生物制药工艺概述

1、生物制药工艺概述生物制药工艺概述第1页本门课程由以下三大个别内容组成基础篇：生物制药工艺基础1技术篇： 生物分离工程技术2品种篇：主要生物药品制造工艺3生物制药工艺概述第2页生物药品类别（一）天然生物药品 1.微生物药品 microbil medicine 2.生化药品（含海洋药品） Biochemical medicine（Marine medicine）（二）生物技术药品（新生物制品） 1.DNA重组药品（DNA recombinant medicine）基因工程与蛋白质工程药品 2. 基因药品（三）合成或半合成生物药品生物制药工艺概述第3页生化药品定义、分类、特点定义：详细利用生物化学研

2、究方法，从生物体中经提取、分离、纯化等伎俩取得天然存在生化活性物质或将上述这些物质加以结构改造或人工合成创造出自然界没有新活性物质，通称生化药品(Biochemical medicine)。生物制药工艺概述第4页酶类药品辅酶类药品核苷酸与核酸类药品多肽类药品氨基酸类药品蛋白质类药品多糖类药品脂类药品分 类生物制药工艺概述第5页特 点1普通生物学特征：1天然生物药品是生物进化与自然选择结果、组成结构常较复杂，分子量普通较大，生物活性受到各种原因影响起源于生物体或其基因表示产物及其修饰物，活性高，针对性强，含有补充调整、增强、抑制、替换或纠正代谢失调功效。普通比化学药品更合理和更有效，毒性较低、安

3、全性较高，副作用较小。2天然生物药品是新型生物药品先导物，经过合理药品设计，能够创制疗效更高，作用更专一，更易为机体接收，副作用与不良反应更小新药。3生物制药工艺概述第6页特 点2特殊生物学特征：1种属特异性免疫原性2非预期多向性活性，一个细胞因子可有各种生物活性，各种细胞因子经过网络效应可产生同种生物活性。3生物制药工艺概述第7页特 点3化学特征：1含量低、杂质多、工艺复杂、收率低、技术要求高；结构复杂，生物活性受空间结构严格限制，稳定性差；2剂量小，活性高，对制品均一性，有效性，安全性，稳定性，生物活性要求严格。故常有国际标准品对照品作为测试对照。3生物制药工艺概述第8页80年代至今70-

4、80年代50-70年代有机溶剂分级分离、等电沉淀-粗提物。离子交换层析、凝胶层析、超滤等技术-提升了产品纯度和收率各种层析技术、超速离心等-高纯度生化药品生物制药工艺概述第9页尿激酶从每1mg蛋白质活力不得少于35，000单位提升到100，000单位，高于英国药典及欧洲药典水平（70，000单位），与日本药典相同。胰岛素，激肽释放酶都与国外先进水平相当。辅酶A标准从220U/mg提升到250u/mg。肝素钠出口产品也超出国外药典标准生物制药工艺概述第10页生物药品资源植 物动 物动物脏器血液、分泌物及其它代谢物微 生 物海 洋 生 物生物制药工艺概述第11页主要从以下脏器中制取生化药品生物制药

5、工艺概述第12页毒蜥Exendin-4是自毒蜥唾液中提取一个多肽，研究发觉该多肽与人体内GLP-1在序列上有53同源性，同GLP-1一样含有促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌及保护胰岛细胞等作用。年经FDA同意用于二型糖尿病治疗。Exenatide是Exendin-4人工合成品。Exenatide生物制药工艺概述第13页麻省Transmolecular企业科学家将放射性I131附着于自蝎子毒液中提取一个多肽制成药品，研究发觉该药品含有靶向性，对晚期神经胶质瘤有很好疗效，患者只需要从外部注射这种化合物，而无需再进行化疗或放射治疗。该药品当前仍处于临床研究阶段。蝎 毒 肽生物制药工艺概述第14页微

6、 生 物1利用微生物作为工具微生物代谢物 2微生物菌体3生物制药工艺概述第15页海 洋 生 物1海藻类：已知海藻有1万各种海洋动物类：腔肠动物类、节肢 动物类、软体动物类、鱼类、爬行动 物类、海洋哺乳动物类2海洋微生物：3生物制药工艺概述第16页僧袍芋螺齐考诺肽（ziconotide）最初由僧袍芋螺中提取，现已人工合成，是一个神经细胞钙通道阻断剂。作为一个非阿片类镇痛药品，用于治疗严重慢性神经性疼痛，其鞘内注射剂经FDA同意于年上市。 齐考诺肽（ziconotide）生物制药工艺概述第17页Didemnin B是一个由7个氨基酸和2个羧酸组成带有分枝环缩肽,既能抑制蛋白质合成,也能抑制DNA、

7、RNA合成,对黑色素瘤B16细胞周期作用研究表明,它可杀伤各期细胞,尤以G1至S期细胞敏感 ，它可快速完全介导HL-60细胞凋亡。当前Didemin B已能够人工全合成,该药完成了临床期试验,最有希望开发成治疗癌症新药。另外第二代didemnins-脱氢didemnins B(aplidine)现也已进入临床试验。 海鞘起源抗癌肽 Didemnin B生物制药工艺概述第18页海兔体内存在着各种结构独特、生理功效各异次生代谢产物,如萜类、毒素、甾体、大环内酯及肽类等,其中肽类化合物尤为引人注目。其中 Dolastatin15和Dolastatin10已经完成全合成,并正在美国进行期和期临床试验,

8、主要用于小细胞肺癌、卵巢癌、黑色素瘤和前列腺癌等实体瘤治疗。 海兔起源抗癌作用肽生物制药工艺概述第19页氨基酸类分类1蛋白质氨基酸：编码氨基酸非蛋白氨基酸：D型氨基酸、-氨基酸、-氨基酸等2衍生氨基酸：谷氨酰胺、硫酸甘氨酸、磷葡精氨酸等 3生物制药工艺概述第20页生物制药工艺概述第21页氨基酸生产方法蛋白水解法：胱氨酸、半胱氨酸 化学合成法：甘氨酸、蛋氨酸、丙氨 酸、苯丙氨酸、丝氨酸等发酵法：苏氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、精氨 酸、组氨酸、脯氨酸、鸟氨酸、瓜 氨酸、赖氨酸、亮氨酸等酶法：丙氨酸、天冬氨酸、色氨酸等生物制药工艺概述第22页微生物，植物细胞，动物细胞化学合成，生物合成，天然存在底 物(

9、AA前体)生物反应器含L-AA反应液L-AA酶转化法生产L-AA流程生物制药工艺概述第23页结 构分子量等电点性 质溶解性L-AspL-Ala L-Asp和L-Ala结构与性质133.1089.092.776.0酸性氨基酸中性氨基酸溶于水和盐酸，不溶于乙醇和乙醚在水中有一定溶解性，不溶于丙酮及乙醚生物制药工艺概述第24页+CO2天冬氨酸酶L-Asp脱羧酶酶转化反应工艺路线固定化 L-Asp脱羧酶转化液B延胡索酸+ NH3固定化 天冬氨酸酶转化液AL-Asp粗品L-Asp精品L-Ala粗品L-Ala精品生物制药工艺概述第25页泵储罐反应产物离心机母液回收固定化酶柱子晶体 L-AspL-Asp延胡

10、索酸氨盐工 艺 路 线生物制药工艺概述第26页氨基酸输液组方原理与配方模式生物制药工艺概述第27页不一样类型AA输液，依据在临床上用途不一样能够分为以下几类：生物制药工艺概述第28页多肽蛋白类药品生物制药工艺概述第29页生物制药工艺概述第30页多肽类药品分类：多肽激素 垂体多肽激素 促皮质素（ACTH）、促黑激素（MSH）、脂肪水解激 素（LPH） 催产素（OT），加压素 （AVP）等 下丘脑激素促甲状腺激素释放激素（TRH）、生长素抑制激素（GRIF）、促性腺激素释放激素（LHRH） 甲状腺激素 甲状旁腺激素（PTH）、降钙素（CT） 胰岛激素 胰高血糖素 胰解痉多肽 胃肠道激素 胃泌素、胆

11、囊收缩素促胰酶素（CCK-PZ）、肠泌素、肠血管 活性肽（VIP）、抑胃素（GIP）、缓激肽、P物质 胸腺激素胸腺素、胸腺肽、胸腺血清因子生物制药工艺概述第31页多肽类细胞生长调整因子表皮生长因子（EGF），转移因子（TF），心钠素（ANP）等。含有多肽成份其它生化药品 骨宁、眼生素、血活素、氨肽素、妇血宁、脑氨肽、蜂毒、蛇毒、胚胎素、 助应素、神经营养素、胎盘提取物、花粉 提取物、脾水解物、肝水解物、心脏激素等。多肽类药品分类：生物制药工艺概述第32页蛋白质激素 垂体蛋白质激素生长素（GH），催乳激素（PRL），促甲状腺素（TSH），促黄体生成激素（LH），促卵泡激素（FSH）。 促性腺激素

12、人绒毛膜促性腺激素（HCG），绝经尿促性腺激素（HMG），血清性促性腺激素（SGH）。 胰岛素及 其它蛋白质激素胰岛素，胰抗脂肝素，松弛素，尿抑胃素。 血浆蛋白质白蛋白，纤维蛋白溶酶原，血浆纤维结合蛋白（FN）,免疫丙种球蛋白，抗淋巴细胞免疫球蛋白，Veils病免疫球蛋白，抗D免疫球蛋白，抗HBs免疫球蛋白，抗血友病球蛋白，纤维蛋白原，抗凝血酶，凝血因子，凝血因子。蛋白质类药品分类生物制药工艺概述第33页蛋白质类细胞生长调整因子干扰素、（IFN）,白细胞介素17（IL），神经生长因子（NGF），肝细胞生长因子（HGF），血小板衍生生长因子（PDGF），肿瘤坏死因子(TNF)，集落刺激因子(CS

13、F)， 组织纤溶酶原激活因子(tPA)，促红细胞生成素(EPO)，骨发生蛋白（BMP）。粘蛋白胃膜素、硫酸糖肽、内在因子等。胶原蛋白明胶、阿胶等碱性蛋白质硫酸鱼精蛋白蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂凝集素PHA、ConA蛋白质类药品分类生物制药工艺概述第34页多肽化学合成概述合成原理：是一个重复添加AA过程，普通自C端向N端合成。合成方法： （1）液相合成 （2）固相合成 （1963年R.B.Merrifield 创建，并所以获1984年 获诺贝尔化学奖）1953年Du.Vigneaud等合成催产素（oxytocin,OXT ，9AA单链肽）1963年合成促肾上腺皮质激素（ACTH，39AA单链肽）

14、1965年中国科学家合成了胰岛素（Insulin，51AA双链肽）生物制药工艺概述第35页多肽合成主要步骤 氨基保护和羧基活化 羧基保护和氨基活化 接肽和去保护基氨基保护基 苄氧羰基强酸脱除 叔丁氧羰基（BOC）三氟乙酸（TFA）脱除 9-芴甲氧羰基（Fmoc）碱脱除 生物制药工艺概述第36页多肽固相合成(Fmoc保护法)（1978年改进方法，防止了强酸处理）生物制药工艺概述第37页原料选择上 清破碎 提取沉 淀 变性 复性蛋白质纯化蛋白质药品Separation and Purification纯度 活性判定合格不合格精品 发 酵 生物 组织生物制药工艺概述第38页 Protein-Sepa

15、ration原则：富含所需蛋白质多肽成分的，易于获得、易于提取、无害 （原核、真核发酵；生物组织）注意事项：种属、发育生长阶段、原料的环境、解剖部位、生物状态溶解性 稳定性 合适的溶剂原料选择提取生物制药工艺概述第39页Protein-Purification 纯化 依据目标蛋白与杂质之间差异进行纯化。1.依据蛋白质pI不一样进行纯化，其方法有：1）pI沉淀法 2）pI沉淀法与盐析法相结合3）等电聚焦法 2.蛋白质分子形状和大小不一样进行纯化，其方法有 1）凝胶过滤 2）超滤法 3） 离心法 4）透析法3.蛋白质溶解度不一样进行纯化，其方法有： a)盐溶与盐析法 b）结晶法 c）有机溶剂沉淀法

16、4.蛋白质电离性质不一样进行分离：离子交换法5.蛋白质功效专一性不一样进行纯化：亲和层析法、假亲和层析法6.蛋白质在溶剂系统中分配不一样进行纯化：萃取法7.蛋白质选择性吸附性质进行纯化：吸附法8.蛋白质其它特殊性质进行纯化生物制药工艺概述第40页分离纯化方法选择1.分离纯化早期使用方法选择特点：提取液中物质十分复杂，目标蛋白浓度较稀。方法选择标准：低分辨能力到高分辨能力，而且负荷量较大为适当。2.各种分离纯化方法使用程序标准：相同性质纯化方法普通不重复使用。纯化方法次序先后安排上要考虑到有利于降低工序，提升效率。3.分离纯化后期保护性办法4对每一步骤方法优势进行综合评价 每一个分离纯化步骤方法

17、好坏，除了从分辨本事和重现性二方面考虑外， 还注意方法本身回收率高低。生物制药工艺概述第41页纯化方法选择指南生物制药工艺概述第42页猪胰岛素牛胰岛素赖脯人胰岛素（礼来企业、速效Ins） 门冬胰岛素 （诺和诺德企业、速效Ins ） 甘精胰岛素 (安万特企业、长期有效Ins)人胰岛素（Insulin）B30 A8 ;A10 ;B30 B28 ;B29B28 A21 ;B31 ;B32 生物制药工艺概述第43页3D Structure of Insulin胰岛素二聚体（dimer）胰岛素六聚体（hexamer ）生物制药工艺概述第44页当前临床使用胰岛素起源 动物胰脏起源-经动物胰脏提取或适当提纯

18、猪、牛胰岛素 半合成胰岛素-以猪胰岛素为原料，酶修饰后得到人胰岛素重组DNA技术生产胰岛素-重组DNA技术生产人胰岛素、速效胰岛素、长期有效胰岛素生物制药工艺概述第45页1921年-从动物胰腺中提取出胰岛素，开创了人类胰岛素治疗历史。1926年-重结晶胰岛素1930s-传统中、长期有效动物胰岛素1970s-单峰胰岛素和 单组分胰岛素 70年代末-半合成胰岛素1982年-采取基因重组技术生产人胰岛素正式上市。90年代至今-重组人胰岛素类似物成功研发上市，包含超短效和长期有效人胰岛素类似物。 生物制药工艺概述第46页动物起源胰岛素（28种）药品名称生产企业药品名称生产企业ILETIN I LILL

19、Y NPH PURIFIED PORK ISOPHANE INSULIN NOVO NORDISK INC ILETIN II LILLY PROTAMINE ZINC & ILETIN I (BEEF-PORK) LILLY INSULIN NOVO NORDISK INC PROTAMINE ZINC AND ILETIN II LILLY INSULIN INSULATARD NPH NORDISK NOVO NORDISK INC PROTAMINE ZINC AND ILETIN II (PORK) LILLY INSULIN NORDISK MIXTARD (PORK) NOVO

20、NORDISK INCPROTAMINE ZINC INSULIN BRISTOL MYERS SQUIBB LENTARD NOVO NORDISK INC REGULAR ILETIN II LILLY LENTE NOVO NORDISK INC REGULAR ILETIN II (PORK) LILLY LENTE ILETIN II LILLY REGULAR PURIFIED PORK INSULIN NOVO NORDISK INC LENTE ILETIN II (PORK) LILLY REGULAR INSULIN NOVO NORDISK INCLENTE INSULI

21、N NOVO NORDISK INC SEMILENTE NOVO NORDISK INC NPH ILETIN I (BEEF-PORK) LILLY SEMILENTE INSULIN NOVO NORDISK INC NPH ILETIN II LILLY ULTRALENTE NOVO NORDISK INC NPH ILETIN II (PORK) LILLY ULTRALENTE INSULIN NOVO NORDISK INCNPH INSULIN NOVO NORDISK INC VELOSULIN NOVO NORDISK INC 生物制药工艺概述第47页半合成起源胰岛素（5

22、种）药品名称生产企业INSULATARD NPH HUMAN NOVO NORDISK INC MIXTARD HUMAN 70/30 BAYER PHARMS NOVOLIN 70/30 NOVO NORDISK INCNOVOLIN L NOVO NORDISK INCNOVOLIN N NOVO NORDISK INC生物制药工艺概述第48页基因重组起源胰岛素（27种）药品名称生产企业药品名称生产企业APIDRA SANOFI AVENTIS US LANTUS SANOFI AVENTIS US EXUBERA PFIZER LEVEMIR Novo Nordisk HUMALOG L

23、ILLY MIXTARD HUMAN 70/30 BAYER PHARMS HUMALOG MIX 50/50 LILLY NOVOLIN 70/30 Novo NordiskHUMALOG MIX 75/25 LILLY NOVOLIN L NOVO NORDISK INC HUMALOG PEN LILLYNOVOLIN N NOVO NORDISK INC HUMULIN 50/50 LILLY NOVOLIN R NOVO NORDISK INC HUMULIN 70/30 LILLY NOVOLIN R（Purified）NOVO NORDISK INC HUMULIN 70/30

24、PEN LILLYNOVOLOG NOVO NORDISK INC HUMULIN BR LILLYNOVOLOG MIX 70/30 NOVO NORDISK INC HUMULIN L LILLYVELOSULIN BR NOVO NORDISK INC HUMULIN N LILLYVELOSULIN BR HUMANNOVO NORDISK INC HUMULIN R LILLYHUMULIN U LILLYHUMULIN R PEN LILLY生物制药工艺概述第49页通化东宝 1998年12月研制出中国第一支基因重组胰岛素“甘舒霖” 甘舒霖 R- 常规重组人胰岛素注射液 甘舒霖 N-

25、 低精蛋白重组人胰岛素注射液 甘舒霖 30R- 30/70混合重组人胰岛素注射液 （ 30%常规重组人胰岛素和70%低精蛋白重组人胰岛素）深圳科兴 苏泌啉- 常规重组人胰岛素注射液 苏泌啉恩- 低精蛋白重组人胰岛素注射液 徐州万邦 万邦林- 常规重组人胰岛素注射液 万苏林猪胰岛素制剂胰岛素我国主要生产厂家其它（持有药品注册证） -南京新天生物化学制药有限企业、华西医科大学制药厂、上海第一生化 制药厂、武汉生化制药厂 等生物制药工艺概述第50页临床用胰岛素分类普通胰岛素：从动物胰脏中提取人胰岛素传统中长期有效胰岛素 长期有效人胰岛素类似物速效人胰岛素类似物非注射胰岛素生物制药工艺概述第51页传统

26、中长期有效胰岛素制剂 低精蛋白锌胰岛素：胰岛素、鱼精蛋白和锌结晶。 例：礼来企业， Humulin N(rDNA、大肠杆菌) 诺和诺德， Novolin N (rDNA、酿酒酵母) 胰岛素锌混悬液：精蛋白锌胰岛素与常规胰岛素混悬液 例：礼来企业， Humulin 30/70 (30%常规胰岛素，70%精蛋白锌胰岛素) Humulin 50/50 诺和诺德， Novolin 30/70 Novolin 50/50缺点：作用时间少于24小时作用峰值显著，夜间低血糖危险性高吸收不稳定结霜现象，因为温度过冷或过热造成胰岛素再玻璃瓶壁沉淀，丧失活性生物制药工艺概述第52页速效胰岛素特点：起效快，皮下注射

27、后15分钟起效。 达峰快，注射后15分钟起效，3060分钟到达药效高峰。药效维持时间短，大约在3小时左右（24小时）。 药代动力学特点与进餐后人体内源性胰岛素分泌十分相同，能够很好地控制当餐后血糖而且不轻易发生低血糖。起效时间 达峰时间峰连续时间 作用消除时间常规皮下Ins: 30-90min1.5-2.5h 2-4h6-8h生理Ins：0-20min30-45min2-3h3-4h生物制药工艺概述第53页 B26-30对于胰岛素结合于胰岛素受体功效无关，不过对胰岛素形成二聚体相关结构特点 。所以对此区段进行修饰将产生一些自聚合能力下降不过与胰岛素受体结合能力不变新型速效胰岛素类似物 。研制机

28、理已上市药品： Lispro 、 Aspart、Apidra生物制药工艺概述第54页 Lispro （赖脯胰岛素 ，Humalog ）是第一个用于临床速效胰岛素类似物,由美国礼来企业研制生产，将人胰岛素B28与B29位氨基酸对换。 Aspart（门冬胰岛素，Novolog ）由丹麦诺和诺德企业研制生产，结构与人胰岛素区分在于用天冬氨酸取代了B链28位上脯氨酸。APIDRA （赖谷胰岛素，Apidra ）安万特企业研制，以赖氨酸和谷氨酸分别取代了人胰岛素B3位天冬氨酸和B29位赖氨酸。生物制药工艺概述第55页长期有效胰岛素-人胰岛素类似物1. 甘精胰岛素（ glargine ）： 商品名Lant

29、us-甘氨酸替换胰岛素A链21位门冬氨酸、并在B链末端增加两 个精氨酸。 使胰岛素结合更多带正电氨基酸残基，改变等电点，使等电点由5.4上升至中性。这么，胰岛素类似物在酸性条件下可溶，在生理近中性条件下结晶。2. Insulin Detemir：商品名Levemir -胰岛素B链29位赖氨酸侧链经过酰基化连接一个N-16-烷基 酸14碳游离脂肪酸该游离脂肪酸能与白蛋白结合，延缓与胰岛素受体结合，从而延长其半衰期。 生物制药工艺概述第56页Insulin Detemir（Levemir ）诺和诺德企业研制 glargine （Lantus）安万特企业研制生物制药工艺概述第57页胰岛素肺部吸入制剂

30、-Exubera辉瑞、万安特以及Nektar 共同研发于.1.27被FDA同意一个作用快胰岛素干粉吸入剂适合用于餐前给药，其胰岛素吸收含有速效化特征生物制药工艺概述第58页胰岛素制备工艺 以动物胰脏为原料提取胰岛素 -酸醇提取法 传统胰岛素-猪、牛胰脏提取，只经一步重结晶 单峰胰岛素-凝胶过滤纯化 单组分胰岛素-凝胶过滤、离子交换纯化 半合成胰岛素-以猪胰岛素为原料，酶修饰后得到人胰岛素重组DNA技术生产人胰岛素 AB链合成：分别表示AB链，化学方法连接 逆转录法：表示胰岛素原，酶切得到重组人胰岛素生物制药工艺概述第59页Ins性质 生物制药工艺概述第60页 Insulin crystas 酸

31、醇提取法提取动物胰岛素生物制药工艺概述第61页注意事项 生物制药工艺概述第62页酶促半合成人胰岛素生物制药工艺概述第63页重组DNA技术制造人胰岛素 AB链合成法：以人工合成人胰岛素A链和B链基因分别表示A链和B链，然后再组合起来。反转录酶法：经过胰岛素原cDNA合成，表示产物是胰岛素原，经工具酶切开，除去C-肽得人胰岛素。生物制药工艺概述第64页Ins A链Ins B链转化大肠杆菌发酵A链B链纯化二硫键活性胰岛素AB链合成人胰岛素生物制药工艺概述第65页质粒Ins mRNA反转录Ins cDNA转化大肠杆菌PCR连接胰岛素原活性胰岛素二硫键酶切 提取质粒限制性内切酶酶切 反转录酶法合成人胰岛

32、素生物制药工艺概述第66页核 酸 药 物nucleic acid medicine生物制药工艺概述第67页依据化学结构和组成份类：分四类核酸碱基及其衍生物1核苷及其衍生物2核苷酸及其衍生物3多核苷酸4生物制药工艺概述第68页生物制药工艺概述第69页生物制药工艺概述第70页依据结构特点及临床应用情况分类含有天然结构核酸类物质如：肌苷、ATP、GTP、CTP、UTP、Co 等起源：提取或发酵特点：毒副作用小自然结构碱基、核苷、核酸类结构类似物如：巯嘌呤、阿糖胞苷、聚肌胞等起源：以核酸类物质为前体经过“化学法” 或“酶法”进行半合成特点：毒性较大生物制药工艺概述第71页RNA生产工业用RNA提取RN

33、A制备含有生物活性RNA制备.生物制药工艺概述第72页1、工业用RNA提取稀碱法酵母等1NaOH裂解胞壁溶液HCL中和加热破坏酶冷却到10OC离心RNA溶液调pH2-2.5（靠近RNApl）离心RNA沉淀浓盐法酵母等10NaCL90OC提取离心上清液调pH2-2.5离心RNA沉淀生物制药工艺概述第73页2、含有生物活性RNA制备生物制药工艺概述第74页从核糖核蛋白中分离RNA(1)乙醇沉淀法：核糖核蛋白溶于NaHCO3水相用含辛醇氯仿去蛋白乙醇RNA沉淀(2)盐酸胍法：核糖核蛋白24盐酸胍38OC溶解冷却至0OC离心RNA沉淀生物制药工艺概述第75页 DNA生产方法1.工业用DNA提取生物制药

34、工艺概述第76页生物制药工艺概述第77页核苷酸制备水解法发酵法半合成法直接提取法.生物制药工艺概述第78页酶水解: DNA或RNA为原料制备5核苷酸常见酶：橘青霉产生5磷酸二酯酶橘青霉培养液压滤酶液【酶解】除菌体DNA溶液酶解液加热、调pH9.0过滤DNA降解液【离子交换】吸附于氯型阴离子树脂分部洗脱脱氧核苷酸(dCMP、dAMP、dTMP、dGMP)RNA降解深入分离戊糖核苷酸生物制药工艺概述第79页碱水解：可制备3和2核苷酸生物制药工艺概述第80页发酵法生产核苷酸产氨短杆菌发酵生产肌苷酸（IMP）：腺嘌呤营养缺点型嘌呤核苷酸生物合成路径和代谢调控 R5PPRPPPRPP转酰胺酶PRAIMP

35、分解腺嘌呤阻遏GMPAMPADPATP反馈抑制SAMPAMPADPATPXMPGMPGDPGTP鸟嘌呤PPGMPATPPRPPGTP次黄嘌呤鸟嘌呤GMP生物制药工艺概述第81页IMP积累主要路径（前提）确保IMP合成路线通畅： 确保关键酶PRPP转酰胺酶活力-解除腺嘌呤及衍生物组遏和反馈抑制阻断IMP去路： 阻断SAMP合成 阻断IMP分解筛选取得缺乏SAMP合成酶腺嘌呤缺点菌株，提供亚适量腺嘌呤。使积累IMP渗透到细胞外： 增大细胞膜通透性选育Mn2+不敏感变异株生物制药工艺概述第82页发酵法生产核苷生物制药工艺概述第83页枯草芽孢杆菌嘌呤核苷酸合成路径SAMPAMPIMPGMPXMP345

36、678黄嘌呤缺点型（II）鸟嘌呤缺点型（经诱变缺失4号酶）（III）鸟嘌呤缺点型（经诱变缺失4号酶）腺嘌呤缺点型（经诱变缺失6号或7号酶）AICARSAICARPRAPRPP21（一）（一）（一）（一）1：PRPP转酰胺酶2、7：SAMP裂解酶3：IMP脱氢酶4：XMP氨化酶5：GMP还原酶6：SAMP合成酶8：AMP脱氢酶当培养基中提供限量腺嘌呤时 积累IMP 肌苷 积累IMP 肌苷 积累XMP 黄苷 枯草杆菌磷酸单酯酶活力很强ADP（）生物制药工艺概述第84页酶类药品生物制药工艺概述第85页酶分类生物制药工艺概述第86页生物制药工艺概述第87页生物制药工艺概述第88页酶类药品提取和纯化 原

37、料选择生物材料预处理提取浓缩纯化结晶生物制药工艺概述第89页动物材料预处理：（1）机械法：有绞碎、刨碎、匀浆、研磨、超声波、挤压等方法， 有些酶用机械法处理后仍不能有效提取，可结合其 他处理法。（2）冻融： 冷到-10左右，再迟缓溶解至室温，如此重复屡次。 因为细胞中冰晶形成，及剩下液体中盐浓度增高， 能使细胞中颗粒及整个细胞破碎，使酶释放出来。（3）丙酮粉：组织经丙酮快速脱水干燥制成丙酮粉，不但能够降低 酶变性，同时因细胞结组成份破碎使蛋白质与脂 质结合一些化学键打开，促使一些结酶释放到溶液中。材料预处理生物制药工艺概述第90页生物制药工艺概述第91页 酶浓缩（1）工业上：超滤、真空减压浓缩

38、、薄膜浓缩、冷冻浓缩（2）试验室： 除上述方法外，对少许样品可用以下方法 1. 用G-15或G-25浓缩 2. 用聚乙二醇浓缩生物制药工艺概述第92页注意两个问题：1.建立快速测定酶活力方法 2.建立活力回收表酶纯化：凡用于蛋白质纯化伎俩均适合用于酶纯化从大肠杆菌中提取天冬酰胺酶活力回收表生物制药工艺概述第93页酶结晶 特征：有序性，对称排列，周期性重复结构 为空间结构研究提供x-衍射样品1.酶结晶方法 迟缓改变酶蛋白溶解度，使其略处于过饱和状态。 （1）盐析法 （2）有机溶剂沉淀法 （3）复合结晶法 （4）透析平衡法 （5）等电点法既是纯化结果又是纯化伎俩生物制药工艺概述第94页2.结晶条件

39、选择酶纯度酶浓度金属离子pH温度、时间晶种生物制药工艺概述第95页 酶分离纯化工作中注意事项1. 预防酶蛋白变性2. 预防复因子丢失3. 预防酶被蛋白 水解酶降解生物制药工艺概述第96页超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）结构特点：金属酶Fe-SOD: Mw38000，2个亚基，每个亚基含1个Fe，存在 于 中 Cu、Zn-SOD: Mw3，2个亚基，每个亚基含1个Cu，1个 Zn，存在于 中Mn-SOD: 原核细胞中，Mw40000,2个亚基，每个亚基1个Mn 真核细胞中，Mw80000，4个亚基，每个亚基1个Mn真核细胞原核细胞生物制药工艺概述第97页酶性质

40、稳定性 对热稳定：天然牛血SOD可75加热数分钟，对热 稳定性与溶液离子强度相关 对pH稳定性：普通pH5.39.5较稳定，猪血SOD在 pH7.69较稳定金属辅基与酶活性关系 Cu、Zn-SOD：Zn与分子结构相关，与催化活性无关 Cu与活性相关，对酶活力是必需 Mn-SOD：Mn对酶活力是必需 Fe-SOD：Fe对酶活力是必需生物制药工艺概述第98页1.以牛血红细胞提取Cu、Zn-SOD工艺生物制药工艺概述第99页2.以牛肝为原料提取Mn-SOD工艺生物制药工艺概述第100页糖科学蛋白 核酸糖类生物化学最终巨大前沿之一生物制药工艺概述第101页生物制药工艺概述第102页Text1Text3

41、Txt5植物动物微生物海藻多糖分类（按照其起源不一样来分）生物制药工艺概述第103页多糖在细胞内存在方式游离型结合型:糖蛋白，如人参多糖、黄芪多糖等脂多糖，如胎盘脂多糖、细菌脂多糖等。生物制药工艺概述第104页多糖类药品药理活性抗氧化 调整血糖血脂 抗辐射损伤抗溃疡调整免疫功效抗病毒 抗突变 抗衰老抗肿瘤抗凝血 生物制药工艺概述第105页我国已经上市多糖药品产品名称生产单位产品类别适应症香菇多糖金陵药业股份有限企业福州梅峰制药厂中药恶性肿瘤辅助治疗灵孢多糖注射液北京协和药厂化学药品用于治疗神经官能症、多发性肌炎、皮肌炎、萎缩性肌强直与进行性肌营养不良以及因免疫功效所致各种疾病。紫芝多糖片江西大茅制药有限责任企业中药用于神经衰弱，白细胞和