免疫学应用第15YE课件

1、第十五章 免疫学应用Immune applications授课人：叶丽林 职称：教授TEL: 62871922E-mail:基础部全军免疫学研究所教学目标了解：免疫学诊断的原理、常用的免疫功能检测指标 免疫治疗制剂的类型和作用机制理解：抗原-抗体结合反应的特点及影响因素 免疫细胞的检测方法及原理 免疫分子的检测方法及原理 以抗体、细胞和细胞因子为基础的免疫治疗掌握：基于抗原抗体反应的检测方法及其原理 人工（自然）主动免疫的概念 人工（自然）被动免疫的概念教学重点与难点：重点： 基于抗原抗体反应的检测方法 人工（自然）主动免疫的概念 人工（自然）被动免疫的概念难点：抗原-抗体结合反应的特点及影响

2、因素 免疫分子的检测原理 教学对象：临床医学五年制本科使用教材：医学免疫学（第二版），龚非力主编， 科学出版社，2007年。参考教材：医学免疫学（第五版），金伯泉主编， 人民卫生出版社，2008年；基础免疫学，W.E.保罗编著，吴玉章等译， 科学出版社，2003年。推荐网站：免疫教研室网络教学: 1/mta/personalpage.htm；中国免疫学信息网：/“三基”问题导入式教学法教学设计理念作用机制前沿热点临床案例乙肝三对检查及其临床意义主要内容基于抗原-抗体反应的检测方法免疫细胞的检测免疫分子的检测免疫学诊断与监测免疫学预防 抗原抗体反应: 指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应

3、物质基础: 抗原表位与抗体高变区间的互补结合 抗原表位与抗体高变区的沟槽分子表面的结合 抗原抗体之间的结合力 一、抗原抗体反应的原理静电引力（electrostatic forces）范德华引力:作用最小（van der Waals interactions）氢键:最具特异性（hydrogen bond ）疏水作用力:作用最大 （hydrophobic interactions） 抗原抗体结合力示意图1、抗原抗体结合力抗体分子上一个抗原结合点与对应的抗原决定簇之间相适应而存在着的引力，是抗原抗体间固有的结合力亲和力(affinity)抗原抗体亲和力示意图2、抗原抗体的亲和力和亲合力二、抗原抗体

4、反应的特点特异性 可逆性比例性 阶段性难点内容特异性：抗原与抗体结合反应的专一性抗原抗体反应特异性示意图分子基础:抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的互补性1、特异性2、可逆性抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件下又可解离为游离抗原与抗体的特性 影响因素： 抗体对相应抗原的亲合力亲合力越高，结合越牢固，越不易解离 环境因素对复合物的影响pH、离子强度 前带(prezone)：抗体过量后带(postzone)：抗原过量等带(equivalence zone)： 抗原抗体比例合适 抗原抗体反应比例性示意图抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系3、比例性第一阶段：特异性结合阶段，反应快，不

5、可见 第二阶段：反应可见阶段，反应慢，出现凝集、 沉淀和细胞溶解等现象 4、阶段性三、影响抗原抗体反应的因素1、反应物自身因素抗原:理化性状、表位种类和数目抗体:来源、特异性、亲和性、效价难点内容PH 和 Na+浓度曲线2、环境因素电解质:生理盐水或缓冲液酸碱度: pH6pH9温 度: 1540， 37最适四、基于抗原抗体反应的检测方法根据抗原与抗体特异性结合反应的特性，用肉眼观察或借助仪器检测抗原抗体反应的结果，由此对样品中的抗原或抗体进行定性、定量或定位分析 免疫学检测技术的核心基础重点内容反应类型实验技术结果判断中和反应病毒中和试验检测病毒感染性毒素中和试验检测外毒素毒性标记免疫反应荧光

6、免疫技术检测荧光现象放射免疫技术检测放射性强度酶免疫技术检测酶底物显色发光免疫技术检测发光强度金免疫技术检测金颗粒沉淀 细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后，在一定条件下出现肉眼可见的凝集物。直接凝集间接凝集间接凝集抑制试验1、凝集反应（ Agglutination ）Autoimmune Hemolytic Anemia 直接凝集反应示意图（2）间接凝集 将可溶性抗原或抗体包被在与免疫无关的载体颗粒表面，再与相应抗体或抗原进行特异性反应，出现颗粒物凝集反应。间接凝集反应产生的抗原抗体复合物：（3）间接凝集抑制试验：将待测抗原（或抗体）与特异性抗体（或抗原）先行混合，再加入相应致敏载体悬液

7、，若待测抗原抗体反应，则随后加入的相应致敏载体颗粒不再被凝集。2、沉淀反应(precipitation) 可溶性抗原与相应抗体结合后，在一定条件下出现肉眼可见的沉淀，称为沉淀反应。 该反应多用半固体琼脂凝胶作为介质进行琼脂扩散或免疫扩散，即可溶性抗原与抗体在凝胶中扩散，在比例合适处相遇即形成可见的白色沉淀。（1）单向免疫扩散(single immunodiffusion)（2）双向免疫扩散 (double immunodiffusion) 双向免疫扩散实验结果（3）免疫电泳(immunoelectrophoresis)免疫电泳实验过程动画演示（4）免疫比浊(immunonephelometry

8、) 在一定量抗体中分别加入递增量的抗原，所形成的免疫复合物致液体混浊，浊度与复合物的量呈正相关，可用浊度计测量，通过绘制标准曲线二推算出样品中抗原含量。补体结合试验3、补体参与的反应（complement fixation test, CFT）酶、荧光素、放射性核素或胶体金等标记抗体或抗原，进行抗原-抗体反应的检测酶免疫测定 (enzyme immunoassay, EIA)免疫荧光法 (immunofluorescence, IF)免疫组化技术（immunohitochemistry techenique）放射免疫测定法 (radioimmunoassay, RIA)化学发光免疫分析 (ch

9、emiluminescence immunoassay)免疫印迹法(immunoblotting)4、免疫标记技术（Immunolabelling technique）（1）酶免疫测定 (EIA)常用的方法如下：酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)酶联免疫斑点试验 (enzyme linked immunospot assay，ELISPOT)酶标抗体的工作原理酶标抗体工作原理示意图 ELISAELISA反应过程动画演示如何测定HBV的S抗原？ELISA原理示意图乙肝五项及检测试剂盒如何测定HBV的S抗原？ELISA法测定HBV的S

10、抗原示意图酶联免疫斑点试验ELISpot试验流程图（1）ELISpot试验流程图（2）ELISpot试验流程图（3）典型Elispot Plate LayoutElispot实验结果知识拓展（2）免疫荧光法 (immunofluorescence,IF)免疫荧光法试验原理示意图免疫荧光法示意图荧光素与抗体连接成荧光抗体 免疫荧光法分类免疫荧光法示意图1、Laminin - green-fluorescent Qdot 565 IgG 2、CD31- red-fluorescent Qdot 655 IgG3、Nuclei - blue-fluorescent Hoechst 33342Mous

11、e kidneysection（3）免疫组化技术 应用标记的抗体与组织或细胞抗原发生反应，结合形态学观察，对组织或细胞表面抗原进行定性、定量、定位。 常用技术包括酶免疫组化（辣根过氧化物酶标记）、免疫金组化（胶体金颗粒标记）、免疫电镜技术（铁蛋白、胶体金、过氧化物酶标记）等。H&E staining1、11周HBx转基因小鼠和野生型小鼠肝脏组织 的HE染色 2、HBx转基因小鼠肝脏内有中性脂类聚集 用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测。 该法兼有放射性核素的高灵敏度和抗原-抗体反应的特异性，检测灵敏度达pg水平。 常用于标记的放射性核素为125I和131I，分为液相和固相两种方法。 该法常

12、用于测定微量物质，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素，吗啡、地高辛、IgE等。 （4）放射免疫测定法 (radioimmunoassay, RIA)将发光物质（如吖啶酯、鲁米诺等）标记抗原或抗体，发光物质在反应剂（如过氧化阴离子）激发下发射光子，通过自动发光分析仪测定光子产量，可反映待检样品中抗体或抗原含量。该法灵敏度高，常用于检测血清超微量活性物质（甲状腺素等激素）。（5）化学发光免疫分析（6）免疫印迹法第二节 免疫细胞检测免疫细胞分离免疫细胞亚群分析免疫细胞功能分析一、免疫细胞分离免疫细胞分类示意图1、葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法BloodPlasmaMononulear cell

13、sRed cells400gCentrifuge30 MinutesLymphoprep1.071密度梯度法分离淋巴细胞示意图2、流式细胞仪分选细胞分选示意图BD Aria流式细胞仪3、磁珠分选磁珠阴性分选原理示意图二、免疫细胞及其亚类分析流式细胞仪工作原理示意图知识拓展流式细胞仪工作原理示意图流式细胞仪结果图淋巴细胞中CD8+细胞频率知识拓展流式细胞仪荧光标记与波长对照图知识拓展三、淋巴细胞功能的测定 1、淋巴细胞增殖实验淋巴细胞增殖实验 2、T细胞介导的细胞毒试验：51Cr释放法51Cr释放法细胞毒试验第三节 免疫分子检测免疫球蛋白的测定补体测定细胞因子检测CD分子、表面受体和黏附分子的检

14、测HLA型别分析难点内容在体外用已知抗原检测相应抗体用已知抗体对各类免疫球蛋白作定性、定量测定检测血清含量高的IgG、IgA、IgM时，可用免疫比浊法；检测IgD、IgE选用ELISA、RIA等灵敏度高的方法；诊断免疫球蛋白异常性疾病（如骨髓瘤），可用免疫电泳等方法。一、免疫球蛋白的测定了解体内补体激活状况，辅助有关疾病的诊断血清含量高的C3、C4、B因子等，可用免疫比浊法其他含量低的成分则借助ELISA、RIA等方法血清总补体活性测定常采用50%补体溶血法（50% complement haemolytic activity, CH50）二、补体测定CH50原理是： 用SRBC和兔抗SRBC

15、作为抗原抗体复合物，通过经典途径激活补体而溶解SRBC。通常以50%溶血所需的最小补体量表示总补体活性。 1、免疫学测定法用特异性抗体进行定量或半定量检测（ng/ml）分泌性细胞因子：双抗体夹心法、ELISA、RIA、ELISPOT、免疫印迹法等方法胞内细胞因子：FCM免疫荧光技术或者ELISPOT三、细胞因子检测2、生物活性测定法根据细胞因子特定的生物学活性，借助相应指示系统，如选用各种依赖性细胞株或靶细胞，同时与标准品对照测定，从而得知样品中细胞因子活性水平，一般以活性单位（U/ml）表示。 3、分子生物学测定法具体方法为聚合酶链反应（PCR）、实时定量PCR等。 用已知抗CD分子表面受体

16、和黏附分子的抗体可鉴定细胞表面相应膜分子。膜分子：间接免疫荧光法、流式细胞术等可溶性分子：ELISA等四、CD分子、表面受体和黏附分子检测指纹图谱技术聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSOP) 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)聚合酶链反应-序列特异性引物（PCR-SSP）单核苷酸多态性分析（SNP）五、HLA型别分析基因分型第四节 免疫诊断与监测（自学）用免疫学方法确定疾病相关因子、监测疾病过程、判断疗效和预后。 疾病相关因子检测：肿瘤抗原、红细胞血型抗原、自身抗体、变应原抗体等；免疫功能检测：CD4+T细胞数

17、目减少用于艾滋病辅助诊断等；免疫学检测：乙肝病毒抗原与抗体的消长等。第五节 免疫预防免疫学预防（immunoprophylaxis）：即人工免疫，通过人工输入抗原物质刺激机体产生免疫效应，或直接输入免疫效应物质，从而特异性清除致病因子，达到预防疾病的目的。 自然免疫 机体感染病原体后建立的特异免疫（自然主动免疫），包括胎儿或者新生儿经胎盘或乳汁从母体获得抗体（自然被动免疫）。人工免疫（artificial immunization） 即免疫学预防，指采用人工方法，将疫苗、类毒素或含特异性抗体和细胞的免疫制剂接种于人体，以增强宿主的抗病能力。人工主动免疫人工被动免疫一、基本概念人工主动免疫(ar

18、tificial active immunization) 是指给机体接种抗原性物质如疫苗、类毒素等，刺激机体免疫系统产生特异性免疫力的方法。 Definition:Artificial active immunization is inoculation with antigenic substances such as vaccines to provide specific immunity mainly for prevention.人工被动免疫(artificial passive immunization) 是给人体注射含特异性抗体的免疫血清或细胞因子等制剂,使受者迅速获得特异性免

19、疫力的方法。 Definition:Injection of specific antibodies or other biologicals to provide bodies with corresponding immunity,mainly for emergent prophylaxis or therapy.人工自动免疫与人工被动免疫的比较人工自动免疫人工被动免疫产生免疫力的物质抗原（疫苗、类毒素、瘤苗等）抗体、活化的淋巴细胞、细胞因子等发挥作用的潜伏期较长，约124周短，无需诱导期、立即发挥作用免疫力维持时间较长，约半年数年较短，数周数月主要用途预防传染性疾病治疗肿瘤传染性疾病的

20、治疗或紧急预防，调节机体免疫功能，治疗肿瘤二、疫苗的种类及其作用机制以完整病原体和毒素制备的疫苗死疫苗（灭活疫苗）、活疫苗（减毒活疫苗）、类毒素新型疫苗亚单位疫苗、结合疫苗、合成肽疫苗、基因工程疫苗核酸疫苗（一）以完整病原体和毒素制备的疫苗区别要点死疫苗活疫苗制剂杀死的病原体活的、弱的或无毒的病原体接种剂量及次数量大，2-3次量小，多为1次副作用大小免疫效果较差，6月-2年较好，3-5年细胞免疫效果不产生产生稳定性稳定、易保存，有效期约1年不稳定，难保存，4冰箱保存数周常用疫苗霍乱、伤寒、百日咳、流脑、狂犬病、甲肝及乙肝BCG、腮腺炎、麻疹、脊髓灰质炎、风疹及水痘类毒素（toxoid）细菌外毒

21、素经0.3-0.4%甲醛溶液处理失去毒性而保留其免疫原性诱导机体产生抗外毒素抗体，即抗毒素常用的类毒素：破伤风类毒素、白喉类毒素用于主动免疫或者接种动物制备抗血清（二）新型疫苗亚单位疫苗（subunit vaccine）去除病原体中与诱导保护性免疫无关、甚至有害的组分，仅用其有效免疫原成分制备副作用明显减少，保护效果相同如：无细胞百日咳疫苗、流感病毒血凝素和神经氨酸酶制备流感疫苗结合疫苗（conjugate vaccine）将细菌荚膜多糖的水解物或脂多糖与蛋白载体交联，使之成为TD-Ag，从而诱导机体产生记忆性细胞核IgG类抗体增强免疫保护效应脑膜炎球菌疫苗、肺炎球菌疫苗、B型流感杆菌疫苗合成肽疫苗（synthetic peptide va