β射线内照射对人增生前列腺细胞凋亡的阻碍

1、射线内照射对人增生前列腺细胞凋亡的阻碍谷欣权 曹霞 孔祥波 马庆杰【摘要】 目的 探讨射线内照射对人增生前列腺细胞凋亡的阻碍。方式 20 例前列腺增生 (BPH)患者随机分为 4 组：对照组未行内照射， 3 组照射组于前列腺切除术前 1，4，7 d 行 90Sr/90Y 射线内照射，采纳 TUNEL染色、流式细胞术和琼脂糖凝胶电泳检测前列腺细胞凋亡转变。结果 与对照组比较， 射线内照射后前列腺细胞凋亡增多，并随时刻延长而增加（ P），对照组基因组DNA维持完整，射线辐射7 d 后基因组 DNA呈现梯状带凋亡改变。结论射线内照射能够有效诱发人增生的前列腺细胞凋亡，进而引发前列腺组织萎缩。【关键词

2、】前列腺增生；电离辐射；细胞凋亡【 Abstract】ObjectiveTo investigatetheeffectofirradiation on cell apoptosis in human hyperplastic prostatictissues.Methods 20 patientswithbenign prostatichyperplasia(BPH) were dividedinto4 groups accordingto the differenttimetreated with 90Sr/90Y irradiation to prostatic hyperplasia a

3、pplicator before prostatectomy or TURP. The cell apoptosis of humanhyperplastic prostatic tissues was detected by TUNELandflow cytometryand agarose gelCompared with control group, thepercentageofcellapoptosisarose aftertreatedwith90Sr/90Y irradiation and grew more with time going (P. DNA keptcomplet

4、eincontrolgroup while typicalDNAladderband appearedin DNA fragment electrophoresis and the positive cells thatpresentedbrowedwere observed in irradiation7 group.Conclusions rays irradiation can efficiently induce cellapoptosisfrom humanprostatichyperplasiatissueand cause theatrophy of prostatic tiss

5、ue.【 Key words 】Benignprostatichyperplasia； Radiation；Apoptosis细胞凋亡在前列腺增生（BPH）的发生、进展中具有关键性作用1，2。电离辐射作为一种基因毒素，除可使前列腺组织中与细胞凋亡相关的基因和细胞因子发生改变外，还能直接或间接引发 DNA损伤而诱发凋亡 3，4。本实验采纳 TUNEL染色、流式细胞术（ FCM）和琼脂糖凝胶电泳检测射线内照射对增生前列腺细胞凋亡的阻碍，为采纳电离辐射医治 BPH提供实验依据。材料与方式实验分组 BPH患者 20 例，年龄 5872 岁，病程 213 年，患者随机分为 4 组，每组 5 例： 3 个

6、照射组于前列腺切除术前 1，4，7 d 行 90Sr/90Y 射线内照射，照射剂量为 3050 Gy，对照组未行内照射。各组均行经尿道前列腺切除术或经膀胱前列腺摘除术取得前列腺标本。TUNEL 染色检测细胞凋亡4%多聚甲醛固定前列腺组织46 h，石蜡包埋。切片加蛋白酶K 37消化 5 min，TBS洗涤。加含有TdT和 DIGdUTP的标记液 20 l/ 片， 37标记 2 h ，TBS洗涤 2 min 3次。加封锁液 50 l/ 片室温 30 min，加封锁液 1100 稀释生物素化抗地高辛抗体 50 l/ 片， 37反映 30 min，TBS洗涤。加 SABC37 反映 60 min ，T

7、BS洗涤。 DAB显色 15 min ，苏木素复染，常规脱水、透明、封片。显微镜下凋亡阳性细胞核呈深浅不一的棕黄色，正常细胞核呈蓝色，在每张切片上随机选取 10 个高倍镜视野， 计阳性细胞数和细胞总数，计算阳性反映细胞数占细胞总数的平均百分比。FCM 检测凋亡细胞 DNA含量 新鲜组织研磨成单细胞， 70%冷乙醇固定， 4留宿。 600 r/min 离心 5 min ，弃上清，加 mol/L PBS 5 ml ，混匀 1 500 r/min 离心，弃上清，反复 3 次。用 PBS调整细胞浓度 106/ml ，过 350 目滤网，制成单细胞悬液，加入浓度 200 g/ml 的 RNase A，3

8、7水浴 30 min，加入低渗荧光染料溶液混匀， 4避光染色 30 min。用流式细胞仪摄取 PI 荧光，测凋亡细胞核百分率。DNA 琼脂糖凝胶电泳 组织研碎后，离心去上清，加入 10 倍体积的DNA抽提液混匀， 37水浴 1 h，加入蛋白酶 K，50水浴 3 h，12 000 r/min 离心 5 min，用饱和苯酚抽提上清 1 次，再用苯酚 / 氯仿 / 异丙醇（25241） 1ml 充分混匀， 8 500 r/min 离心 5 min ，弃酚相，保留上清，上清中加入 3 mol/L 醋酸钠和冷乙醇， -20 沉淀留宿。 -10 12 000 r/min 离心 10 min，将沉淀溶于 2

9、0 l TE缓冲液，加入 1 RNA酶， 37保温 1 h。加 4 l 样本缓冲液到含有 g/ml 溴化乙锭的 1%2%的琼脂糖凝胶的样品孔中，室温、恒流75 mA，于1TAE缓冲液中电泳 12 h ，紫外灯下观看实验结果。统计学处置 数据应用统计软件进行统计学处置，组间比较采纳 t 查验。结 果TUNEL 法染色检测前列腺细胞凋亡 对照组仅见少数散在的凋亡细胞，经 90Sr/90Y 射线辐射后细胞凋亡增多，并随时刻而慢慢增加。与间质细胞比较，腺上皮细胞凋亡加倍明显，见图 1。FCM 检测凋亡细胞DNA含量 经流式细胞仪分析凋亡细胞的DNA含量，可见对照组凋亡细胞百分率为（）%，射线辐射可使前

10、列腺组织细胞周期时相发生改变，在二倍体峰前显现亚二倍体峰即凋亡峰。随时刻延长凋亡细胞慢慢增多，辐射一、4、 7 d 凋亡细胞百分率别离为 %， %， %，与对照组比较不同显著（P）。DNA 琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡 对照组基因组 DNA维持完整，经射线辐射 7 d 后基因组 DNA发生断裂，呈现典型的凋亡改变即 DNA 梯形带（DNALadder），说明射线可使细胞核内 DNA在核小体连接处发生断裂，形成 180200 bp 及其整数倍的核苷酸片段，见图 2。图 1 TUNEL染色检测前列腺组织中细胞凋亡 ( 400)图 2 DNA琼脂糖凝胶电泳 3 讨 论细胞凋亡涉及一系列基因表达、 蛋白

11、质和酶的激活， 是细胞为了适应生存环境而主动采取的死亡方式，良性增生的前列腺组织中很少见到细胞的有丝割裂， DNA的合成也少于正常细胞，提示 BPH的病因可能不是前列腺细胞的过度增殖引发，而是细胞凋亡减少所致 5。细胞凋亡的特点是内源性核酸内切酶被激活，细胞染色体 DNA被切割，显现单链或双链缺口， 并产生与 DNA断点数量相同的 3 OH结尾。结尾脱氧核糖核酸转移酶可将地高辛标记的 dUTP(DIG dUTP)标记至 3 OH结尾，DIG dUTP结合在 DNA断点部位，能够通过碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体反映后，加入显色底物予以显示。此种方式灵敏度很高，在凋亡初期就能够够检测到DNA断裂。

12、在本实验中，通过原位结尾脱氧核糖核酸转移酶将地高辛标记的 dUTP(DIG dUTP)标记至 DNA断点部位，以显示细胞凋亡的程度，阳性细胞核呈棕黄色。实验结果可见对照组仅见极少数散在的凋亡细胞，经 90Sr/90Y 射线辐射后凋亡细胞数量随时刻延长而慢慢增多， 与间质细胞比较，腺上皮细胞凋亡加倍明显，说明辐射能使增生的前列腺细胞发生凋亡，而前列腺的腺上皮关于辐射加倍灵敏 6。前列腺细胞凋亡进程中， 由于细胞浆和染色质浓缩、 核裂解，产生凋亡小体，使细胞的光散射性质发生转变，通过流式荧光细胞仪的分析显示，射线辐射可使前列腺组织细胞周期时相发生改变，凋亡细胞核在二倍体峰前显现亚二倍体峰“凋亡峰”

13、 ，随着辐射后时刻的延长，可检测到的凋亡细胞慢慢增多。前列腺细胞发生凋亡时的生物化学特点主若是细胞内发生一系列信号传递反映，有新的 RNA和蛋白质合成，核酸内切酶被激活，染色质DNA被核酸内切酶降解，产生假设干大小不一的多聚核苷酸片段，在琼脂糖凝胶电泳上呈现阶梯状图谱 (DNA ladder) ，利用这一特点能够对细胞凋亡进行检测。 DNA琼脂糖凝胶电泳可见对照组基因组 DNA维持完整，经射线辐射 7 d 后基因组 DNA发生断裂，呈现典型的凋亡改变即 DNAladder ，说明射线可使细胞核内DNA在核小体连接处发生断裂，形成180200 bp 及其整数倍的核苷酸片段。本实验通过TUNEL染

14、色、流式细胞术和琼脂糖凝胶电泳等方式证明，射线内照射能够有效地令人增生的前列腺细胞凋亡，进而引发前列腺组织萎缩，为采纳电离辐射医治BPH提供了实验依据。【参考文献】1Kyprianouandterazosinsuppressprostategrowthbyinducing apoptosis：clinical significanceJ.J Urol，2003；169(4) ：15205.2 IacopinoF，Angelucci C，LamaG，etrelatedgene expressioninbenignprostatichyperplasiaandprostatecarcinomaJ.Anticancer Res，2006；26(3A) ：184954.3 MaQJ，Gu XQ，Cao X，et ofbeta radiationon TGFbeta1 andbFGFexpressionin hyperplasticprostatictissues J .AsianJAndrol ，2005；7(1) ：4954.2 和 bax 表达的阻碍 J. 中国老年学杂志， 2003；23(5) ：2812.5 JustulinLA，DelellaFK，Felisbi