧光PCR原理和污染处理课件

1、 荧光定量PCR检测原理 和污染的处理 主讲人：卫明 主讲单位：深圳匹基生物股份有限公司深圳匹基生物股份公司技术支持部第一部分荧光PCR技术的原理、特点和定量方法荧光标记信号的产生荧光标记基团在某波长的激发光刺激下，产生一个更长波长的发射光深圳匹基生物股份公司技术支持部FRET某荧光标记基团在激发光刺激下生成某波长的发射光，当另一屏蔽基团与其距离合适时，原发射光将会被屏蔽基团所吸收，并转化为其他波长的发射光或热能，称之为FRET。深圳匹基生物股份公司技术支持部TaqMan荧光探针的原理PCR扩增体系中加入一个特异性的寡核苷酸荧光探针，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，

2、报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。深圳匹基生物股份公司技术支持部阳性标本扩增曲线 阴性标本扩增曲线典型的荧光PCR扩增曲线深圳匹基生物股份公司技术支持部 荧光阈值（threshold ）：荧光本底 设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的默认设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍Ct值C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每

3、个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如下图所示）。与结果分析相关的两个重要名词：荧光阈值与Ct值深圳匹基生物股份公司技术支持部PCR荧光试剂标准品扩增曲线（仪器：Bio-rad iCycler）1x108 拷贝/ml1x107 拷贝/ml1x106 拷贝/ml1x105 拷贝/ml1x104 拷贝/ml深圳匹基生物股份公司技术支持部定量原理和方法原理：每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。外标法：将几个已知拷贝数的纯化的目的基因标准品进行FQ-PCR 扩增，绘制荧光定量标准曲线。内

4、标法：将已知浓度的内标基因加到各标本中，与标本一起经历核酸提取、加样、逆转录、PCR扩增及信号检测的全过程，比较内标最后的实测值与已知值，以检验标本中是否存在抑制PCR的因素，也可对样品的拷贝数加以校正。 深圳匹基生物股份公司技术支持部荧光PCR定量的原理-外标法深圳匹基生物股份公司技术支持部第二部分 PCR污染及预防对策 污染原因 标本间交叉污染 PCR试剂的污染 PCR扩增产物污染气溶胶污染实验室中克隆质粒的污染 深圳匹基生物股份公司技术支持部规范化的管理和标准操作程序（SOP）仪器设备的维护保养程序仪器设备的校准程序仪器设备的操作程序临床标本的处理程序临床标本的保存程序核酸产物分析检测程

5、序等深圳匹基生物股份公司技术支持部PCR防污染措施1.实验环境的控制PCR应实行严格的分区操作：前准备区；样本处理区，其中DNA和RNA的处理也应该分开；扩增区。各区专区使用，并尽量使用一次性消耗品，高压消毒，实验器械和台面均应进行定期消毒等。2避免PCR后处理荧光PCR不同于其他的PCR方法，无须对PCR扩增产物进行任何的检测，实际就是对PCR污染的有力预防。3dUTP防污染系统反应体系中常规的dNTPS中的dTTP替换为dUTP，在扩增过程中dU取代dT的位置掺入到PCR产物中，在尿嘧啶糖基酶（UNG）的作用下，发生U的糖苷键的水解，经高温处理后DNA链断裂成碎片，从而无法成为下一轮的PC

6、R的模板。深圳匹基生物股份公司技术支持部污染的监测 对照试验 试剂空白对照阳性对照 阴性对照 重复性试验深圳匹基生物股份公司技术支持部防止污染的方法 合理的分区吸样枪 预混和分装PCR试剂 防止操作人员污染 设立适当的阳性对照和阴性对照 选择质量好的试剂和耗材深圳匹基生物股份公司技术支持部PCR假阴性的原因分析 样品前处理或保存方面的问题：抗凝剂使用不当（如肝素可显著抑制PCR反应）溶血样品反复冻融等。样品处理过程中模板的降解或丢失操作不规范存在核酸酶（特别是RNase）的污染等。PCR试剂方面的问题试剂质量本身不过关试剂已过期深圳匹基生物股份公司技术支持部试剂运输或保存不当，多次冻融等导致引物或/和探针的降解，酶活性减低或丧失。存在PCR抑制物：血红素、有机试剂等。PCR反应体系方面的问题：加样不准确、错加、漏加某种试剂等。深圳匹基生物股份公司技术支持部解决的对策严格按照操作规程进行样品的保存、处理及模板的制备规范操作设立对照的原则防止核酸酶(RNase和DNase)的污染建立健全的实验室管理体系和完整实验记录深圳匹基生物股份公司技术支持部出现污染的对策根据实验结果先判断污染的原因1.如果只是阴性对照出现污染，而标本中仍有阴性，则考