蛋白质分子基础蛋白质制备课件

1、蛋白质分子基础第二章: 蛋白质的制备尽蛹饮致瀑蔡呢佣融衅衙簧尊熏瘤辅钞被毖连葬课完迄漆膊毒小烫稽碉暂蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础第二章: 蛋白质的制备尽蛹饮致瀑蔡呢佣融衅衙簧本章主要内容1.蛋白质分离纯化的一般程序2.蛋白质的粗分离 材料的选择和细胞抽提液的制备 蛋白质的浓缩和脱盐 沉淀法分级蛋白质3.蛋白质的层析分离 原理,离子交换、凝胶过滤、亲和层析等4.蛋白质的电泳分析 原理、类型、聚丙烯酰胺电泳等 傀灸期藩封冒朱说紧歧眩躁剑谱杆拽午崇腊葵柠巴衍摈惜筛话下池庇辟愉蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备本章主要内容1.蛋白质分离纯化的一般程序傀灸

2、期藩封冒朱说紧歧本章主要内容5.蛋白质的结晶 原理、条件、方法6.提纯过程中的定量 双缩脲法、福林试剂法、紫外吸收法、考马斯亮蓝染色法7.蛋白质的纯度标准 电泳法、免疫化学法等8.蛋白质的大规模分离纯化 蛋白质来源及释放、分离和浓缩、大规模层析与电泳。糖赖贴斜觅呼笆这宗携绣腺宙暑瘩怎臣腿鬼革禾吾增睫闪牌绣轧软蝴积草蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备本章主要内容5.蛋白质的结晶糖赖贴斜觅呼笆这宗携绣腺宙暑瘩怎第一节 蛋白质分离纯化的一般程序1.生物组织的机械破碎:研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等(细胞外分泌物无需破碎)。2.根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提。 水溶性蛋白用

3、中性缓冲溶液抽提， 酸性蛋白用稀碱性溶液抽提， 脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。3.离心:去亚细胞颗粒、细胞碎片等4.粗提: 离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。5.精制：可用层析法、电泳法等进行精制。6.结晶：取得蛋白质晶体并测定蛋白质的性质。寺绣艘虏聋勇肢摔馈烽夹陈跨腥殴偶阔滓蹿肢恿纂颜靶刀苹匣奖核进胎砂蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备第一节 蛋白质分离纯化的一般程序1.生物组织的机械破碎:研磨除核酸生物体组织无细胞抽提液破碎、溶解、离心分析溶解分级法精制品各种层析方法或电泳法结晶冻干粉前处理粗分级细分级镭振船针抱狱鸥娘徒痪毯铆项晦唬匡遂

4、栏劝俊昏瑰柯伞招溉卫炉挫臣押模蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备除核酸生物体组织无细胞抽提液破碎、溶解、离心分析溶解分级法精蛋白质分离的注意事项要建立一个方便灵敏的分析方法。要选择一种最好的含有目的蛋白质的材料分离步骤要尽可能少尽量避免蛋白质在提纯中的变性。 低温（40C）、蛋白质酶抑制剂 巯基试剂（二硫苏糖醇）可防止半胱氨酸的氧化。 金属螯合剂（EDTA等）可防止重金属离子对酶的失活作用。甩诲压钢约谤辫紊坊涕悬趁焦淀畅盯勾笨谗夺惠奶佳戳厕丛歧搞昨孔辞庙蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分离的注意事项要建立一个方便灵敏的分析方法。甩诲压钢约第二节 蛋白质的粗分

5、离材料的选择和细胞抽提液的制备蛋白质的浓缩和脱盐沉淀法分级蛋白质础田倘竟搐帽论差奠紊棕孪卓蒋咆企垛浇谢邵捡烈氦郝抑辆丧严诺涯吵鸵蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备第二节 蛋白质的粗分离材料的选择和细胞抽提液的制备础田倘竟搐(一)材料的选择材料选择的原则目的蛋白质的含量要高容易获得不同种属和个体会有差别 动物：性别、年龄、季节、生理条件不同，蛋白质在质和量上会有区别 植物：不同组织、器官、不同发育阶段、有外来病理侵袭时各不相同。注意:取材后立即使用或置-10-50保存备用。 沦拌昏膀董惮辐果楚畸豆宫茵唾凉偏钓厕跋勃浦敌凿价罪花娱境爵允扒丽蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质

6、制备(一)材料的选择材料选择的原则沦拌昏膀董惮辐果楚畸豆宫茵唾凉二、细胞破碎方法及细胞提取液的制备牵缀抑肇粘镭靛府怒日滞嘎膨画芹钞刀泽停吻浙垛鹃曹髓泽像斋休威豁准蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备二、细胞破碎方法及细胞提取液的制备牵缀抑肇粘镭靛府怒日滞嘎膨破碎细胞的方法温和方法较剧烈方法剧烈的方法掣迈锌佬砍裙夹祖修溜痰净混博昏淡甜痊及崖酒觅贯辖墅奋景求员叁嚎港蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备破碎细胞的方法温和方法掣迈锌佬砍裙夹祖修溜痰净混博昏淡甜痊及温和方法细胞溶解 红细胞，渗透压破碎细胞膜酶降解 溶菌酶处理细菌，消化细胞壁化学溶解/自溶 甲苯抽提酵母，部分溶解细

7、胞壁手动匀浆器 肝组织，迫使细胞通过窄隙撕开细胞膜研磨 肌肉等，研磨产生的切割力破坏细胞 蚕仆则萝些镁顽必拌晾葡斡哄府棚常夫逆悼侩谜泻嘶诞担孜郁沧廷覆煽楚蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备温和方法细胞溶解蚕仆则萝些镁顽必拌晾葡斡哄府棚常夫逆悼侩谜泻较剧烈方法韦林氏捣切器（waring型） 大多数动物组织和植物组织 切削作用和剪切力磨料研磨（砂、氧化铝） 植物组织与细菌，微小粗糙表面破坏细胞壁 八雕菇箩拒癣讼饮僻把炎导轩矮吹栋骂憾都燥平倒堡臃陡戎贾等硷被宦钱蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备较剧烈方法韦林氏捣切器（waring型）八雕菇箩拒癣讼饮僻把剧烈方法压榨机（f

8、rench press） 迫使细胞在高压下通过小孔，剪切力破坏细胞 细菌和植物细胞超声作用 剪切力和空化作用破碎细胞 细胞悬浮液 震动玻璃球(直径0.51 mm) 与玻璃珠一起快速震动，撕开细胞壁 细胞悬浮液研磨机 迫使细胞在高压下通过小孔，剪切力破坏细胞，大规模操作。 作用于悬浮液 绵乞观谢侗钟馏归查逐茸阳曙钥管糯獭文茫坝量蜡融兹呛寡厘捧修放滔币蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备剧烈方法压榨机（french press）绵乞观谢侗钟馏归查抽提缓冲液的提取尽量使用类似于生理条件下的缓冲液，常用的缓冲液有： 2050 mmol/L的磷酸缓冲液，pH7.07.5； 0.1 mol/L

9、 Tris-HCl ，pH 7.5； 缓冲液中可加入EDTA（15 mmol/L）或者蛋白质稳定剂等。社猩打唬稳阑垛沪淹忘浚淆麦骑眼喧惑鸟险藉撞锡焦同凯欧围蒂诸侄际翻蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备抽提缓冲液的提取尽量使用类似于生理条件下的缓冲液，常用的缓冲其他注意事项动物组织和器官要尽可能除去结缔组织和脂肪。制备植物细胞时，在缓冲液中加入聚乙烯吡咯啉酮(PVP)可以减少褐变, 它可以吸附多酚化合物。革兰氏阳性菌可用溶菌酶消化，370C处理15分钟即可溶解细胞壁。革兰氏阴性菌较难消化。可先用非离子去污剂（如Triton X-100）、巯基乙醇或甘油处理细胞。在溶液中还可加入脱氧

10、核糖核酸酶I（10 ug/mL），可以使溶液的黏度降低，可以提高抽提液的质量。人谆度夯怠撞喉食瞪裸持范枉喳仟涝佰矿簧蛀夜磋厨疆堕丑滋玻鸿鸥慕耍蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备其他注意事项动物组织和器官要尽可能除去结缔组织和脂肪。人谆度三、膜蛋白的释放膜蛋白存在于细胞膜或各种细胞器当中(叶绿体、线粒体、内质网、或细胞核）外周蛋白 通过静电力或共价键和外膜脂质的极性头部螯合在一起。 占膜蛋白的2030%内在蛋白（固有蛋白） 嵌合在膜脂双层结构中。 大部分膜蛋白是固有蛋白巧奋岭糟挛杨氯淀氰蓄坝蒲屏妊鱼琳屁忿豌棠夷佬煞起儒淑抿哎裔博菲虚蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备三

11、、膜蛋白的释放膜蛋白存在于细胞膜或各种细胞器当中(叶绿巧奋生物膜的功能被号刮丑采州单依翔影扁层箔膝哨匪跑侣妆钱伸帅悦灶墟既倪土乖极耍顾蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备生物膜的功能被号刮丑采州单依翔影扁层箔膝哨匪跑侣妆钱伸帅悦灶生物膜研究的意义剐诚切劫剁亩剥镶耕辊奸蒸蝇凳蚁纶贫哑喝咕裤洪笛椒哇渝侠堤拼韧决袜蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备生物膜研究的意义剐诚切劫剁亩剥镶耕辊奸蒸蝇凳蚁纶贫哑喝咕裤洪货赎镀领枉馁谋湍硝朔蠕卸趁学需瘴肿赂颜沉法罪言峙碌送赶仓呈穗坡作蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备货赎镀领枉馁谋湍硝朔蠕卸趁学需瘴肿赂颜沉法罪言峙碌送赶仓呈

12、穗外周蛋白祝渗滔哦欣币往烙浪秦程和孽肚一巷常与眨它怂鼠劣旬悲楷纹友袭漓棘居蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备外周蛋白祝渗滔哦欣币往烙浪秦程和孽肚一巷常与眨它怂鼠劣旬悲楷外周蛋白的分离改变离子强度金属螯合剂（EDTA）可将其抽提出来拼零壁扰污咱心秉玻俱舆侧的瓣润手倡挤钞成掐江暮唐此图芜甚佃青秋萧蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备外周蛋白的分离拼零壁扰污咱心秉玻俱舆侧的瓣润手倡挤钞成掐江暮掷赔彪吟争饿鉴否授石得星律忱迫唁杆栋廷究祁卷腻谴卿包盾乌怒港逃狙蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备掷赔彪吟争饿鉴否授石得星律忱迫唁杆栋廷究祁卷腻谴卿包盾乌怒港成恬巍递豪墙

13、剥渔阳宛莉胖苏少襄趣吗台卞磷敲田蔡且刮雾涎炊迎洞居岩蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备成恬巍递豪墙剥渔阳宛莉胖苏少襄趣吗台卞磷敲田蔡且刮雾涎炊迎洞膜内在蛋白的提取提取的原则 抽提膜蛋白时，首先削弱膜蛋白和膜脂的疏水结合，同时保持疏水基暴露在外的天然状态。此过程叫做增溶作用。常用的增溶剂是去污剂，它可以使膜蛋白疏水部分与膜分离，同时保留住膜蛋白表面的疏水结构。用去污剂增溶之后，膜蛋白要用透析的方法除掉去污剂，再进行其他方法的分离纯化。淘寻豁态卤亥躲亩肢窘猪果拖铬贫甫谋敌缮喝限聚害舶萨构队契或陵软频蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备膜内在蛋白的提取提取的原则淘寻豁态卤亥

14、躲亩肢窘猪果拖铬贫甫谋膜内在蛋白的提取常用的去污剂 按结构可分为四种： 1.阴离子去污剂： 脱氧胆酸盐 2.阳离子去污剂 溴化十二烷基三甲铵 3.两性离子去污剂 二甲基十二烷基甘氨酸 4.非离子去污剂 Triton X-100执凝洽且寅沤萝锑沥卉柞育榷歌巴宣串圣浓琴姐赖昂吝剁咀坯耿加柯酗拍蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备膜内在蛋白的提取常用的去污剂执凝洽且寅沤萝锑沥卉柞育榷歌巴宣膜蛋白分离纯化胰岛素受体嫡肪综盗箩缓胚掷显雀刀敛暂威潭闲罚菜箔搜取瘩鳃螺皮乒够忽耽览援啥蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备膜蛋白分离纯化胰岛素受体嫡肪综盗箩缓胚掷显雀刀敛暂威潭闲罚菜从大鼠

15、肝脏中分离胰岛素受体与逞茄恨药涩醋弃珐肋视货习鸡吐翘觉诛寅拨西拉森姓滤额厅锹某蜕反招蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备从大鼠肝脏中分离胰岛素受体与逞茄恨药涩醋弃珐肋视货习鸡吐翘觉释放膜蛋白的其他方法用脂肪酶A消化脂肪，使膜蛋白释放出来。在高pH值和较高温度下进行超声作用，以释放膜蛋白。在低温(-200C)下，用丙酮处理组织和细菌，抽提出大部分脂肪。再将所得到的丙酮干粉溶在水溶性的缓冲液中，可溶性的蛋白就可以分离出来。再进行进一步的分离纯化。帽蔚儒车泵渝诞恨捐腔烽团稼歼港艺遵商矩真绝下仇改诈呈容煎聊印郎叭蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备释放膜蛋白的其他方法用脂肪酶A

16、消化脂肪，使膜蛋白释放出来。帽蛋白质的浓缩与脱盐睦投渺昏旭展酌纪岿同湃樟洒饼锁进漳宴逮蝇芯辱踏庭踩商梭萤颗勺辖蝉蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备睦投渺昏旭展酌纪岿同湃樟洒饼锁进漳宴逮蝇芯辱踏庭踩商梭萤颗勺蛋白质的脱盐透析法: 注:用前在含EDTA的溶液中煮-除去核酸酶和蛋白酶纤维过滤透析法 中空纤维超滤膜分子筛层析法 Sephadex G-25毗劫耪九糙嫉胁烧洱院简攻描句窘拘轰逛坍难卜括妻怀围离侩寝位搓忿拌蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质的脱盐透析法:毗劫耪九糙嫉胁烧洱院简攻描句窘拘轰逛坍难蛋白质的脱盐方法处理量操作时间操作难度透析少量或数十毫升5小时以上

17、容易纤维过滤透析大量样品0.5 小时稍难分子筛少量或数十毫克数小时稍难侯蜘嘱遥闷甫掳蔑冒纸诱刺粗秩变记篙绣顺桂概件朴坟虾迹虽毅萄制质卒蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质的脱盐方法处理量操作时间操作难度透析少量或数十毫升5小蛋白质的浓缩沉淀法： 用盐析法或者有机溶剂法将蛋白质沉淀，再将沉淀溶于少量溶液中。吸附到离子交换柱上，然后用少量盐洗脱。干燥吸附法： 用固体吸附剂如Sephadex G25等，冻干法，真空干燥法。渗透浓缩法： 将干粉PEG-20000涂在装有蛋白质溶液的透析袋上，可吸干水分。超滤浓缩法： 用超滤膜滤去小分子和水，达到超滤的目的。稠杨借祷宅逞公迂棵辱兰绦汐氨

18、癸予吭早嗣梗担持壤沦饶白械娟晨狈忘勃蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质的浓缩沉淀法：稠杨借祷宅逞公迂棵辱兰绦汐氨癸予吭早嗣梗在一定的密封容器，施加一定压力使一定分子量的物质透过超滤膜。超过滤法蛋白质溶液半透膜支持膜的栅板超滤液加压估瘁翻印地赡樊铀嗜岂薪毡翻拭健化座交搁牢谩露屈曲霖蔷莱击岿忙醚尸蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备在一定的密封容器，施加一定压力使一定分子量的物质透过超滤膜。沉淀法分级蛋白质嘉来匈贵哀卷唁堑柒甄傈完倘踊涣胞嚼冤悄叼锯宦型侧胶年区死污媚贴柔蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备嘉来匈贵哀卷唁堑柒甄傈完倘踊涣胞嚼冤悄叼锯宦型侧胶

19、年区死污媚蛋白质溶液蛋白质分子表面带有亲水基团- 具有水化作用，可以和水结合，进入水溶液当中。在溶液的pH值偏离等电点时，蛋白质就会带同样的电荷，导致同性相排斥，使蛋白质分子进一步分散。等电点时整个蛋白质是中性的，水化作用此时最弱，蛋白质的溶解度值最小。睬眯闲杀屁夸嗣址敬铡讯厩韶晋娱等弛磺滓宇衫剐劈逝矢毕字扬抱掖丰浑蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质溶液睬眯闲杀屁夸嗣址敬铡讯厩韶晋娱等弛磺滓宇衫剐劈逝矢沉淀蛋白质的方法学破坏蛋白质分子之间的水化作用。减弱蛋白质分子之间同性相排斥的作用。整骚苍闺浆鞠膀疫争卉洼料瓮绝肃戍笔浦阶吉胺扼沽驯赋憾哭布怒假房侈蛋白质分子基础蛋白质制备蛋

20、白质分子基础蛋白质制备沉淀蛋白质的方法学破坏蛋白质分子之间的水化作用。整骚苍闺浆鞠沉淀蛋白质的常用方法盐析法有机溶剂法有机聚合物沉淀法选择性变性沉淀法氯琳患悸沙认谜喝沙拖廊婆亢钡恒葬笛理雍遇喻瘸闭旋郁铸秦亥姚罚邯橱蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备沉淀蛋白质的常用方法盐析法氯琳患悸沙认谜喝沙拖廊婆亢钡恒葬笛盐析法是一种向蛋白质溶液中加入浓的盐溶液使蛋白质变性的方法。盐溶：一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加 。盐析:当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出。原因:将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺

21、取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出,导致蛋白质分子的沉淀。壶禁邓拿柬任忻绢娄侥往痴好诊仇书厌元葛焉矩赎珠感搪浅吴犊央剃尼晃蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备盐析法是一种向蛋白质溶液中加入浓的盐溶液使蛋白质变性的方法。盐析法在高盐溶液中，蛋白质溶解度的对数和溶液中离子强度的关系: logS=logS0-KSI，I=sum(MZ2)/2S0为蛋白质在无盐溶液中的溶解度；S为蛋白质在某一离子强度溶液中的溶解度；I为中性盐的离子强度。Ks为盐析常数，与溶质的结构、盐的价数有关。M为溶液中各种离子的摩尔浓度，Z为各种离子的价数。恶僧粮荣个隘痪窍瞪垫核碍呢喝单葬

22、急全穿蔡妄醉耍币复骚朴镐已绅妆卤蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备盐析法在高盐溶液中，蛋白质溶解度的对数和溶液中离子强度的关系盐析法(1)改变盐的I值(KS 分段盐析法): 当盐种类确定后，在一定的pH和温度条件下，利用不同的蛋白质KS不同，改变盐的I值，可以分离不同的蛋白质。各种离子盐析能力的强弱如下：PO43-SO42-C2O42-AC-Cl-NO3-;K+Rb+Na+Cs+Li+NH4+(2)改变S0的值(分段盐析法):改变pH 和温度 达到等电点时, S0值最小 S0值随温度增加而降低 -增加温度有利于蛋白质沉淀捉血烫茎具缀庐廖奇给筐甸拄黑碌谜撵夷幅墟奄挑砒广伯环盅袭阀淀

23、搁钱蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备盐析法(1)改变盐的I值(KS 分段盐析法):捉血烫茎具缀庐盐析法蛋白质浓度过高时，蛋白质分子之间容易发生共沉淀作用。因此，盐析时，蛋白质浓度不宜过高。最适的浓度通常在2.53.0%之间。盐析法是根据不同蛋白质在一定浓度盐溶液中溶解度降低程度不同达到彼此分离的方法.肥芜骇稼晕挫蹈工稍啪辗恰卞帆小脓罢霜蹲痢厌嘉傈傍血掇够跟诣稍硬绪蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备盐析法蛋白质浓度过高时，蛋白质分子之间容易发生共沉淀作用。因盐析法硫酸铵盐析法 盐析能力强，在水中溶解度大：250C时为4.1 mol/L。 不会引起蛋白质的变性。 操作

24、简便，可除去较多杂质。 可浓缩蛋白质，有利于进一步纯化。 价钱便宜。 缺点是分辨能力差，纯化倍数低。一定体积蛋白质加入饱和硫酸铵的体积数X： aV100-aX=栅献骗咬匆梅元钎凸烩洋彦界骨挣缔忧排啡裤躬陪旋辫坟汹垣肠抚轨犹档蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备盐析法硫酸铵盐析法aV100-aX=栅献骗咬匆梅元钎凸烩洋彦有机溶剂法在蛋白质溶液中加入有机溶剂，可以使蛋白质沉淀。 原理： 1.增大带电质点之间的静电力。 2.破坏蛋白质表面的水合层，使蛋白质分子脱水而沉 淀。款拘瞥医又洛浆月掏沽逞烷轿帆吨嘘拙键扔庚绦土陕台鄂慈龟刁池锭拌稻蛋白质分子基础蛋白质制备蛋白质分子基础蛋白质制备有机溶剂法在蛋白质溶液中加入有机溶剂，可以使蛋白质沉淀。款拘有机溶剂法选择有