11结构生物学实验技术原理

1、第十一节结构生物学技术概论授课教师：李旭授间第十一节结构生物学技术概论授课教师：李旭授间结构生物学：以生物大分子的特定空间结构及结构的特定运动与结构生物学：以生物大分子的特定空间结构及结构的特定运动与其生物学功能的关系为基础，阐明生命现象的学科X射线晶体学是一门利用X射线来X射线晶体学是一门利用X射线来研究晶中原子排列的学更准确地说，利用电子对X射线的散射射线晶体学可以获得晶体中电子密度的分布情X射线的波长范围(0.01100)与成键原子之间的距X射线的波长范围(0.01100)与成键原子之间的距离(12附近)可比，因此X射线可用于研究各类分因为没有X射线透镜可以聚焦X射线，到目前为止晶体可被

2、视为三光根据劳艾斑晶体可被视为三光根据劳艾斑点的分布可算出晶面间距，进而完成生物大分子所能测定的生物大分子的分子量范围很宽（可以从1kDa以所能测定的生物大分子的分子量范围很宽（可以从1kDa以下到400kDa甚至更大技术成熟度比较应用成本比较低缺点是必须预先出适合于X射线衍射气相扩散气相扩散室温毛细管衍射室温毛细管衍射数据收 使用比较方便，成本较低。但是，由于封装晶残留的结晶母液密封的薄壁玻璃毛细管液氮低温冷 使用相对不便，成本偏高。但是，由于无玻璃毛细管使得吸收效应大大减少，而且晶体的低液氮低温冷 使用相对不便，成本偏高。但是，由于无玻璃毛细管使得吸收效应大大减少，而且晶体的低液氮气流维持

3、冷冻状态分子置换分子置换同晶置换反常散射核 原子核在外磁场中吸收特定频率电磁波的现象核磁是磁矩不为零的原子核，在外磁场作用下自旋能级发生塞曼，吸收某一定核 原子核在外磁场中吸收特定频率电磁波的现象核磁是磁矩不为零的原子核，在外磁场作用下自旋能级发生塞曼，吸收某一定半数以上的原子核具有自旋，旋转时产生一小磁场。当加一外磁场，这些原子核的能级将， 在外磁场B0半数以上的原子核具有自旋，旋转时产生一小磁场。当加一外磁场，这些原子核的能级将， 在外磁场B0条件：=a条件：=ab、温度等等)的状态下，对蛋白质三维结构进行、温度等等)的状态下，对蛋白质三维结构进行液相核磁技术通过原子核弛豫过程可以在原的原

4、子核，如1H，13C，15N和对于分子量较小的短肽和分子量小于10k的蛋白质，以使用未标记的样品通过二维氢谱进行化学位移而对于分子量大于10k而小于25k的蛋白质，由于氢谱的谱峰比较严重，需要使用13C和15N标记的样品，一系列的1H，13C，15N的原子核，如1H，13C，15N和对于分子量较小的短肽和分子量小于10k的蛋白质，以使用未标记的样品通过二维氢谱进行化学位移而对于分子量大于10k而小于25k的蛋白质，由于氢谱的谱峰比较严重，需要使用13C和15N标记的样品，一系列的1H，13C，15N谱图进行化学位移归同种核由于在分子中的化学环境不同而在不同共振磁感应强度下显示吸收峰，这称为化学

5、位移（chemical根据前面的基本原理，在某一照射频率下，只能但实验证明：当1H在分子中所处化学环境（化学环境同种核由于在分子中的化学环境不同而在不同共振磁感应强度下显示吸收峰，这称为化学位移（chemical根据前面的基本原理，在某一照射频率下，只能但实验证明：当1H在分子中所处化学环境（化学环境子的运动情况）不同时，即使在相同照射频率下，也OCH3C C NHOHHOCCCOCCOCH3C C NHOHHOCCCOCC由于局部化学环境的差别，蛋白质分子中每一个核磁谱图的第一步就是要获得蛋白质信号的各个原子的化学位子中能产生核值，这称为由于局部化学环境的差别，蛋白质分子中每一个核磁谱图的第

6、一步就是要获得蛋白质信号的各个原子的化学位子中能产生核值，这称为化学位移的归属(或指认化学位移的归属是通过对一系列核磁谱图的来获得的，分为主链和侧链化学位移归属两 主链化学位移归属是指获得蛋白质肽链骨架上各原子(包括15N1HN13化学位移的归属是通过对一系列核磁谱图的来获得的，分为主链和侧链化学位移归属两 主链化学位移归属是指获得蛋白质肽链骨架上各原子(包括15N1HN13CO13C和1H侧链化学位移归属的目的在于获得各个氨基酸残基侧常用于蛋白质溶液结构计算的结构约束主要包括NOE，二面角，氢常用于蛋白质溶液结构计算的结构约束主要包括NOE，二面角，氢键，以及残余偶极耦合(Residual

7、Dipolar Couplings , RDC) NOE效应是指两个空间距离相近的原子通过空次间进行磁矩传递，该效应的强度与距离的角度约束最常用的是主链肽键的二面角和 氢键的约束传统上依靠蛋白质在重水中主链酰胺基的氢氘交换实验，同时结合观察到的初始结构的生初始结构的生NOE 信号归结构计结构精蛋白质分子在溶液中的运动包括了分子的整体动运动，其中运动又可以分为在快速时间尺度(蛋白质分子在溶液中的运动包括了分子的整体动运动，其中运动又可以分为在快速时间尺度(皮秒)的运动以及慢时间尺度(毫秒)的构象(或化学)交换 尤其是慢时间尺度的构象交换，它与许多重要的生物过程，如酶催化、蛋白质折叠和蛋白，发生在

8、同一时间尺度内，和蛋白质的生物功能有着核磁信号的弛豫参数包含了蛋白质分子运动的信息，可以作为探针来获得蛋白质分子的动力核磁信号的弛豫参数包含了蛋白质分子运动的信息，可以作为探针来获得蛋白质分子的动力纵向弛豫速率三维冷冻电镜技术主要是将样品保存在液氮或液氦温度下利用透射电子三维冷冻电镜技术主要是将样品保存在液氮或液氦温度下利用透射电子显微镜进行二维成像，再经过对二维投影图像的分析将样品通过快速液氮冷冻“冻”在玻璃态冰中金属盐中，图像具有很高的对比度，而且样品在结合图像分类技术，该方法可以用于研究非常不均一或者分子量较小的样品然而染色过程不可避免地会引起样品的变形且有染色不均匀的缺陷，所以负染样品

9、的精度通金属盐中，图像具有很高的对比度，而且样品在结合图像分类技术，该方法可以用于研究非常不均一或者分子量较小的样品然而染色过程不可避免地会引起样品的变形且有染色不均匀的缺陷，所以负染样品的精度通常不超过20 通过快速冷冻的制样方法，能够使样品处在接近ice)中，从而保持其天然构像，克服了染色等过程对样品构象的影结构更接近功能活性状态但是冷冻电镜的图像对比度和信噪比很低，并且样品的朝通过快速冷冻的制样方法，能够使样品处在接近ice)中，从而保持其天然构像，克服了染色等过程对样品构象的影结构更接近功能活性状态但是冷冻电镜的图像对比度和信噪比很低，并且样品的朝杂乱机的heterogeneity)，

10、需要复合大量单颗粒图像来提高因而不适合研究不均一或者分子量较小的样品方法可以使样品处于生理状态的环境，并且具有RNA聚合酶、TFIIE及RNA 方法可以使样品处于生理状态的环境，并且具有RNA聚合酶、TFIIE及RNA 10g10g/晶体结构Backbone 晶体结构Backbone 尺度的电子密度不均匀区，则会在入射光束周围的小角度范围内（尺度的电子密度不均匀区，则会在入射光束周围的小角度范围内（一般04）出现散射X射线， 小角X 小角X射线散射(smallangleXrayscattering 小角中子散射(smallangleneutronscatteringSAXS谱图能直接提供的参数只能给出粒子结构的分子质量SAXS谱图能直接提供的参数只能给出粒子结构的分子质量 对于大的蛋白质或蛋白质复合物，当蛋白质各结构域或亚基的结构已知时，SAXS