成骨生长肽(OGP(10-14))改性聚乳酸仿生骨修复材料的制备及细胞相容性研究15 - 副本

1、 所测MPLA的玻璃化转变峰值温度得MPLA材料的Tg温度为42.73 ，比较两种两种材料的玻璃化转变峰值温度可知，OGP（10-14）-MPLA材料的玻璃化转变温度较高，原因在于OGP（10-14）引入MPLA中使材料聚合物中-NH2，-COOH 和-CONH- 等活性基团增加从而使聚乳酸更易形成内盐，其分子量增加。热性能分析是改性聚乳酸材料玻璃化转变温度的重要考察指标之一，玻璃化转变温度是未知化学结构聚合物材料的特征温度。上述两种材料的玻璃化转变峰值温度的比较可表明改性后的聚乳酸材料分子量发生变化，活性多肽OGP（10-14）已成功接到MPLA 上。图2.5 OGP(10-14)-MPLA

2、的DSC曲线图Fig.2.5 The DSC curve of OGP(10-14)-MPLA2.3.6 OGP（10-14）-MPLA 的X射线光电子能谱分析图2.6（a）为MPLA的X光电子能谱分析图，图2.6（b）为OGP（10-14）-MPLA的X光电子能谱分析图。比较两种材料表面的分析图可知， MPLA材料分析能谱图中含有C和O两种特征峰吸收峰，OGP（10-14）-MPLA材料的能谱图（图2.6（b）中除了C1s和O1s的特征峰，还含有N1s谱峰，这说明MPLA材料中含有C、H、O三种元素，而OGP（10-14）-MPLA材料中不仅含有C、H、O，还含有N元素，N元素的出现是由于O

3、GP（10-14）与MPLA化学结合引入的氨酰胺基和氨基。再根据上述FTIR检测结果可证明多肽OGP（10-14）已成功接枝到了MPLA材料上。图2.6 MPLA(a)和OGP（10-14）-MPLA（b）材料的X射线光电子能谱图Fig. 2.6 The XPS spectra of MPLA（a）and OGP（10-14）-MPLA（b）2.3 讨论长期以来，改性聚乳酸材料的研究是仿生骨组织工程材料领域的研究热点，其不仅具备聚乳酸作为仿生骨修复材料的优点，通过改性技术提高了聚乳酸材料的亲水性和可控的降解性能等不足而且还将某些利于促成骨作用的活性基团接枝到聚乳酸材料中。本研究通过OGP（10

4、-14）接枝改性聚乳酸材料，目的在于引入成骨活性因子，以提高聚乳酸支架材料的成骨活性。通过化学方法将成骨生长肽OGP（10-14）共价接枝到MPLA中，从而使该聚乳酸改性材料在一定程度上具有仿生骨修复材料的一些优良性能。对合成材料样品进行结构表征分析。其定量分析结果中，经EA分析得，成骨活性多肽OGP（10-14）在MPLA材料上的含量约是2.357mol/g，接枝率为11.78%；AAA分析得，活性多肽OGP（10-14）在MPLA材料上的含量约是2.46 mol/g，接枝率约为 12.40%。氨基酸分析结果和元素分析结果出现微小的差别，误差产生的原因可能是两种分析仪器检测过程中出现微小的偏

5、差或检测材料样品的时间上存在差异，但其分析的结果属于误差允许范围内，其结果是一致的，都定性定量的证明了OGP（10-14）成功引入到MPLA材料上 。通过定量分析材发现，成骨生长肽OGP（10-14）在MPLA材料上的接枝率并不高，其主要原因可能是：OGP（10-14）分子结构中同时含有羧基、氨基等活性基团，同时马来酸酐改性聚乳酸结构中有大量酸酐而且也存在一定量的羧基，OGP（10-14）的活性基团之间也可能相互之间发生交联反应，形成环肽或分子链更长的多肽，OGP（10-14）与MPLA材料分子接触和反应的实际数量与理论数值相比会出现一定的降低。因此，在后续实验过程中为提高OGP（10-14）

6、 在MPLA材料上的接枝效率，应考虑将OGP（10-14）分子中除氨基端的-NH2外的其他活性基团保护起来，这样可尽可能避免在两种物质发生化学反应的实验过程中副反应的产生，从而使多肽的生物活性作用在改性聚乳酸材料中更显著。 2.4 本章小结本章研究内容是在已报道的马来酸酐改性聚乳酸技术和多肽接枝改性生物材料技术上，采用化学合成中的酰胺化反应，将可促进成骨作用的生物活性因子OGP（10-14）引入到MPLA材料中，合成有利于骨组织工程发展的仿生聚乳酸材料。本章重点研究了OGP（10-14）-MPLA材料的制备及结构表征，得实验结果如下：（1） FTIR、EA、AAA和XPS对合成材料OGP（10

7、-14）-MPLA和MPLA材料检测数据分析的结果表明，生物活性因子多肽OGP（10-14）已成功引入到MPLA材料中，且OGP（10-14）在 OGP（10-14）-MPLA 材料中的平均含量约为 2.46 mol/g，接枝效率约为 12.40%；（2）DSC对材料检测结果表明，OGP（10-14）-MPLA的Tg温度为68.50，与MPLA材料的Tg温度相比，有了一定的提高，证明活性多肽OGP（10-14）已成功接枝到马来酸改性聚乳酸材料上。3 成骨生长肽改性聚乳酸的理化性能研究3.1 前言材料的亲水性和降解性能是生物相容性的重要指标。细胞在生物材料表面上粘附和生长的情况主要由材料的亲、疏

8、水性决定，材料亲水性强可提高细胞的粘附能力。高分子生物材料在介质中其分子结构中含有易与水性介质发生化学反应的基团，在不断接触过程中，其分子结构会发生变化，从而使高分子生物材料不断降解，其整体结构遭到破坏本章主要考察了OGP（10-14）-MPLA和MPLA材料在摸拟人体环境的介质中的亲/疏水性，通过测定材料降解过程中介质pH值的变化, 研究OGP（10-14）-MPLA改性材料的降解性能。3.2实验部分3.2.1 主要材料和设备MPLA：自制，重均分子量 1.23105OGP（10-14）-MPLA：自制，重均分子量1.05105聚四氟乙烯(PTFE)平板：自制真空干燥箱： DZX-3 型，上

9、海福玛实验设备有限公司静态水接触角测量仪: MagicDroplet Model200，台湾翰光高科技有限公司多角度激光光散射仪： MALLS, 美国 Wyatt 技术公司实验室PH计：FE20 ， 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司电子恒温不锈钢水浴锅： HHS-2S ，上海宜昌仪器纱筛厂圆形盖玻片： 重庆北碚玻璃仪器厂四氢呋喃、三氯甲烷：分析纯，重庆东方化学试剂厂3.2.2 改性材料的分子量测定将MPLA和OGP（10-14）-MPLA样品分别溶于四氢呋喃溶液中，振荡摇匀，用 0.22 m 的滤膜过滤，将滤液用多角度激光光散射仪检测两种聚合物样品的重均分子量 Mw。3.2.3 改性聚乳酸的

10、吸水率检测（1）膜状模型材料的制备称取等量的MPLA和 OGP（10-14）-MPLA 样品分别溶解于相同量四氢呋喃中过夜，配置得到材料浓度为40 mg/mL。分别取一定量上述两种溶液均匀滴到洁净的四氟乙烯板上，然后迅速盖上培养皿，室温下放置48h，待材料在板上均匀成膜后，再将铺有材料的四氟乙烯板置于真空干燥箱中干燥至溶液挥发挥发完，用剪刀将膜剪成长度均为3cm的正方形薄膜，备用。（2）吸水率检测称取等量上述制备好的MPLA和 OGP（10-14）-MPLA材料，在模拟体内温度环境（ 370.5的蒸馏水）中浸泡 24h，取出两种聚合物膜后，用滤纸完全吸干薄膜表面的水，称重并记录。其吸水率公式：

11、吸水率（R）(W1-W0)/W0 100，其中 W1为样品膜吸水后的湿重，W0为样品膜吸水前的干重。根据数据计算平均值（每个样品有6个平行样）。3.2.4 静态水接触角分析采取滴液法测定静态水接触角，利用三氯甲烷溶解MPLA 和OGP（10-14）-MPLA聚乳酸改性材料制得浓度为 40mg/mL 的溶液，摇匀，密封放置过夜，将溶解均匀的溶液用 0.22m微孔过滤器过滤除去不溶物或杂质；用 1mL 的移液枪取样 1ml 溶液缓慢滴加在 2.547.62cm的洁净载玻片上，迅速放于培养皿中密封，在25下，放置24h使溶剂挥发且材料均匀成膜；将铺有聚合物的载玻片放于真空干燥箱中干燥至恒重（约24h

12、）；在 25下，将制备得到的薄膜样品固定在测定仪载物台上进行检测并拍照。每个材料样品表面取 6 个点进行静态水接触角测定，记录并计算平均值。3.2.5 降解性能测定取等量的3.2.3（1）制备得到的MPLA和 OGP（10-14）-MPLA样品薄膜片，将其分别放入盛有 PH=6.45 的蒸馏水的培养皿中，密封。将密封好的培养皿置于37.01的孵箱中，每组样品取三个平行样。每隔一定时间测定培养皿内介质的 pH 值，记录并计算平均值。测量完后将培养皿密封,置于37.01的孵箱中继续降解。将这两种材料溶于水性介质中检测其pH连续10周,检测并记录介质溶液中pH的变化情况。3.3 实验结果3.3.1

13、改性聚乳酸材料亲/疏水性的测定结果水溶液在含有大量氨基、羧基和羟基等亲水性基团的生物材料上的表面张力会减小，接触角会降低；同时，这些亲水性活性基团能与水分子结合，将水分子束缚在聚合物材料中，提高了材料的吸水率，从而使材料的亲水性提高。表3.1所示为MPLA和OGP（10-14）-MPLA材料检测的静态水接触角和吸水率结果。从表中可以看出，与MPLA相比，OGP（10-14）-MPLA材料的静态水接触角减小，吸水率提高，这说明OGP（10-14）-MPLA材料具有更佳的亲水性。这是由于聚乳酸中活性多肽OGP（10-14）的引入，增加了改性聚乳酸材料中的亲水性基团的含量，使材料的亲水性得到了提高。

14、表3.1 MPLA 和OGP(10-14)-MPLA材料的静态水接触角和吸水率Table3.1 Static Water Contact Angle and Water-Uptake Ratios of MPLA and OGP(10-14)-MPLASampleStatic Water Contact AngleWater absorptionMPLA92.71.2*9.41%*OGP(10-14)-MPLA86.21.512.60%*表示和MPLA 比较，P 0.05；*Means P 0.05, compared with MPLA;3.3.2 改性聚乳酸材料降解性能的测定结果图3.1是

15、MPLA和OGP（10-14）-MPLA材料薄膜降解过程中介质的pH值与降解时间的关系曲线。由图3.1可以得出以下规律：对于MPLA材料，在0-3周内，其降解介质检测pH值从6.45降到5.16；在第3-7周内，其pH从5.16降至1.90；在7-10周内，其pH从1.90降至1.62 。对于OGP（10-14）-MPLA材料，在0-3内，其降解介质的pH值从6.45降到5.60；在第3-7周内，其pH从5.60降至2.32；在7-10周内，其pH从2.32降至2.12。根据上述数据可以看出，MPLA和OGP（10-14）-MPLA材料降解后介质pH随时间变化规律相似，即两种材料在0-3周内降

16、解介质的 pH 下降缓慢；3-7周内两种材料所处水性介质pH变化明显；材料在7-10周内降解介质pH 值达到一个平缓期。根据图3.1的两种材料降解介质pH曲线图对比可知：在同一时间段内，OGP（10-14）-MPLA所处水性介质pH值始终略高于MPLA。由此可知,OGP（10-14）-MPLA材料在降解过程中产生的酸性产物低于MPLA，故该改性聚乳酸材料的酸性自催化作用较弱，有利于控制该材料在体内的降解。图3.1 MPLA和OGP（10-14）-MPLA材料薄膜降解过程中降解介质的 pH 变化Fig.3.1 pH value changes of the incubating media (d

17、istilled water) during degradation of MPLA and OGP（10-14）-MPLA讨论高分子材料植入体内后，与其周围微环境接触时间过长会受到各种因素（如：化学、物理、生物等）的影响，同时会与周围组织和细胞之间发生相互作用。所以，在选择生物材料对细胞外基质模拟以替代其功能时，骨修复材料必须满足具理想骨替代材料的良好理化性能（亲水性和降解性能等），聚乳酸改性材料必须具备这些条件，才能进行进一步的研究，因此本研究主要考察改性聚乳酸材料的分子结构、亲水性能和材料可降解性能是否满足仿生骨修复材料的要求。3.3.1 聚乳酸改性材料的亲/疏水性能聚合物材料在体内的亲

18、水性强弱影响着周围环境中粘附蛋白的吸附能力和细胞的粘附能力，由此对细胞在材料表面的增殖、分化等能力产生影响 。在本实验研究中，对改性聚乳酸材料的吸水率和静态水接触角进行检测分析其亲水性。材料本身的化学结构和组成以及材料中存在的键型决定了高分子聚乳酸材料的亲/疏水性。因聚乳酸材料分子内结构中存在大量的疏水性酯键，导致材料的亲水性变弱，从而使聚乳酸材料在临床应用中受到限制。所以,在近几十年有大量关于聚乳酸材料改性的研究，以最大限度的改善聚乳酸材料的疏水性, 并取得了一定进展，获得亲水性好的改性聚乳酸材料。本实验室也进行了大量的研究，其中关于马来酸改性聚乳酸的研究结果使材料的亲水性得到很大改善，但其

19、亲水性的增强还需进一步研究。因此本实验将具有生物活性和含有亲水性的氨基、羧基等基团的OGP（10-14）多肽引入改性聚乳酸材料中，并研究改性聚乳酸材料的亲疏水性。通过对OGP（10-14）-MPLA和MPLA 材料的吸水率和静态水接触角进行比较发现，OGP（10-14）-MPLA改性聚乳酸材料的吸水率为高于MPLA，OGP（10-14）-MPLA的静态水接触角比MPLA小。这正是因为将活性多肽的引入，同时为聚乳酸材料引入了大量的亲水性基团(氨基、羧基和羟基等)，从而使聚合物材料的亲水性提高。3.3.2 聚乳酸改性材料的体外生物降解性能生物材料在体内的降解是指材料经水解、增溶或体内的酶作用而使生

20、物高分子材料逐渐分解为分子量较小的中间产物或终产物的过程 。仿生骨修复材料选择过程中，采用的生物材料均需要有可控的降解材料，以防止其在体内环境中发生不可控降解而导致材料的提前分解或推迟降解，从而导致体内生物材料的作用失效。生物材料可作为药物或生物活性因子的理想载体，随着材料的降解逐渐释放，也可作为组织工程支架材料促进组织修复和愈合，其降解终产物可通过体内运输排出体外。改性聚乳酸材料中含有大量酯键、酰胺键等容易降解的结构，在降解过程中，材料的分子结构在发生变化，分子结构中含有的化学键（如酯键、酰胺键等）可能会断裂，从而产生许多分子量小的物质，这些物质在生物体内若不能及时排出，可能会影响周围环境，

21、可能导致材料的细胞相容性发生变化。聚乳酸材料与水性介质接触初期，其表面最先与水性介质接触并吸收水分子，而因表面吸收了大量水分子使材料表面和内部产生浓度差，这段时间避免了材料内部与水性介质接触，从而不会影响聚乳酸内部的化学结构。所以，在聚乳酸与水性介质接触的初期材料所处介质pH并未发生变。但随着聚乳酸材料与水性介质接触的时间增加，水性介质逐渐渗入材料内部，与聚乳酸材料内部结构接触使其酯键发生水解，产生大量水解酸性产物，导致介质的pH值逐渐降低,但由于材料在这个阶段接触到的水性介质有限，其分子链水解部位较少，导致释放出的水解产物量较少，因此，介质pH值下降缓慢。随着降解时间增长材料与水性介质接触更

22、充分，材料分子链水解部位增加，从而使水性介质中酸性基团（如COOH）量不断增加，同时由于酸性溶液对聚乳酸材料的降解有一定的催化作用即产生自催化降解，因而使聚乳酸改性材料降解速率加快，导致聚乳酸材料与水性介质接触后期pH值下降速度很快。由于在聚乳酸材料中引入的OGP（10-14）中的碱性基团（-NH2和-NH-等）可中和聚乳酸降解过程中产生的部分酸性物质，使材料在水介质中的酸致自催化降解的能力减弱，即使聚乳酸材料的降解得到了有效的控制。3.4 本章小结本实验通过对MPLA和OGP（10-14）-MPLA两种材料的分子量测定、静态水接触角、吸水率和降解性能等理化性能进行测定和比较，得到如下结果：（

23、1）静态水接触角测定结果表明：OGP（10-14）-MPLA的静态水接触角比MPLA改性聚乳酸材料的接触角小。材料表面的静态水接触角越小，水对材料表面润湿效果越好，材料亲水性越好，所以OGP（10-14）-MPLA亲水性高于MPLA。（2）吸水率测定结果表明，OGP（10-14）-MPLA的吸水率为12.60%，高于MPLA改性聚乳酸材料的吸水率9.41%。材料吸水率越高，说明材料亲水效果越好，即亲水性更好，所以根据材料的亲水性和接触角的测定结果分析得出OGP（10-14）-MPLA亲水性较好，即通过引入活性多肽OGP（10-14），提高了改性聚乳酸材料的亲水性。（3）降解实验测定结果表明，与

24、MPLA相比，OGP（10-14）-MPLA在降解过程中水溶性介质的pH值始终高于MPLA ，水性介质pH值变化速率也相对稳定。这证明由于活性多肽OGP（10-14）的引入使改性材料的降解体系发生了变化，OGP（10-14）-MPLA具有可控的降解性能。4 成骨生长肽改性聚乳酸材料的细胞相容性研究4.1 前言体外细胞实验是评价新型材料安全性和生物学功能以用于临床前研究的第一步。本研究主要考察改性聚乳酸材料对骨细胞生物学行为的影响，成骨细胞为骨细胞在组织工程中骨修复和骨重建的种子细胞，且在骨形成过程中为最重要的功能细胞。因此，在体外实验中，本研究主要通过对成骨细胞在仿生改性聚乳酸材料表面的粘附、

25、铺展等一系列细胞生长过程情况来判断改性聚乳酸材料的细胞相容性和促成骨功能。本章将MPLA和OGP（10-14）-MPLA作为基底材料，将成骨细胞接种到基底材料表面模拟生物体内环境进行培养，并观察成骨细胞在基底材料上的粘附和铺展状况，测定细胞增殖、分化和矿化情况。4.2 实验部分4.2.1 主要材料和设备MPLA：自制，重均分子量 1.23105OGP（10-14）-MPLA：自制，重均分子量1.05105聚四氟乙烯(PTFE)平板：自制DMEM干粉培养基: 美国GIBCO公司胰蛋白酶: 美国GIBCO公司PBS试剂: 北京中杉金桥生物技术有限公司胎牛血清: 美国GIBCO公司25ml细胞培养瓶

26、（带滤膜）: 美国康宁公司碱性磷酸酶检测试剂盒：南京建成生物工程研究所CCK-8溶液: 中国碧云天生物技术研究所四氢呋喃，醋酸钠，醋酸: 分析纯,重庆东方化学试剂厂TritonX-100: 瑞士Fluka公司罗丹明标记的鬼笔环肽： 美国 Sigma 公司BCA 试剂盒：北京康威世纪生物科技有限公司茜素红S：美国 AlfaAesar 公司75%医用乙醇：分析纯，重庆东风化学试剂厂4%戊二醛：分析纯，重庆东风化学试剂厂青霉素链霉素混合溶液：美国 Sigma 公司超净工作台: YJ-875型, 苏州净化设备厂三气细胞培养箱: GI2-2 型，美国 SHELLAB 公司倒置相差显微镜: IX71型,

27、日本Olympus Corporation 公司激光共聚焦显微镜：LSM510META，德国 Carl Zeiss Jena 公司数码相机: C5050 型，日本 Olympus Corporation 公司酶标仪: Model550型,美国真空干燥箱：DZF-6020 型，上海中友仪器设备有限公司离心机: TCL-6C型,上海安亭科学仪器厂实验室PH计： FE20 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司电子恒温不锈钢水浴锅：HHS-2S 上海宜昌仪器纱筛厂漩涡混合器: FzQ型, 江苏泰县医疗器械厂24/96 孔细胞培养板： 武汉博士德生物工程有限公司移液枪： 德国 Eppendorf 公司圆形

28、盖玻片：重庆北碚玻璃仪器厂4.2.2 功能聚乳酸材料薄膜的制备分别称取等量的MPLA和 OGP（10-14）-MPLA材料溶解到一定量四氢呋喃中过夜，使材料浓度为40 mg/mL。用0.22um过滤器过滤溶液，将直径为14mm的洁净圆形盖玻片放在聚四氟乙烯板上，再用移液枪分别取50 L过滤后溶液，缓慢滴到盖玻片上，使溶液均匀的涂满整个盖玻片，盖上培养皿，放于室温下挥发 48 h，待材料在盖玻片上均匀成膜后，再将铺有材料膜的盖玻片放在真空干燥箱中干燥 24 h，待四氢呋喃挥发完全后，将干燥好的两种聚乳酸改性材料样品膜放在紫外线下照射 30 min 灭菌，分别取4片铺有MPLA膜和OGP（10-1

29、4）-MPLA膜的圆形盖玻片置于24孔板中，放于超净工作台中，备用。4.2.3 成骨细胞的培养本实验取 1-3 天龄 SD 大鼠的乳鼠颅盖骨成骨细胞进行原代培养，待成骨细胞覆盖80%的培养瓶底部后，采用差速黏附法进行细胞纯化并将成骨细胞传代培养，将培养的3-6 代成骨细胞进行细胞相容性实验。4.2.4 成骨细胞在改性聚乳酸材料上的形态观察将成骨细胞以1104/孔的密度接种到由2.2.2制备得到的孔内分别放有两种聚合物膜的24孔板中，使细胞悬液均匀的铺满整个盖玻片，在超净工作台中放置 5min 后，向孔板中加入完全培养基 DMEM，放于细胞培养箱中培养，分别取在两种材料膜上培养 4h 和 24h

30、 后的细胞，利用倒置显微镜观察两种聚合物膜上培养的细胞形态，并拍照记录。4.2.5成骨细胞在改性聚乳酸材料上的粘附和铺展将成骨细胞以1104/孔的密度接种到分别铺有两种聚合物膜的24孔板中，在细胞培养箱中培养 24 h 后，取出24孔板，吸去培养液，用 PBS缓冲液洗24孔板中材料膜上残留培养基5min，重复清洗孔板3次，在室温条件下，加入免疫染色固定液固定细胞30 min，吸出液体，用PBS缓冲液洗5min 3次。再加入 0.25% TritonX-100 裂解10 min破膜，吸去 TritonX-100 溶液，用PBS缓冲液洗5min3次。向铺有两种材料膜的24孔板每孔加入5%的牛血清白

31、蛋白（BSA）封闭液封闭放置1h，吸出 BSA 废液，用PBS缓冲液洗5min 3次，在避光条件下，加入浓度为 5 U/mL 的罗丹明标记的鬼笔环肽，放在4避光环境下孵育过夜，吸出染液，用PBS缓冲液洗5min3 次，加入0.01%的DAPI溶液室温下染色 10 min，吸出染液，PBS缓冲液洗5min3次，再用95%甘油封片。将处理好细胞放于激光共聚焦显微镜下观察，拍照记录。4.2.6成骨细胞在改性聚乳酸材料上的增殖能力将成骨细胞以1104/孔的密度接种到分别铺有两种材料膜的24孔板中，共分为五组培养（即培养 2、4、6、8、10 天），每组样品各取4个平行样，取出需检测细胞培养时间组24孔

32、板，吸出24孔板中的培养液，用 PBS缓冲液清洗5min3次，再向24孔板每孔中分别加入无血清培养液 200 L和20 L CCK-8检测液，在 37培养箱中孵育2 小时后，将样品各吸取 200 L 至 96 孔板中，用酶联免疫检测仪在 570 nm 4.2.7 成骨细胞在改性聚乳酸材料上的分化能力（1）聚合物材料膜上成骨细胞总蛋白含量的测定将成骨细胞以2105/孔的密度接种到分别铺有两种材料膜的24孔板中，共分为五组培养（即分别培养2、4、6、8、10天），每组样品各取4个平行样。取出需检测细胞培养时间组24孔板，吸出需检测基底材料组每孔中的培养液，并用 PBS 缓冲液清洗5min3次，再向

33、每孔中加入100 L 细胞裂解液，用移液枪反复吹打细胞20min使其完全裂解，吸出裂解液加入到1.5ml离心管中，在 4下，14000 r/min ，离心8min，分别取30 L 各样品的上清液加入 96 孔板中，再向每孔加入 200 L BCA 工作液，充分混匀，37孵育 2 h（2）聚合物材料膜上成骨细胞碱性磷酸酶含量的测定将成骨细胞以2105/孔的密度接种到分别铺有两种材料膜的24孔板中，共分为五组培养（即分别培养2、4、6、8、10天），每组样品各取4个平行样。取出需检测细胞培养时间组的24孔板，吸去需检测基底材料组每孔中的培养液，用 PBS缓冲液清洗5min3次，再向每孔中加入100

34、 L 裂解液，用移液枪反复吹打细胞使其完全裂解后，将裂解液吸入离心管中，在 4下，14000 r/min 离心8 min，取 30L 各样品的上清液加入 96 孔板中，再向每孔加入50 L缓冲液和50L碱性磷酸酶基质液，充分混匀；37条件下放置15min后，再向溶液中加入150L碱性磷酸酶显色剂，摇匀后37孵育2 h。将96孔板放于酶联免疫检测仪检测器中，测定处理样品570 nm 处的吸光光度值，根据所测数据，计算各组样品的 ALP 活性。4.2.8 成骨细胞在聚乳酸改性材料膜上的矿化能力成骨细胞以2105/孔的密度接种到铺有两种材料膜的24孔板中，将培养细胞分为三组培养（即细胞培养14、21

35、、28天），每组孔板中各含4个平行样。称取10 mg茜素红S溶于10 mL蒸馏水中，并用醋酸钠和醋酸将其pH调至4.1，备用；取出需检测细胞培养时间组的24孔板，吸出培养液，用PBS洗5min3次；向孔板中每孔加入适量4%戊二醛，室温下，固定30 min，吸去固定液；用PBS洗5min3次，再向每孔中加入200 L上述配置的茜素红染液（15 mg/mL,pH = 4.1），室温下染色振荡孵育20 min；弃去染色液，用蒸馏水洗至无红色染液被洗出 ；观察各孔颜色并拍照；再向每孔中加入200 L 10% 醋酸溶液，在轻微震荡条件下溶解30 min；刮下细胞，将溶有细胞的醋酸溶液吸入离心管中，漩涡3

36、0s，再将离心管中溶液加热到85后，放置10min。将处理后溶液放于离心机中，以转速20000r/min，离心15min，将上清液转移到另一离心管中，再向溶液中加入10%氨水溶液，振荡摇匀后，分别取100L溶液于96孔板中4.2.9统计分析应用SPSS分析软件对实验所测数据进行分析。单因素方差分析以平均值标准差表示（其中n = 4），P 0.05表示具有显著性差异。4.3 实验结果4.3.1改性聚乳酸材料膜对成骨细胞形态、粘附和铺展的影响成骨细胞在生物材料表面上的正常生长，需要有良好的粘附和铺展，细胞在生物材料上的粘附可分为非特异性粘附和特异性粘附，其中非特异性粘附所需时间较迅速，而特异性粘附

37、的粘附时间较长。本研究中，对接种在两种聚合物上的成骨细胞分别培养 4h和24 h后，观察其形态和粘附状态。观察结果为图4.1（a，b）和图4.2(a, b)，其中a表示细胞接种在MPLA材料上4h和24h的细胞形态，b表示细胞接种在OGP（10-14）-MPLA材料上4h和24h的细胞形态。从图中可以看出，接种在OGP（10-14）-MPLA材料薄膜上的细胞比接种在MPLA材料薄膜上的细胞形态和粘附效果较好，且OGP（10-14）-MPLA材料薄膜上的细胞培养一天后细胞量增长较快其贴壁效果更好。图4.1成骨细胞接种在不同聚合物膜上4h后的形态（a：MPLA；b：OGP（10-14）-MPLA）

38、Fig.4.1 The morphology of rat calvarial osteoblasts seeding on the different materials for 4h（a：MPLA；b：OGP（10-14）-MPLA） 图4.2成骨细胞接种在不同聚合物膜上24h后的形态（a：MPLA；b：OGP（10-14）-MPLA）Fig.4.2 The morphology of rat calvarial osteoblasts seeding on the different materials for 24h（a：MPLA；b：OGP（10-14）-MPLA）细胞骨架是一种维持

39、细胞基本形态的蛋白纤维网络结构，具有维持细胞形态，细胞弹性和刚性，细胞生物学信号的传导以及细胞膜的表面张力等重要作用，可以反映细胞在材料表面的铺展情况。本研究对两种改性聚乳酸材料上粘附生长24h的成骨细胞的骨架和细胞核进行染色处理，并利用激光共聚焦显微镜观察细胞骨架和细胞核。图4.3（a，b）分别为成骨细胞在两种改性聚乳酸材料膜表面粘附24h的细胞骨架和细胞核分布情况，其中a为细胞接种在MPLA材料膜上24h的铺展情况，b为细胞接种在OGP（10-14）-MPLA材料膜上24h的铺展情况。从图可以看出，在OGP（10-14）-MPLA材料表面培养的细胞骨架明显且多，细胞铺展状况较好，而在MPL

40、A材料膜上的细胞骨架和细胞核均较少，未图 4.3 成骨细胞在不同聚合物膜上的铺展形态（a：MPLA；b：OGP（10-14）-MPLA）Fig.4.3 Skeletal images of osteoblasts on different materials after 24h seeding（a：MPLA；b：OGP（10-14）-MPLA）4.3.2改性聚乳酸材料对成骨细胞增殖的影响细胞在生物材料表面的增殖能力是评价材料细胞相容性的一项重要指标，细胞的增殖情况反应了细胞在材料上的存活情况，从而影响细胞在生物材料表面的后续成熟和分化等活动。本实验采用 CCK-8 试剂盒处理在OGP(10-1

41、4)-MPLA和MPLA材料膜上培养 2、4、6、8、10天的成骨细胞并测定处理溶液的吸光光度值。由图4.4可知，在10天的培养过程中，成骨细胞在不同聚合物膜上的数量存在先增加后又逐渐减少的的趋势。成骨细胞在 OGP(10-14)-MPLA材料上培养所测得的OD值均比成骨细胞在MPLA 材料上培养所测得的OD值大，即成骨细胞在OGP(10-14)-MPLA材料上的细胞数量比成骨细胞在MPLA 材料上细胞数量多。成骨细胞在聚合物膜上的增殖速率OGP(10-14)-MPLA高于MPLA。结果表明，成骨细胞在OGP（10-14）改性接枝的MPLA材料上的增殖能力比细胞在单纯的MPLA材料上增殖能力强

42、。图4.4成骨细胞在MPLA and OGP(10-14)-MPLA材料表面的增殖情况（* 表示与 MPLA 相比，P0.05）Fig.4.4 Cell proliferation of osteoblasts grown on MPLA and OGP(10-14)-MPLA polymer films.（* means P0.05, versus MPLA）4.3.3改性聚乳酸材料对成骨细胞分化的影响碱性磷酸酶在细胞分化过程中，细胞分化能力越高其活性越高，是成骨细胞分化的标志性酶，可通过对细胞碱性磷酸酶含量检测作为成骨细胞分化能力的指标。（1）改性聚乳酸材料上细胞的总蛋白含量以BSA标准蛋

43、白浓度为横坐标，吸光光度值为纵坐标，绘制出牛血清白蛋白标准曲线，如图4.5。将实验测得的成骨细胞在两种改性聚乳酸材料膜上培养2、4、6、8、10天的OD值根据标准曲线，计算出各阶段成骨细胞中蛋白质的总量，如图4.6。由图可知，成骨细胞在两种改性聚乳酸材料膜表面上培养的2-8天期间，其蛋白质含量都在不断增加，且细胞在OGP(10-14)-MPLA材料膜上培养测得的蛋白含量较在MPLA材料膜上培养细胞所含的蛋白含量高。成骨细胞在两种材料上培养的第10天所测蛋白含量与第8天所测数据相差不大，其增殖速率降低，说明这一阶段的细胞已进入分化阶段。图4.5 牛血清白蛋白标准曲线Fig.4.5 Standar

44、d curve of BSA图4.6 成骨细胞在不同改性聚乳酸材料上的蛋白质总量（*表示与MPLA比较p0.05）Fig.4.6 The protein content of osteoblasts on different polymers (* means P0.05 compared with MPLA)（2）改性聚乳酸材料上细胞的碱性磷酸酶活性测定图4.7是成骨细胞在OGP(10-14)-MPLA和MPLA上培养不同时间段的碱性磷酸酶活性变化图。由图可知，随着成骨细胞在两种聚合物材料上的培养时间的增长，其碱性磷酸酶活性都有所增加，且细胞在OGP(10-14)-MPLA材料上的碱性磷酸酶

45、活性在每个时间段均比在MPLA材料上的碱性磷酸酶活性高。因此，可判断OGP(10-14)-MPLA材料提高成骨细胞碱性磷酸酶的活性的作用更为显著，即OGP(10-14)-MPLA材料更有利于细胞分化过程，而促进细胞生长。图4.7成骨细胞在MPLA and OGP(10-14)-MPLA表面的碱性磷酸酶活性（* 表示和 MPLA 相比，P 0.05）Fig.4.7 The ALP activity of osteoblasts grown on MPLA and OGP(10-14)-MPLA polymer films. （* means p0.05, compared with MPLA）4

46、.3.4改性聚乳酸材料对成骨细胞矿化的影响成骨细胞在其生长的后期，由于细胞逐渐成熟会产生矿化结节，即钙结节。钙结节是成骨细胞矿化产生的标志产物，而成骨细胞在材料表面的成骨能力与其矿化能力有着密切联系。所以本实验通过对成骨细胞的钙结节产生情况进行分析来检测成骨细胞在两种改性聚乳酸材料表面培养的矿化情况。通过茜素红染色方法定性、定量地检测成骨细胞在两种聚合物材料上的钙结节形成情况，得图4.8和图4.9。从图4.8可以看出，随着成骨细胞在两种材料膜上的培养时间的增长，其颜色不断加深，钙结节区域增多。与接种在MPLA材料膜上的细胞每个时间段观察到的钙结节相比，接种在OGP(10-14)-MPLA材料上

47、成骨细胞的钙结节区域较密集一些。从图4.9可知，成骨细胞在两种聚合物材料上28天的培养期间的无机钙分泌量都在不断增加，但根据柱状图比较可知，OGP(10-14)-MPLA材料上培养的细胞在每个时间段测得的OD值均高于在MPLA材料上培养细胞检测到的OD值，即OGP(10-14)-MPLA材料上培养细胞分泌的无机钙含量高于MPLA上培养细胞分泌的无机钙含量。因此可知，成骨细胞在OGP(10-14)-MPLA材料上的矿化程度要高于成骨细胞在MPLA材料上的矿化效果，即OGP(10-14)-MPLA材料能更好的促进成骨细胞的矿化。图4.8 接种在OGP(10-14)-MPLA和MPLA聚合物材料表面

48、14天、21天和 24 天的成骨细胞的茜素红染色图Fig.4.8 Alizarin red S staining images of Osteoblasts were cultured with MPLA films and OGP(10-14)-MPLA films after 14 , 21 and 28days图4.9 成骨细胞在MPLA 和 OGP(10-14)-MPLA材料表面的无机钙的分泌量Fig.4.9 The extracellular calcium deposited by Osteoblasts grown on MPLA films and OGP(10-14)-MPL

49、A films after 14, 21 and 28 days of incubation, Error bars represent mean SDs (n = 4). *P 0.05, compared with MPLA.4.3 讨论生物材料在仿生骨组织工程领域的研究目的是植入生物体内对其组织、器官或功能进行诊断、治疗或替代，这需要生物材料与生物体内周围机体之间发生良好的相互作用。生物材料对于宿主生物是异体，在体内会产生某些反应或出现排异现象，临床上表现为植入材料部位发热、肿胀和疼痛等，为更好利用医用生物材料在生物体内的作用，就必须尽量促进生物材料被体内组织接受而不产生有害作用。因此，

50、仿生骨修复材料必须要保证生物材料自身以及其代谢产物在生物体内微环境中都具备良好的生物相容性。具有良好生物相容性的生物材料对生物体必须是安全无毒，无副作用的，并且能够具有细胞外基质在细胞中所起的作用，即生物材料在植入生物体后，能与生物体内周围的组织和细胞发生相互促进作用，能调控体内特殊细胞的功能反应，从而诱导生物体组织或器官的损伤部位得到修复或再生。生物相容性评价分为组织相容性评价和血液相容性评价，其中组织相容性评价主要考察的是材料与细胞的相容性，因材料细胞相容性可通过体外细胞实验使材料与体外细胞直接接触模拟体内环境，条件较方便且检测结果易分析，所以国内外对材料生物相容性研究大多以细胞相容性作为

51、评价标准。只有当生物材料在体外细胞相容性结果良好，才能进一步对材料进行体内组织相容性评价。在仿生骨修复医用材料中，评价材料的生物相容性也往往先通过体外细胞实验研究其细胞生物相容性，骨修复材料的良好细胞生物相容性主要考察细胞在材料上的生长状态，即研究材料对细胞黏附、铺展、迁移、增殖和分化以及细胞生长因子的表达等的影响。细胞与细胞外基质之间的相互作用是一个动态的过程，体内细胞外基质若发生变化，如聚乳酸材料作为细胞外基质植入生物体内，将可能导致生物体内组织能够维持附着的细胞的形态和功能也发生变化，这对于细胞的生存会产生很大的影响。植入体内生物材料所起到的作用取决于生物材料与体内组织和细胞间的相互作用

52、产生的免疫反应和与周围组织的结合能力, 主要影响因素为蛋白质的吸附，表面自由能，材料表面的亲水性/疏水性，表面电荷性质和表面拓扑结构以及生物材料的生物活性表面，这些因素既相互独立又相互配合，由这些因素构成了生物材料表面对体内组织和细胞作用的复杂性。植入体内生物材料表面为蛋白质/细胞与材料的相互作用的场所，其表面蛋白吸附能力影响材料在体内初期所体现的与组织和细胞之间的生物相容性。因此，仿生骨修复材料的生物相容性研究，可以从生物材料表面蛋白质吸附能力强弱进行研究。蛋白质在生物材料上的吸附是细胞与材料表面相互作用的前提，蛋白质与生物材料表面的吸附作用主要为非共价结合，偶尔发生共价结合，材料表面若含有

53、更多的能与蛋白质发生非共价结合的活性基团，则其表面就更有利于蛋白质的吸附。现阶段研究发现和合成了许多具有优良仿生基质材料，其表面含有大量活性基团，并通过进一步的改性引入生物活性因子，从而提高材料表面亲水性并能更好的调节材料表面的荷电性能，有助于蛋白质在材料表面的吸附。因此，材料与具有生物活性因子的OGP(10-14)结合，可促进细胞在改性材料表面的粘附和铺展细胞在生物材料上的培养，接触初期即是细胞与材料上的活性基团接触，首先考察细胞在材料上的粘附和铺展效果，若该材料具有良好亲水性及蛋白吸附能力，则有利于细胞在材料上的粘附和铺展。当细胞在材料表面粘附和铺展效果好，则会促进粘附在材料上细胞的增殖，

54、从而也会提高材料上细胞在培养后期的分化和矿化能力。因此，在选择生物材料过程中，必须要考虑到其对细胞的粘附、铺展、增值、分化和矿化等的影响，只有协调好每个方面的相互作用才能使材料具有优良的细胞相容性。本研究分别对细胞在聚乳酸改性材料表面上的黏附，铺展、增殖、分化和矿化等方面进行检测，保证材料在细胞生长的过程中都能起到促进作用，以此来评价聚乳酸仿生改性材料的细胞相容性。通过研究OGP(10-14)-MPLA和MPLA材料的细胞相容性，进而得到OGP(10-14)-MPLA材料在促进成骨细胞生长过程中起到很大的作用，即该材料具有良好的生物相容性。4.4 小结本章主要通过对成骨细胞体外培养，研究成骨细

55、胞在改性聚乳酸材料上的细胞相容性，即对细胞在MPLA 和OGP(10-14)-MPLA材料上的形态、粘附、铺展、增殖、分化和矿化等几个方面进行研究，得出以下结论：（1）成骨细胞在两种聚合物膜上培养的形态、粘附和铺展的检测结果：与MPLA材料相比，成骨细胞在OGP(10-14)-MPLA材料上的细胞形态更好，粘附数量更多，且铺展效果更好。（2）成骨细胞在两种聚合物膜上培养增殖情况检测结果：在一定时间范围内，成骨细胞在两种材料上的增值能力都在不断增强。但成骨细胞在MPLA材料上的增殖能力弱于细胞在OGP(10-14)-MPLA材料上的增殖能力。成骨细胞在OGP(10-14)-MPLA材料上增殖能力

56、较强，即更有利于细胞的增殖。（3）成骨细胞在两种聚合物膜上培养的分化情况检测结果：与MPLA材料相比，在各检测阶段，虽然两种材料上的碱性磷酸酶活性都有所增加，但成骨细胞在OGP(10-14)-MPLA材料上的碱性磷酸酶的活性均较强，更有利于成骨细胞的分化。（4）成骨细胞在两种聚合物膜上培养的矿化情况检测结果：在各检测阶段，成骨细胞在OGP(10-14)-MPLA材料上的钙分泌量均比在MPLA材料上的钙分泌量多，OGP(10-14)-MPLA材料更有利于促进成骨细胞的矿化。 通过对成骨细胞在MPLA 和 OGP(10-14)-MPLA材料上的形态、粘附、铺展、增殖、分化和矿化等几个方面的实验结果

57、可知，OGP(10-14)-MPLA材料的细胞相容性要优于MPLA材料的细胞相容性。OGP(10-14) 的引入引起MPLA材料表面的某些理化性能发生了变化，使材料表面吸附蛋白能力增强，同时带入促成骨的生物活性多肽，从而使改性材料的细胞相容性得到优化，更有利于细胞在材料上的生长。5 结论与展望5.1 结论本研究将具有促成骨作用的活性多肽成骨生长肽OGP（10-14）通过酰胺反应共价接枝到马来酸酐改性聚乳酸的支链上，获得一种新型聚乳酸基仿生骨修复材料OGP（10-14）-MPLA。采用FTIR、XPS、DSC、AAA和EA等分析方法对聚乳酸改性材料进行结构表征和性能检测；通过对改性材料的吸水率、

58、静态水接触角检测以及体外降解实验详细考察了其亲水性能和体外降解性能；最后通过体外细胞实验研究改性聚乳酸材料的细胞相容性。本研究主要研究结论如下：（1）以马来酸酐改性聚乳酸（MPLA）为原料，将成骨生长肽OGP（10-14）与MPLA通过酰胺反应，使OGP（10-14）接枝到MPLA侧链上。通过FTIR、AAA、XPS和 EA 分析结果证明：OGP（10-14）已成功接枝到 MPLA材料中，并且 OGP（10-14）在 OGP（10-14）-MPLA 材料中的平均含量为 2.46 mol/g，接枝效率是 12.40%；DSC对材料检测结果表明，OGP（10-14）-MPLA的玻璃化转变峰值温度（

59、Tg）为68.50，与MPLA材料玻璃化转变峰值温度（Tg）相比，有了一定的提高。（2）通过对MPLA和OGP（10-14） -MPLA材料的分子量、亲水性能和降解性能进行研究分析，实验结果表明：与MPLA比较，聚乳酸材料引入活性多肽使材料分子量增加，亲水性增强，降解性能稳定性较好。（3）将成骨细胞与MPLA和OGP（10-14）-MPLA聚合物材料在体外共培养，根据成骨细胞在材料上培养的形态、粘附、铺展、增殖、分化和矿化能力考察了两种改性聚乳酸材料的细胞相容性。实验结果表明：与对照组MPLA材料相比，成骨细胞在OGP（10-14）-MPLA材料上的粘附和铺展状态较好，细胞形态良好，细胞增殖、

60、分化和矿化能力都显著增强，这说明生物活性多肽OGP（10-14）引入聚乳酸材料中，促进了细胞在改性聚乳酸材料基底上的生长，即OGP（10-14）-MPLA材料具有良好的细胞相容性，在生物医学领域具有广阔的应用前景。5.2 后续工作展望本文从构建具有成骨诱导作用的骨修复材料出发，选择具有促进骨生长的活性多肽OGP（10-14）改性聚乳酸基生物材料，将 OGP（10-14）接枝到MPLA中，获得了具有成骨生物活性的改性聚乳酸材料。通过对制备得到的OGP（10-14）-MPLA材料的理化性能和细胞相容性等进行系统研究。虽成功制备得到了具有明确促成骨活性的新型仿生骨基质材料，并取得一定的研究成果，但仍