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文档简介
1、肽钉合技术的发展与应用概述摘要:肽钉合技术是在肽的端链或侧链环化,约束其a-螺旋构象,增强其生 物活性的一种策略。通过共价连接两个氨基酸的侧链进行装订,从而形成一个肽 大环,主要以烷基链、二硫键、酰胺键、联芳基、联芳基醚类和三氮唑类连接方 式为主。越来越多的基于不同方式的装订技术应用于大环化化学中。在本综述 中,我们对肽钉合技术进行分类和分析它们在生物学、药学、医学和化学生物学 等方面的应用。关键词:肽钉合,大环化化学,装订连接臂,PPIs前言蛋白质的二级结构a-螺旋在其功能中扮演着重要的角色,越来越多的研究 者环化一些大分子模仿蛋白质的二级结构,以研究和开发抗菌剂1、抗癌药2、 免疫抑制剂3
2、、激酶抑制剂4和蛋白质相互作用5。大环环肽和模拟肽已经被证 明在这些领域发挥着重要的作用,还应用在疫苗学回、分子和离子识别与化学催 化7当中。传统的短肽在水相中很难保持其a-螺旋结构和结合性能,不易产生像 蛋白质那样的结构和功能,并且没有环化的肽很容易被蛋白酶水解,细胞通透性 较差,理论上能形成三个连续稳定的氢键且具有螺旋结构的天然肽序列最短的是 一个五肽(Figure 18。鉴于这些原因,越来越多的课题组研究开发新型的方法来 修饰多肽,保持a-螺旋结构,增强其稳定性和细胞通透性等,防止内消旋化和外 消旋化,弥补传统多肽的一些不足9。Figure 1 Three consecutive hyd
3、rogen bonds define an a-helix stabilized by linking sidechains at positions 1 and 5.如今,肽环化的一种特殊类型是肽钉合,它是目前为止最有效地控制多肽构 象的一种方式,将两个氨基酸残基上的连接臂通过特殊的共价键连接起来,约束 其a-螺旋结构和-折叠结构等。近年来,装订化学在生物和医学方面盛行起来, 它可以用来研究蛋白质相互作用,鉴定药物靶点和开发新型药物等1。按照连接臂组分的多少,可以将装订化学分为单组份装订技术和多组分装订 技术。这两种技术既有相似性,也有差异性。通过不同的共价键连接形成各种性 能的连接臂,其中
4、酰胺键最先被运用到肽钉合技术当中,传统的多肽在水相当中 很难形成a-螺旋结构,因为水与肽当中的酰胺键竞争性地形成氢键,使其自身酰 胺键之间难以形成稳定的氢键,导致a-螺旋结构难以形成11。在蛋白质相互作 用中12,将linker用酰胺键连接13,钉合多肽中4-15个氨基酸,形成1-4个a- 螺旋圈,可以很好地研究药物作用的靶点,开发新型生物药。肽和蛋白质的半胱 氨酸衍生化发展成为强大的研究和技术工具,现在有几种方法可以修饰半胱氨酸, 包括烷基化,共轭加成,氧化和还原。将半胱氨酸巯基衍生化做为连接linker, 这种含硫连接臂较易合成,可以增加疏水作用,增强a-螺旋结构的稳定性,防止 巯基被破坏
5、而影响生物活性,同是用含硫的linker可以缩短钉合的连接臂14。闭 环烯烃复分解反应是被最常应用到肽钉合当中的技术之一,构建全烃交联连接臂 可以减少极性酰胺主链的暴露,从而减少了膜渗透的障碍,并且能够抵抗蛋白酶 对其切割15。铜(I)介导Huisgen1,3-偶极环加成反应也被应用在肽钉合技术当中, 形成的三氮唑结构与酰胺键桥产生相似的功能,同时炔基和叠氮基发生click反 应,能更好地应用在生物正交反应16。其他的肽钉合技术也开发应用当中,将在 本综述中详细讲解。KD lactam linker 1m-Xyleme thiacthsr linker 3KD lactam linker 1m
6、-Xyleme thiacthsr linker 3Pertluorobenzyl thioether linker 4 Alkyl Uhiloether linker 5 Click triazole linker 6Figure 2. Cyclic pentapeptides 1-6内酰胺化钉合通过侧链进行钉合形成稳定的a-螺旋结构的多肽最早的报道是在i, i+4个氨基酸之间形成内酰胺连接形式。Felix等是第一个研究侧链内酰胺化17,将人 生长激素释放因子短链类似物中的赖氨酸和天冬氨酸残基通过酰胺键连接起来, 用核磁共振和圆二色谱表征,发现保留了其a-螺旋结构,环化后的生物活性并未改变(
7、Figure 3)。CyclofAsp6 - Lys12CyclofAsp6 - Lys12)Asp6. AJa15-GRFi1 -29)-NH2Figure 3. Cyclic GRF analogs不多于15个氨基酸序列的a螺旋结构占蛋白质总体结构的30%左右,在稳 定蛋白质的三级结构当中起着关键作用18。以及与蛋白质、DNA和RNA等物质 的相互作用时介导重要的生物过程19。短肽在水中难以形成稳定的a螺旋结构。 尝试去用非天然氨基酸稳定或模拟小型a螺旋结构,或者用有机桥和非肽支架 来固定多肽构象,效果不太理想且作用有限。如果是短肽a螺旋结构可以被小分 子稳定或模仿,那么这些化合物可能是有
8、价值的化学或生物探针并导致新型药物, 疫苗,诊断剂,生物聚合物和工业试剂20。胰高血糖素样肽1是肠道细胞在摄入营养时释放的一种肠促胰岛素,以两 种等势形式存在GLP1(736)NH2 和GLP1(737),胰高血糖素样肽1受体存在 于很多器官当中,发挥着相当多的生物响应,例如调节胰岛素的含量,促进胰岛 素基因转录和刺激Pcell扩散等。然而,胰高血糖素样肽1在体内循环非常短(血 浆半衰期约为2min),这是由于它对酶降解高度敏感,这种快速的蛋白水解严重 影响了其有效的临床应用21。1 piperidine2) Fmoc-AAHBTUH1 piperidine2) Fmoc-AAHBTUHFmo
9、cNSegment 13) repeats ofsteps 1 and 2(CH小山IICOOAINHAloc1PdIICOOAINHAloc1Pdc2) PyBOPBicyclic GLP-1 analoguesBicyclic GLP-1 analogues1) r&p&ats oliFmcc nemoval and Fmoc-AA coupling PdQPyBOPpiperidineTFAFigure 4. Solid-phase synthesis of GLP-1 analogues containing multiple lactam bridges为了解决这一缺陷,Murage
10、等用肽钉合技术研究胰高血糖素样肽(Figure 4),设计并合成了构象受限的GLP-1类似物,方法是引入多个内酰胺桥,同时稳定 N和C末端的a-螺旋结构。除了通过固定最佳受体相互作用所需的螺旋构象来 提高受体激活能力(高达5倍),引入的内酰胺桥还提供了出色的屏蔽NEP24.11 作用(半衰期96 h)。这些高度受约束的肽是耐NEP24.11的GLP-1类似物的第 一个例子22。烷基化钉合技术闭环烯烃复分解反应最先是被Blackwell等将其应用在肽钉合技术当中,他 们选择研究疏水性肽模型系统,使用非极性序列弱化溶剂化作用,使多肽的构象、 折叠主要由分子内氢键、非键相互作用和静电效果控制(Fig
11、ure $23。2 = B c-V al-Ala- Le li-Ai b-Va I-Al a*Le J-O Me3,4 = Boc-Val-X Lsj-Aib-Val-X Leu-OMeFigure 6. Karle and Balaram s heptapeptide 2, and two dienic analogues Figure 6. Karle and Balaram s heptapeptide 2, and two dienic analogues 3 and 4. Boc = tertbutoxycarbonyl.将中间体2接上烯丙基醚基团,然后通过烯烃复分解反应形成环内双键
12、,再将双键氢化,最后得到用烷基链钉合的多肽(Scheme 1)。并且装订没有显著影响肽的构象,研究证明了螺旋肽侧链的烯烃复分解进行的可行性。W= 1): 85%6 W= 1): 85%6 井=2)一 90%Scheme 1. Synthesis of peptide macrocycles. a) 20 mol% of 1, CHC13, 25 C; b) cat. 10% Pd/C, 1 atm H2, EtOH, 25 C.在肽合成过程中,一种非天然的a, a-二取代氨基酸与烯烃键结合在i, i + 4 或i,i + 7个位置并经复分解催化生成肽单面上的共价交联24。全烃固定肽- Verd
13、ine等人提出的策略被认为是PPI的最有希望的装订策略之一。此策略已成 功用于改善肽在体内稳定性并增强其对许多生物大分子受体的膜渗透,已经应用 在癌症,动脉粥样硬化,艾滋病毒和其他有关疾病当中25。为了避免Dconfigured 氨基酸固有的螺旋失效效应,同时利用a,a-二取代氨基酸螺旋稳定性,Verdine 等将a-甲基引入Fmoc-R5-OH和Fmoc-S5-OH26,将装订位置限制在丙氨酸或突 变的丙氨酸。但是,从技术上讲很难在每个序列中都固定丙氨酸的位置,尤其是 当序列中有两个装订位。此外,全烃装订技术的另一个经常遇到的缺点是溶解度问题,特别是在Ser、 Lys或Arg的天然亲水侧链因
14、被装订而被破坏了其溶解性。为了解决上述问题, 已经有几种方法。通过替换内部(i,i + 4)具有共价键的氢键,例如由Alewood 等人27开发的乙烯桥,Tian等人脯氨酸衍生的跨环N帽或预制的二氨基二酸策 略。在这种情况下,开发一种新的替代装订方法,保留氨基酸侧链在装订的位置。 为此,Tian等人用七种经典的Fmoc-a-戊烯氨基酸为例进行了测试,即Leu *, Met*,Ser *,Tyr *,Lys *, Arg *和 Phe *(Table 1)28。Peptide脂quoiK玲a-helicityAxin(469-482)AC-PESILDEHVQRVMK-NH219.59%WNT-
15、1aAc-PE扣 LD/? HVQRVMK-NW24.79%WNT-2dAc-PES】dEH 用 QRVMK-NH?21.58%WNT-3aAc-PESILDEH/e42.34%WNT-3bAc-FES1LDEH5QRV35.35%WNK3cAaPESILDEH&QrGI&K-NHi64.72%WNT-3dAc-PESILDEH&QRV 枷 K-NHeN/AWNT4Ac-PESLDEHV 艮 RVM/v-N 压N/AW N T-5 aAc-PE.S:I:1LSEHVQRVMK-NH251.29%WNT-5bAc-PE As LSE H VQRVMK-NH 240.05%WNT-6aAcPESI
16、 屈*VQRVMKNHw70.87%WNT-6bAaPESI 乩 DESVQRVMK-NFh36.75%WNT-7dAc-PESILDEHv1rV4K-NH249.92%WNT-8aAc-PESl LDEUVQVM K 享-NN/ATable ISynthesis route and amino acid sequences of stapled peptides含硫芳基化钉合技术肽和蛋白质中的半胱氨酸在生物催化中起着重要作用,对肽和蛋白质中的半 胱氨酸进行修饰可以产生不同的生物功能29,包括烷基化、共轭加成、氧化和还 原。与大多数烷基化化学的报告相比,半胱氨酸的芳基化的方法是非常罕见的。 这
17、是令人惊讶的,因为人们已经很长时间就知道自然发生的酶 (如谷胱甘肽 Stransferase)能够通过选择性芳基化谷胱甘肽进行芳香亲核取代反应30。最近,Davis等人利用Mukaiyama试剂形成芳基化的半胱氨酸中间体转化为 脱氢丙氨酸。这表明在生物偶联试剂足够活泼时,就有可能使半胱氨酸芳基化31。 为了探索在温和条件下半胱氨酸的芳基化,Spokoyny等人评估了全氟芳香族分 子,已知这些化合物在温和条件下表现出非常高的芳香亲核取代反应活性。这些 中间体化合物易购买,且可以用19F NMR进行表征。Schubert32等人开发出满足 许多“点击”反应的要求,使其对生物正交反应具有很大的吸引力
18、(Scheme 2A). 半胱氨酸全氟芳基化的发现,进一步展示了这种化学反应如何用于肽装订,从而 呈现出新的一类生物活性肽和小型蛋白质(Scheme 2B)。ABocHNCOOMeMeOOCNIHBac2b IMeOOCBocHNronn? ?e?j7iperature b即ign regDsc/ccfjvc ABocHNCOOMeMeOOCNIHBac2b IMeOOCBocHNronn? ?e?j7iperature b即ign regDsc/ccfjvc thiol se/ecveTRIS DMF. rtNHBocCOOMeScheme 2. (A) SAr reaction betwe
19、en thiolate and a perfluoroaromaticspecies. (B) Model reactions carried out between protected cysteine derivative 1 and two commercially available perfluoroaromatic reagents 2a and 2b.Spokoyny33等人发现全氟芳香族分子与半胱氨酸的巯基在室温下容易发生 芳基化反应。这种新方法能够选择性地进行修饰肽中未保护的半胱氨酸残基,在 肽钉合技术当中提供了一种引入全氟刚性芳烃的方法。运用这种技术对肽序列 进行装订修饰,
20、设计用来结合HIV-1的C末端结构域衣壳装配多蛋白(C-CA) 的多肽,结果显示在亲和结合,细胞渗透性和蛋白水解稳定性方面与未装订的多 肽相比确实增强了 (Scheme 3)。A/-R R-SH t1,NllE-Thr-Phfi-Cys-AEp-Leu-Leu-Cys-Tyr-Tyr-Gly-Lys-Lys-LysCONH?X = I I, R = I I6a- X H, R = a职 X=ll, H = B7 X- |J-Ala-FITCjR - CHaCONH2 7a X = p-Ate-F|TC.7k X = p-Ala-FITC., R = b8b: X - e-Ala-FITCr R
21、 = dNlYAD-Z. 9: X= Ala-MTCBa: X NlYAD-Z. 9: X= Ala-MTCScheme 3. Peptides Studied in the Context of the C-CA Model含三氮唑基团的钉合技术铜(I)介导Huisgen1,3-偶极环加成反应在过去的十年中受到Sharpless等人大 力开发,并且由于它的简单性,高产量,因此被称为“点击”反应,反应条件温和, 具有生物相容性,试剂便宜,铜试剂毒性较小,因此Cu(I)催化的click环加成反 应是一个经常使用的肽钉合技术,鉴于其具有相当好的生物兼容的连接技术而广 泛被普及34。Wnt信号通路中
22、的主要介体P-catenin的上调信号在肿瘤发生中起重要作用 35。几种类型的人类癌症,包括结肠癌,前列腺癌和黑色素瘤都与其调节相关。 P-catenin介导的转录活化需要形成P-catenin超复合物,由B细胞淋巴瘤9(BCL9) 组成,类BCL9(B9L),T细胞因子/淋巴增强因子(TCF /LEF),cAMP反应元 件结合蛋白(CBP)和其他辅助因子组成36。Kawamoto37等在采用了三氮唑钉合方法稳定BCL9肽的a-螺旋结构以靶向 BCL9 /p-catenin蛋白-蛋白相互作用。此外研发的三氮唑修饰的BCL9肽抑制剂, Kawamoto等人优化了接头长度,钉合位和氨基酸生成最佳三
23、氮唑所需的最佳的 立体化学结构,还研究了各种钉合位并成功地产生了双三氮唑修饰的肽展现出超 过90%的螺旋度,抑制了蛋白酶对其水解(Table家Table 2 Optimization of Linkers for Triazole Stapling of BCL9 PeptidesPeptideSequenceLinear Ki 土SD (|1M)% Helicity13男 lsqeqlehrerslqtlrdiqrmlf-nh;.0.60 土0.144423SJlsqeqlehrerslqtlrdiqrllf-nh0.94 土0.17473n3351lsqeqlehr*rsl*tlrdiqr
24、mlf-nh21.4 土 0.2444n34.9 土 0.945lsqeqlehr*rsl*tlrdiqrmlfnh25rN33SLSQEQLEHR+RSL+TLRDIQRMLF-NH2.4 土 0.2426N“351 /r3lsqeqlehr*rsl*tlrdiqrmlfnh?1.4 土 0.1497351 r r35Jlsqeqlehr*rsl*tlrdiqrllf-nh21.9 土 0.45083513SJlsqeqlehrrsl*tlrdiqrllf-nh23.6 土 1.0499lsqeqlehr*rsl*tlrdiqrllf-nh211.0 土 1.03210*lsqeqlehr*
25、rsl*tlrdiqrllf-nh22.2 土 0.23411、N(& atom linker)35LSQEQLEHR*RSL*TLRDIQRMLF*NH20.33 土0.0666结论从这篇综述中讨论的例子可以明显看出不是针对所有的情况都有单一最佳 装订策略,并且钉合技术的选择取决于生物学正在研究的问题和个体的性质。目 前,全烃装订肽引领细胞内PPI靶标的方法,内酰胺固定肽针对细胞外和膜结合 的目标具有优越性。目前,还有许多新型钉合技术正在开发中,尚未充分发挥其 潜力。未来的主要挑战是设计订合位置,有利于体内功效而不是简单螺旋的肽或 结合亲和力。特别是控制细胞渗透性的因素是一个尚未解决的重要问
26、题。另一个 重要的考虑因素是订书钉连接本身。随着这一领域的成熟,装订技术逐渐完善,我们希望看到更多的研究利用不 同的装订技术增加建立有效的基于肽的疗法。参考文献Driggers, E. M.; Hale, S. P.; Lee, J.; Terrett, N. K. The exploration of macrocycles for drug discovery - an underexploited structural class. Nat. Rev. Drug Discovery 2008, 7, 608-624.Wessjohann, L. A.; Ruijter, E.; Garc
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