基因工程基本原理简介课件

1、第十章 基因工程基本原理简介本章的重点内容： 1. 什么是基因工程？ 2. 获得目的基因的方法有哪些？ 3. 如何根据蛋白质氨基酸序列获得其基因？ 4. 基因工程中的最新技术。第一节 基因工程原理简介一、基因工程的定义 本义：根据人们的意愿，利用工程设计的方法，在体外将克隆获得的目的基因与适当的载体进行切割和连接，构建成正确的重组表达载体，再应用物理的、化学的或生物学的方法将该表达载体导入到细菌、动植物细胞或受精卵中，使目的基因在宿主体内以瞬时方式或稳定方式进行表达，借此研究目的基因/DNA片段的结构与功能，或获得该基因的表达产物。这一过程就是基因工程。 广义：转基因动物；克隆；基因打靶；基因

2、组计划等均属于基因工程的范畴。目的基因获得表达载体构建基因的导入表达的鉴定核酸鉴定：PCR; Southern and Northern blot.蛋白鉴定：SDS; HPLC; Western blot.功能检测：机体生理生化功能、性状的改变。原核:包涵体,分泌型真核:文库合成PCR基因组文库cDNA文库细菌：氯化钙；电穿孔;细胞：磷酸钙；脂质体；电穿孔；微注射；V;动物：微注射；电穿孔；精子；ESC；RT-V；载体质粒(plasmid)粘粒(cosmid)噬菌体()第二节 基因工程的基本步骤和方法第三节 基因工程中的通用技术一、核酸的提取纯化与定量 包括RNA、 DNA及plasmid D

3、NA的提取纯化技术 二、核酸电泳技术 1. 琼脂糖凝胶电泳 2. SDS500200010007501002001 DL2000 marker2 BamH1和EcoRI双切3 BamH1单切4 Hind单切5 重组质粒pVAX1/ABPS1 1 2 3 4 5四、Western blot: Protein一、获得目的基因的方法 基因文库（cDNA文库和基因组文库），化学合成，PCR 等方法。还有DD-PCR以及基因芯片等技术。（一）基因组文库 目的：种质资源的保护；基因组测序；基因组基因或调控序列的克隆等。第四节 基因工程中的常用技术启动子克隆一般思路启动子区杂交增强子调控启动子核心启动子基因

4、3 5转录起始点探针+50-40ATG-4000-500功能 分析 克隆启动子实验一、家蝇部分基因组文库的构建 1 材料与方法 1.1 家蝇基因组DNA的提取 2.1 基因组DNA的部分酶切 3.1 EMBL3载体臂的制备 4.1 连接与包装 5.1 基因组文库鉴定 Bcl I随机酶切 左臂 基因组DNA 右臂 left arm（20kb）central stuff 14kbright arm9kbEcoR IBamH ISal IBamHSal IEcoR I基因组DNABamH I+CIPBcl IBcl IBamH IBamH I包装转化KW251噬菌斑 1023kb包装蛋白实验一、技术

5、路线图重组噬菌体收集噬菌体液基因组文库Fig.2 Digestion of genomic DNA by Bcl I1. 5U/ugDNA Bcl I ，2. 2.5U/ugDNA Bcl I3. 1.25 U/ugDNA Bcl I4. Lamba DNA/Hind Marker图2. 基因组DNA Bcl I 酶切电泳23kb 9.4kb1 2 3 4Fig.3 Electrophoresis of recover products of 1023kb DNA fragments 1. Bcl I 酶切纯化片段 2. Lamba DNA/Hind Marker图3. 1023kb DNA片

6、段回收产物电泳23kb9.4kb 1 2 实验一结果2.2 家蝇基因组DNA酶切和纯化纯化了1023kb的Bcl I酶切DNA片段实验二、 家蝇卵黄蛋白基因组基因的克隆和序列分析 实验二结果GCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGATCGAA CAAGAAGTCA CCGTTTTCATCACCGGTCTG CCCCAGTCCTTGGAGGATGTGAAAAAGGCCAACACCAAATTGATCCAGTCCTACATTCAACGTTACAGCAAAAAACCCGAAGCACCCCAGGGTGAGGATCAATCGAAATGGGAAAATGAAAAACCTGTGGGCGGTCATTTGG

7、TTGTCATCGATTTGGGCCATGCCATCACCAATGTGGAACGTTATGCCACTTTGAATGTCAAGGAGACCGGTAAAATGATTGGCAAGACCTTGGCCGAGTTGGAGAGGGAAAGCAATGTCGATTTGGAAGATCTCCATGTCATTGGTCAGGGTATTGGTGCCAATGTTGCCGGTGCTGCTGGTAAGGCTTTCAAGGACATTACCACCCACAAATTGGATCGCATTACTGCCTTGGACCCTGCCAGCCAAATGGCCAAGGATCCCAAAGTTTTGACCGGTTTGTCTCGTGGCAGTGCCAAAT

8、TCGTTGATGCCATCCACACCTCCGCCTTGGGTATGGGCACCACCCGTCGTGTTGGTGATGTTGATTTCTTCCCCAATGGACCATGCCAAGGTGTTCCCGGTAGCCGCAATGCCATCGATGCCCAAGCTCGTGCCACACGTCTCTTTGCCGAAACAGTTCGTCCCGGTAACAGCCGCAATTTCCCTGCCGTTGAGGCCAGCTCTTTGAAACAGTACCGCAACAATGATGGCTATGGCAAACGCACCTACATGGGCATTGCCACCCATCGTGACATCTCCGGTGACTACATGTTGGAGGTTA

9、AATCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGC卵黄蛋白基因部分DNA片段特异性探针序列2.1 特异性探针制备 制备了大小为768bp的地高辛标记的DNA片段特异性探针，工作浓度为1：2000。实验二结果2.2 阳性克隆的筛选和纯化1# positive clone（about 2000 plaques/plate）Fig.3 Screening result of 1st round situ hybridization图3 第一次噬菌斑原位杂交筛选结果YP1 2# positive clone（about

10、200 plaques/plate）Fig.4 Screening result of 2nd round situ hybridization图4 第二次噬菌斑原位杂交筛选结果Numbers：11 positive clone（11 plaques/plate）Fig.5 Screening result of 3rd round situ hybridization图5 第三次噬菌斑原位杂交筛选结果获得了含家蝇卵黄蛋白基因的阳性克隆2.0 2.3 4.4 6.6 9.423 1.4 1.6 2.0 3.5 4.3 5.0 21 1 2 3 4 5 6 kb kb Fig.6 Digesti

11、on analysis of recombinant -DNA of positive plaque图6 阳性克隆-DNA的酶切分析实验二结果2.3 mdYP基因组基因的克隆1:Lambda DNA/Hind Marker 2: Xho, 3: Xho/Hind , 4: Hind , 5: Sal6:DNA/EcoR+Hind Marker3.5 kb 1 2 4 1:Xho I，2:Hind 3:Xho/Hind Fig.7 Southern blot of recombinant -DNA of positive plaque with mdYP1 DNA probe DIG-label

12、ed 图7 阳性克隆-DNA的 Southern blot实验二结果2.3 mdYP基因组基因的克隆 1 ACAGAATTTGCTATTTAGGTCTTATATTTCTCAGAGCAAAGAGCTGGGCTGCAGAGAGATTTATGACAACGCCGTTGTGTGGTGTATGTATATAGAAAGA 100 101 ATAGAAGAATTACTTTNCTTAGTTGTTTTTTAAATAATCCTGTCCAACAAATGTGTCCAATCCAATTCTTGTTTTATTGGTTTTATCCCTCCTTAATATT 200 201 AATCTTTTTGGTCTTATTGAATAATTATT

13、GATTGTGGTGATTGCTGTCTCTACTTCGTTTGGTTTGGTTTGGTTGTCAGTTGCGAACGTTGGAAACAAAA 300 301 ATGAAAAACGTCCCAACGAAACGAATATGAAGGCCACAAAGGAATACCCGATAAAAAATAAACAGAAAGCAAAGACTCCGGGTACTCTGTTGTTTACGAA 400 401 TGAGACATGAGAGAATTGAACATCTTCACTAAAGAGCTCGGAATTAGTTACAAATTAAATTGAATTCGACGGTGCGGTGGCGACATGACAGACGGACGGGT 500 501 T

14、GATGGATAGATAACGGCGTTGAGAGTGAATGTGTTGGCGTCTTGTCTCTATTGCAGGGTGATTCATATATTAGAAAATTTACAATGGAAAAGTGGTTAT 600 601 TTTAAATAAGAAATAATATATATATGATATATATGATGTTTGGGGAAAAAATATGAAAAGATTACACTCTTACCTCATTATCTTTACTAAAAAAGGTATT 700 701 TTATGTATAAAAGGCTTGCAAAGTCGAAGTCTATTCACAAAAGATTCGAAAACGGTAATAAATGATCCTTCAGCAAAATATTA

15、TTGGACAGTATTGGACA 800 801 ATTCAACGATAAAAAAGTCACATTAAAAAGTGCTTTAAAAATAATGGCGGTTGACTTTTTTGCAGTTTTTTTTTTATCTTACCCTTTATGTCTAAAACGG 900 901 ACATTTTCAAAGGAACCTTATTCTAAAAATCTCAAAATATATGGAAGAGGGGGTAACTTTCCTCCTCTATTTAGGTTACTTTCCGATGTAAATTTTCAAA 10001001 ACGCCATTACATTTGTCTTCTATTTTTAGCCCTACTTTCATAATCTACTAGATTA

16、TTTCAGTATTTTTTTGCACAGTGCAGGTGATGATATTGGATAATT 11001101 CTTATTGAGGAAAAAATTCCCCAGTAAGAATGGAGAATCGGGTTATGAAACAAGATTTTTTAATAATTTCATTAATTATTTATTTTTTGNTTCTATGATT 12001201 TTGTGTTTTTTTTTTTTTTTGAATATTATTTTGAAATAAAGTGAAATCGAAATCTTCTCCTTTTTAGGTTATTGATCTAAAATACAAGGCTATTGCCAAA 13001301 ATCATGTAATACAATATTTGCTGAA

17、ATAGGCCAAATCACTTCTCGCCCTCCGTTCTATTTTTGATGACAGTGAAGCATTATGCAAGCTTGTTTCAATTCT 14001401 CCCGCTTATCGTCACAACCTCTACAGATTTTGCAATTTACGTAAAGAAAAAGAAAAACGGCAAAATATTGAAAATGAAAATCAGCAAAAATCAAAAAAAT 15001501 TATCAGCAGTTCTCGCTGGACTCACCTGACGGTCTGATTAACTATTTTGCTGTGAAATGTTAAATTTATTTGATATAAATACCCCCAGTGGAAGCCAGTG 1600

18、1601 GAGGGTACATTTCACAAGTTAGAACATTCGGCTTAAGAAGTGCCCGTACGACTTTGGGAATTTTTGAAACTGACCGACAGAAGGATGAATCCATTGGGAG 17001701 TTTTGTGCTTTGTAGCCTTTGTGGCTGCCGGCGCCTTGGCCTCACAATCGCAGGACTACAGTCCAAAGCCAGCACATTGGCTGAAACCCACCGAATTGGA 18001801 GGCCACACCATCTTTGAATGAGCTCACCTTTGAGCAGCTGGAGAATATGCCATTGGAAAAGGGAGCCAAATTGAT

19、GCGTAAACTCTGTAAGTAGCCAGTC 19001901 AAGAATTTGGAAAAGACCTCCAATAATACAATTTCTCTCTTCTCTAGACCACCTGTCCCAAATCGACTACTCTGTGTCGCCCAACTTTGTGCCCAGTCCC 20002001 AGCAATGTCCCCGTCTACATTTTCAACAGCAAGGGTGAAAAAGAAACCTGCAACTTGAACAACTACGTCGACATTGCCAAGGAAAAGCCGAAATTTGGCG 2100 获得了全长3991bp的基因组序列，包含1.7kb卵黄蛋白基因组基因及其5-调控区序列。2101

20、AACAAGAAGTCACCGTTTTCATCACCGGTCTGCCCCAGTCCTTGGAGGATGTGAAAAAGGCCAACACCAAATTGATCCAGTCCTACATTCAACGTTACAG 22002201 CAAAAAACCCGAAGCACCCCAGGGTGAGGATCAATCGAAATGGGAAAATGAAAAACCTGTGGGCGGTCATTTGGTTGTCATCGATTTGGGCCATGCCATC 23002301 ACCAATGTGGAACGTTATGCCACTTTGAATGTCAAGGAGACCGGTAAAATGATTGGCAAGACCTTGGCTGAGTTGGAGAG

21、GGAAAGCAATGTCGATTTGG 24002401 AAGATCTCCATGTCATTGGTCAGGGTATTGGTGCCAATGTTGCCGGTGCTGCTGGTAAGGCTTTCAAGGACATTACCACCCACAAATTGGATCGCATTAC 25002501 TGCCTTGGACCCTGCCAGCCAAATGGCCAAGGATCCCAAAGTTTTGACCGGTTTGTCTCGTGGCAGTGCCAAATTCGTTGATGCCATCCACACCTCCGCC 26002601 TTGGGTATGGGCACCACCCGTCGTGTTGGTGATGTTGATTTCTTCCCCAA

22、TGGACCATGCCAAGGTGTTCCCGGTAGCCGCAATGCCATCGATGCCCAAG 27002701 CTCGTGCCACACGTCTCTTTGCCGAAACAGTTCGTCCCGGTAACAGCCGCAATTTCCCTGCCGTTGAGGCCAGCTCTTTGAAACAGTACCGCAACAATGA 28002801 TGGCTATGGCAAACGCACCTACATGGGCATTGCCACCCATCGTGACATCTCCGGTGACTACATGTTGGAGGTCAACGCCGAGAGCCCCTATGGCAAGAGA 29002901 ACTCCCGCCCGCAAACAAAA

23、ATCATACCATGGTGTTCATCAAACTTCCTATGCCAAAAGCAACGAAAACTATTAGAACGTTGGATGTTTGGCAAAAGAAA 30003001 AAGATTCTTTGGAAATGACTCCGAAAAAATTAAGCTGTGAATATTTGTCGAACGAAAACAGAAAAAAAAAACATCGAAGATAAATTATTGATTATTTAAT 31003101 TAAAAAAAAAAAAAAAAATAAGACTCTGAACATTACAAAAAGGAAATATTTATTTGAATTTTTATTCTTAGAGGATCGGGCGGGATAAACAAGATTATTA

24、 32003201 AAGAAGGGCTAAAAATATAAGACAAGTGCGTCGGCGTTTTGAAAATGTACATGGCAAAGTAACCTAAATAGAGGCGCAAAGTTCCTCCTCTTCCCCATTT 33003301 TTAGAAATTTCGTTTCATAATATGTACAGGGTGAGATAAAAAAAAACTGCAACAAAGTCAAACGCTATAATTTTTATTTTTTTTTTAATTTTATTTATTG 34003401 AAAGCAAAAAATGTCGGAAATAGCATCAAATTTTAGAATATATTTAGTGTACAAGTTCCAATACCGTCGT

25、ATGGACTTGTTGTGGTTCAAATTCTACTGA 35003501 GTAGATTTTGAGCCGGAATTTATTGTTGCACAAAGACGAACAACAATATTGTTTAGCAAACTACAAACAAACACAAAAGTATTCTGACGATACTTACGTT 36003601 TGTTGTCTGCACAAAAGAAAAAGCACTTTAATAATTAGTATTTCAAAGTTGAAAATGACTCAGTCGGTCAAATTTTTATTTTATAAAAAAATTCACAATT 37003701 TTGATCTGGCGATCCACTTTTCTGAACTTCAAGAAGAAGA

26、GTGCCGTTTTTAGTTTTGTGACGACATCGATAGTTTTTATTTATCGAGATCGATTAGATC 38003801 CATGTCGATGTCGTCATCTATCGGGTTGGGTCTATTCCCAACATGCCGGGCCCCTTGCACTGGTGCACAGTTAATGCCGTTGCTATTTTTTCAAGCACGC 39003901 TCAGGAACCTGTCCATCATCTCTGGCTGCTGCATTAAGGACTTTCCTTCGGGTTTTAATTCGGGCTGTTGTGCGGTATGTCGACTTTGTTG 3991Fig.3 The sequence of Mu

27、sca domestica YP1 gene containing 1.7kb 5flanking region. The intron region(18861947) is marked by underlining, the TATA box or the AATAA signal is in bold, The translation initiation codon ATG or translation termination codon TAG is indicated by an open box。图3. 卵黄蛋白基因组基因全序列实验三、 家蝇卵黄蛋白基因启动子片段的 克隆与功能

28、分析 表达质粒构建TATAHind IIIP2P3TATAHind IIIHind III 酶切P5P6补平T4 Ligase鉴 定电转移转染pMYP1-GFPpMYP2-GFPpMYP3-GFPpMYP4-GFPpMYP5-GFPpMYP6-GFP转染Sf9昆虫细胞BHK-21细胞家蝇卵绿色荧光蛋白启动子活性荧光显微镜荧光显微镜家蝇早期胚胎转基因前后的差异表达研究2. DD-PCR技术 5NMAAAAAAAAAAAAAn细胞总RNA或poly(A)RNA 5NMAAAAAAAAAAAAAn cDNA 3N M TTTTTTTTTTTT 简并锚定引物 进行PCR 随机十聚体 NNNNNNNNN

29、N NMTTTTTTTTTTTT持续循环 NNNNNNNNNN NMTTTTTTTTTTTT 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳样品A 样品B作Northern探针作cDNA文库筛选探针作亚克隆和测序样品反转录反应切取目的带,重新扩增,回收纯化 图3. 家蝇早期胚胎转基因前后DD-PCR结果 1、3、5转基因处理组T11MA-AP1、T11MA-AP3、T11MA-AP42、4、6对照组 T11A-AP1、T11MA-AP3、T11MA-AP4 图4. 差异片段的二次PCR回收结果 1DD-frag-62DD-frag-53DD-frag-3MDL2000 Marker DD-frag-3：355 nt

30、GGTACTCCAGTACAACTGATATCGTATGTTGAAATTCCTGCCGTGAGCAAAGCTCCCTTTGTAATAATCAGTACCCAAGAACAGGCAAACAAATAAATAACAGTTCTAAGTGAAATAACTGATGATCTACTATACAAAACTTATAAAGAGATAATAAGGTATTCGGTAATAAAATAAAAAAATAGTAAAGGTGGGTTCTTACTAATTATTCATTCAATAATAATAATCGAATGTATTACTGCTCCCTAAATCAACTAAACAGTTCTAATAGAGTTGAGGGAATGCATGCAGTAATATTCC

31、TGTTGTAAAATTGAATGAAGCTCCAAACCTGTTCCAATGCAGGAGTATATCTGGA DD-frag-5：432 nt GCAATCGATGTACGATGTTTAACAACAACAAGAGTAATTACACTTTCAATTTTCACTTGTCTAACCAAAATTCATGTTGTATGAATGTCAAAAAGAAAAGACGACGGGTAACAAAAATCGAAAGTGAGCAACAATCGATTCTGGTGACGACAAAATTCTTAAGCAAGAAATCATCATCTTAAGAACGAAACAACTCATTGACCTAGAATGTTGATTGACAACTTAAT

32、GCTTCACCACTAGACATTACTCGTCAGCTGGTTACATCGATTGTTAAACGTTTTCAAATCGAAACACTAGAAGATGGATAACCCGTGATTGGCTTTTCGTATTAAAGATAGATGTAAATCAACCGCGAATTGTTCAACAACAACCAAGCAAAGGAATCAACTGAACACATATCAAAGAGTGTTTGGCACTTTATATAAATACTT DD-frag-6：240 ntGCAATCGATGTCACGATCGTAAGCGTTAACCAAAATTGCGTCCTCTAGAGATAGTATTCAACAAGCGATAATGGCCGTACTGAGGCAAATCTTTGTCATTCCCAAAAGTATGTTTCAGAAGCACCTTGGTAATAGTGCAAAATATAGGCCTTATTGAATTTTGACGAAATCTCTTTCATGATTTTAGTGCATCGATTGCATACAAACGCTCTTTTGTAAGC