免疫组化实验方法课件

1、免疫组化实验方法免疫组织化学的概念 利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 （荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。2最突出的优点在更广阔的范围内，把结构与功能及代谢结合起来，在微观世界原位地确定组织及细胞结构的化学成分，达到方法统一，定性可靠，定位准确，定量可能。3细胞和组织的固定1固定的作用-使细胞内蛋白质凝固、终止或抑制外源性和内源性酶活性，最大限度地保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。2选择最佳固定液的标准：保持组织形态结构；保存抗原性。（1）醛

2、类固定剂：穿透性较强，收缩性小，是常用的固定剂。如10中性福尔马林液、4多聚甲醛缓冲液、戊二醛-甲醛液、乙酸-甲醛液等。（2）非醛类固定剂：适用于多肽类激素的组织固定，常与戊二醛或多聚甲醛混合使用。（3）丙酸及醇类固定剂：沉淀蛋白质和糖，保存抗原性较好。但对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质的保存效果较差，和其它试剂混合使用加以解决，如加冰乙酸、乙醚、氯仿、甲醛等。3常用的固定方法-浸入法和灌注法（适用于动物实验研究） 组织新鲜 勿干燥 体积适中 固定液足够（20倍） 5抗体常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。特性比较：均一性2. 稳定性3. 特异性4. 重复性5. 沉淀反应6荧光素标记抗体 能

3、够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光色素。必备条件: 荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明，能清晰判断结果。 结合抗体蛋白后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响，用于活体内标记，结合物应无毒，附加抗原性小。7常用的染色方法根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法按标记物定位于抗原所在部位的手段，则可将免疫细胞组织化学染色方法分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥连法等。每进行一步结合反应。都会产生一次阳性结果的放大效应。敏感性由高到低依次为桥连法、间接法、直接法。8反应条件抗原抗体结合属于可逆性反应，具有共性的反应条件：（1）PH：中性及弱硷性条件（PH 78）有利于

4、免疫复合物的形成（2）离子强度：0.010.02 M的低离于强度有利于免疫复合物的形成（3）去污剂：有利于复合物的形成，常用的非离子型去污剂有吐温-20，EDTA（0.01%），Triton X-100（0.11%）（4）抗体稀释液中蛋白质浓度：稀释液中含无关蛋白质可以减少抗体的非特异吸附，常用牛血清白蛋白（5）防腐剂：微生物生长会干扰抗原抗体反应，稀释液和抗体液中加入适量的叠氮钠或硫柳汞以防腐（6）温度和时间：较高的反应温度（37）可加速抗原抗体结合反应，低温有利于抗原抗体结合率的提高（7）洗涤：除去未结合抗原或抗体，除去非特异性吸附造成的背景染色。选用自来水、生理盐水或PBS等，加去污剂并

5、在洗涤过程中加以振摇10染色注意事项（1）在湿盒内进行，以免标本上的试剂干燥。（2）酸碱度以接近体液环境为宜（PH 7.4左右）（3）组织细胞要求新鲜，最好使用冷冻切片，固定存档标本要求组织结构完好。（4）切片经染色后，应及时观察并照相。切片在4冰箱内过夜，其荧光强度将减弱约30。（5）调整抗体稀释度以获得最佳染色效果，以背景非特异性染色最小为标准，对每一批抗体必须试验摸索，找出最佳稀释度。（6）所购抗体应及早使用，尽量减少抗体溶液的冻融次数。12抗生物素-生物素-过氧化物酶技术(avidin-biotin peroxidase complex ABC)原理：利用抗生物素分别连接生物素标记的第

6、2抗体和生物素标记的酶。其第1抗体不为标记物所标记，生物素标记的第2抗体与ABC复合物相连接。ABC复合物是将过氧化物酶结合在生物素上，再将生物素-过氧化物酶连接物与过量的抗生物素蛋白反应而制备的。常用：ABC-HRP 辣根过氧化物酶：最通用的系统，使用范围广ABC-AP 碱性磷酸酶：灵敏度比较高，染色密度较低 ABC-GO 葡萄糖氧化酶：灵敏度较低，适用于组织内源性HRP或者AP含量比较高的组织，常与HRP或者AP系统配合进行双染141516ABC法的特点：敏感性强 特异性强，背景染色淡方法简便，节约时间可用于双重或多重免疫染色。17免疫金染色原理：免疫金染色技术使用胶体金耦联抗体，然后在光学显微镜下检测抗原。解决了免疫组化里内源性酶干扰的问题。整个检测过程中无需酶的参与，因此不必预先处理样本以消除内源性酶的活性。免疫组化试剂的正确选择和使用1820二抗种属来源要匹配：根据所用一抗选定二抗。一般来说，如果一抗是小鼠原性，二抗应选择兔/山羊或其它种属抗小鼠的抗体。注意抗体同种型和亚型：确定一抗同种型和亚型后，可以选择抗一抗来源种属广谱Ig或针对一抗亚型的二抗。如一抗是小鼠IgG1, 可以选用山羊抗小鼠的Ig或IgG1的二抗。正确使用：也需要重新选择稀释比例。一般从供应商提供稀释比例的1/10稀释度始，作5倍比稀释。21设立阳性对照和阴性对照-证明实验系统的正确性1. 阳性