14第十四章核酸的理化性质

1、第十四章 核酸的物理化学性质生物化学一、酸水解二、碱水解 三、酶水解第一节核酸的水解1.糖苷键和磷酸酯键都能被酸水解 2.但糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解 3.嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳定 戊糖碱基磷酸 嘌呤碱的糖苷键嘧啶碱的糖苷键磷酸酯键一、酸水解RNA的磷酸酯键易被碱水解；而DNA对碱稳定RNA的磷酸酯键易被碱水解的原因是由于RNA核糖基上有2-OH,在碱作用下形成磷酸三酯。磷酸三酯极不稳定，随即水解，最终水解产生2-核苷酸和3-核苷酸生理意义：DNA更稳定 ，遗传信息。RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。二、碱水解 在RNA水解时，2-OH首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的

2、同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。水解磷酸二酯键的酶：非特异性水解磷酸二酯键-磷酸二酯酶专一水解核酸的磷酸二酯酶-核酸酶牛脾磷酸二酯酶产生3-磷酸核苷酸蛇毒磷酸二酯酶产生5-磷酸核苷酸三、酶水解蛇毒磷酸二酯酶牛脾磷酸二酯酶磷酸二酯酶（非专一性外切酶）识别5末端识别5-OH形成的磷酸酯键产生3核苷酸识别3末端识别3-OH形成的磷酸酯键产生5核苷酸（1）按底物专一性分核糖核酸酶(RNase)：作用于RNA脱氧核糖核酸酶(DNase)：作用于DNA。 （2）按对底物作用的方式核酸内切酶(endonuclease)核酸外切酶(exonuclease) 既可内切也能外切的核酸酶(方向性3

3、5或5 3)1.核酸酶的分类 在3-OH与磷酸基之间断裂，产生5-核苷酸在5-OH与磷酸基之间断裂 ，产生3-核苷酸其它：如双链酶、单链酶等（3）按磷酸二酯键断裂的方式 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（通常为回文序列），并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 2.限制性核酸内切酶限制性内切酶的特征 具有严格的碱基专一性，有专一的识别顺序、切点 形成的产物具有 粘性末端或者平整末端第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。核酸内切限制酶命名Hin d 属 种 株 序Haemophilus

4、influenzae d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶以限制性内切酶及连结酶进行核酸剪接GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCGAATTCGGCTTAAGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCGEcoRIDNA LigaseEcoRI sticky endEcoRI sticky endG AATTCCTTAA GJuang RH (2004) BCbasics目标基因殖入质粒并转化宿主菌1 plasmid限制酶限制酶染色目标基因体重组 基因目标基因殖入质粒细胞转化宿主菌1 cell重组质粒转化宿主Juang RH (2004) BCbasics第三节核酸的

5、紫外吸收 在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，最大吸收峰波长在260nm处，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。1、判断核酸样品的纯度（1.65-1.85）若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。2、 DNA或RNA的定量测定第四节 核酸的性质DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0OD260=1.0相当于50g/ml双链DNA40g/ml单链DNA（或RNA）20g/ml寡核苷酸3、判断DNA是否变性在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应）在DNA的复性过程

6、中，摩尔吸光系数减小（减色效应） 有时核酸溶液的紫外吸收以摩尔磷的吸光度来表示。摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。先测定核酸溶液中的磷含量及紫外吸收值，然后求出摩尔磷吸光系数。 式中A为测得的吸光度，c为磷的浓度，L为比色杯的厚度。 单链核酸的(P)比双链核酸的大，核苷酸单体的(P)更大。双链DNA变性成单链后(P)值增大，称为增色效应；复性后(P)值减小，称为减色效应。 (p) = A/cL核苷酸单链双螺旋； RNADNA 一、变性二、复性三、核酸的杂交第四节核酸的变性、复性及杂交一、变性变性与降解的区别：是否涉及共价键的断裂和分子量的改变降解：核苷酸骨架上3，5 -磷酸二酯键的断裂变性：在某些理化

7、因素作用下，核酸双螺旋区的氢键断裂，使变成单链，并不涉及共价键的断裂的过程。因素：酸 碱：酸碱变性 加 热：热变性 变性试剂：如尿素、甲醛等。DNA变性的本质是双链间氢键的断裂 OD260增高 粘度下降 比旋度下降 浮力密度升高 酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失变性后理化性质变化变性引起紫外吸收值的改变DNA的紫外吸收光谱Tm：DNA的变性作用发生在一个相当窄的温度范围内，有一个相变的过程。通常把加热变性使DNA双螺旋结构失去一半时的温称为DNA的熔解温度(Tm)。变性的特点：爆发式DNA的Tm值一般在8295之间 TmTm（1）DNA的均一性越均一，DNA熔解温度发生在一个很窄的温度范围之内影

8、响Tm值的因素（2）介质中的离子强度介质中的离子强度：一般说离子强度低时Tm低，变性温度范围较宽；离子强度高时Tm高，变性温度范围较窄。 （3）G-C含量的影响GC含量：GC之间有3个氢键，所以GC含量越高Tm越高。通过测定Tm值，可以推算出DNA中GC的含量。二、复性在适当条件下，变性DNA的两条彼此分开的链可重新缔合成为双螺旋构象，这一过程称为复性。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火。 热变性DNA在缓慢冷却时可以复性(退火) ， 快速冷却不能复性（淬灭）。 DNA片段越大，复性越慢； DNA浓度越大，复性越快。 DNA的复性也与它本身的组成和结构有关。影响复性速度的因素

9、三、核酸的杂交热变性的DNA单链，在复性时并不一定与同源DNA互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列的异源DNA单链形成双螺旋结构，叫核酸杂交。 *两条来源不同的核酸单链间，因部分碱基互补，经退火处理可以形成杂交双螺旋结构。如DNA/DNA、DNA/RNA、RNA/RNA杂交分子。Southern blotting （Southern印迹法）：DNA-DNA杂交Northern blotting （Northern印迹法）：DNA-RNA杂交Western blotting （Western印迹法）：抗原-抗体结合 Southern印迹杂交将在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过与标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段。由于它是由ESouthern于1975年首先设计出来的，故叫做Southern DNA印迹转移技术。探针：作为检测用的已知DNA序列或RNA序列的片段。用32P、35S或生物素等标记。Northern blotting 1979年，发展出了一种新的方法，将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其它化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。这种方法同DNA印迹杂交技术十分类似。 Northern blot：用于检测RNAWestern b