反义核酸药物剖析

1、反义核酸药物剖析反义核酸药物剖析第1页一、概述 1967年，Belikova等提出了利用一段反义寡核苷酸来特异性地抑制基因表示构想。 1978年，Zamecnik和Stephenson利用一段长13个碱基反义DNA寡核苷酸链成功地抑制了劳斯（Rous）肉瘤病毒复制，引发大家极大关注。 1981年Tomizawa第一次报道了天然反义RNA生物学功效，发觉在质粒DNA复制时，与引物RNA互补RNA分子能抑制DNA复制。反义核酸药物剖析第2页 1983年Mizuno和Simon等同时发觉反义RNA调整作用，进而揭示了一个新基因表示调整机制。 20世纪80年代，寡核苷酸人工合成技术成功，反义核酸研究快

2、速发展起来。有些人将它与20年前单克隆抗体问世相比拟，认为该项技术成熟化有望取得一类能够“根治”肿瘤、遗传性疾病、病毒性疾病等各种疑难杂症新型药品。反义技术正孕育着药品学和药理学上一次革命。反义核酸药物剖析第3页 反义核酸：是指与靶DNA或RNA碱基互补，并能与之特异性结合一段DNA或RNA。 普通包含: 反义DNA（antisense DNA） 反义RNA（antisense RNA） 核酶（ribozyome）: 是含有酶活性RNA，主要参加RNA加工与成熟。反义核酸药物剖析第4页 反义寡聚核苷酸（antisense oligonucleotides， asON）：当前研究热点。是一小段与

3、mRNA或DNA特异性结合并阻断其基因表示人工合成短核酸片断。 反义核酸技术：是指利用反义核酸特异性来抑制一些基因表示技术。 反义药品：利用这一技术研制药品。反义核酸药物剖析第5页反义核酸可特异性地作用于靶基因或mRNA，从基因复制、转录、剪接、转运和翻译等各个步骤上调控基因表示，从而实现疾病治疗。药品研究与开发取决于两个主要参数： 1、确定疾病发展过程中适当靶点；2、发觉能特异性识别并能与该靶点结合化合物，从而干预疾病发展过程。反义核酸药物剖析第6页反义寡核苷酸作为药品比常规药品治疗有更高特异性。1、相关疾病靶基因mRNA序列是已知，所以，设计、合成特异性反义核酸比较轻易；2、反义寡核苷酸与

4、靶基因能经过碱基配对原剪发生特异和有效结合，从而调整基因表示。 缺点是： 天然寡核苷酸难以进入细胞内，而一旦进入又轻易被胞内核酸酶水解，极难直接用于治疗。为此，大家采取药品化学原理和方法，对天然寡核苷酸进行化学修饰，以到达治疗药品要求。反义核酸药物剖析第7页 国外已经有反义药品应用于临床,杂志1998年7月报道了第一个经过认证反义药品,即用于治疗艾滋病人巨细胞病毒感染视网膜炎福米韦生(, ),这是ISIS企业一大结果, 另外还有各种反义药品包含核酶在内新一代反义药品进入临床。反义核酸药物剖析第8页二、反义药品作用机理 反义核酸可在复制、转录、剪接、转运和翻译 等各个步骤上发挥调控作用。 其机制

5、为： 反义核酸药物剖析第9页1、在DNA复制水平上： 反义RNA可作为DNA复制抑制因子，它可与引物RNA互补结合，抑制DNA复制，从而控制复制频率。 比如： 大肠杆菌质粒Pmb1(Col E1)复制是经过 RNA I（反义RNA）实现抑制作用。反义核酸药物剖析第10页 该质粒复制起始时，引物 (RNA II) 与其模板链结合，并在DNA聚合酶参加下合成新DNA子链。不过很快就有一个长约100个核苷酸反义RNA分子 (RNA I) 生成。 RNA I与RNA II -552-447核苷酸互补,且互补区位于复制起始位点上游,它在Col E1复制过程中能与RNA5-末端互补结合，使其构型改变，从而

6、妨碍了RNA与DNA模板链结合，RNA不再起到引物作用，质粒DNA复制 终止。 见图示： 反义核酸药物剖析第11页Colicin Immunity ProteinRNAIIRNAIOriginColE1(6646 bp)Replication of the ColE1 PlasmidColE1 replication is unidirectionalRepliconColicin反义核酸药物剖析第12页 2、在转录水平上： 反义RNA可与mRNA 5-端互补,从而阻止了RNA完整转录。大肠杆菌cAMP受体蛋白基因（CRP)转录会受到一个小分子反义RNA制约。这种反义RNA可与CRP基因转录起

7、始生成mRAN分子5-端序列互补，形成特异二级结构，它类似于能促使转录作用终止柄-环结构，空间构象障碍迫使RNA聚合酶脱离DNA模板，停顿转录。 反义核酸药物剖析第13页反义核酸药物剖析第14页反义核酸药物剖析第15页3、在翻译水平上（主要调控形式）：主要表现在三个方面：1、一是与mRNA5-端非编码区（包含ShineDalgarno，SD序列）序列结合，直接抑制翻译；2、二是与mRNA 5-端编码区，主要是起始密码AUG结合，抑制翻译起始；3、三是与靶mRNA非编码区互补结合，使mRNA构象改变，影响它与核糖体结合，间接抑制了mRNA翻译。反义核酸药物剖析第16页GGAGG 反义核酸药物剖析

8、第17页反义核酸药物剖析第18页反义核酸药物剖析第19页1、作用于mRNA 5-末端，阻止帽子结构形成；2、作用于外显子和内含子连结区，阻止前体mRNA剪接；3、作用于PolyA形成位点，阻止mRNA成熟及向胞浆转运；4、与mRNA结合，使得mRNA易被酶识别而被降解，从而使蛋白质表示受到抑制。真核细胞中反义RNA除了上述三个水平发挥作用外，在以下阶段也展现功效：反义核酸药物剖析第20页反义核酸药物剖析第21页核酶()技术核酶是一类本身含有酶剪切活性,也是反义技术一个别,它能序列特异地催化切割靶,故也可用来封闭功效。核酶作用原理为核酶特异性序列经过互补碱基对形成识别并结合特异性靶,故能够人工设

9、计针对某一靶核酶,破坏靶。最近还有些人将多个不一样核酶连接在一起使切割效率大大提升,已试用于临床,其治疗范围也已从单基因疾病扩充至多基因疾病。反义核酸药物剖析第22页另外,在核酶基础上,大家又提出了反义核酶概念,即经过基因连接将反义与核酶基因连为一体,再转录得到含有双重功效一类分子,对靶基因现有封闭作用,又有切割作用。当前核酶在基因治疗领域中颇受瞩目,属研究热点。核酶药品多年来利用反义核酸和核酶进行抗病毒治疗已经有进展。将核酶基因以适当载体导入细胞内，在细胞内转录产生核酶，从而发挥抗病毒作用。反义核酸药物剖析第23页反义RNA调整翻译基础原理是：1、反义RNA与mRNA有互补序列，依据碱基互补

10、标准，能相互结合，形成mRNA-反义RNA杂交体，阻断mRNA翻译。2、反义RNA和mRNA结合可发生在细胞核中，也可发生在细胞质中。如发生在核中，就会干扰mRNA加帽和加尾以及剪接和加工过程，也会干扰mRNA从细胞核向细胞质转运。3、RNA杂交分子不稳定，易被核酸酶降解。4、反义RNA与胞质中成熟mRNA杂交，抑制其翻译成蛋白质。反义核酸药物剖析第24页特 点 选择性强: asON只作用于靶基因,不与非相关基因作用,特异性高，且片断短,合成方便、经济;效率高: asON几乎能够完全阻断靶基因翻译;低毒: asON作用于局部,对全身影响小。三、反义药品特点,设计和导入方法反义核酸药物剖析第25

11、页反义核酸药品是药理学新领域或革命:新药品反义寡核苷酸新药品受体mRNA新受体结合方式Watson-Crick杂交新药品受体结合后反应: （1） RNase H介导靶RNA 降解；（2）抑制DNA 复制和转录及转录后加工和翻译等。反义核酸药物剖析第26页设计能特异地识别靶基因,并能与之稳定结合;有较长半衰期及较强耐受核酸酶消化能力;能经过靶细胞膜,有效抵达作用部位。反义核酸药物剖析第27页 导入方法1、RNA病毒感染;2、脂质体包裹反义寡核苷酸；3、显微注射;4、逆转录病毒;5、腺病毒介导等方法。 另外,利用抗体、阳离子多肽、维生素等也可增加as抵达靶细胞能力。反义核酸药物剖析第28页四、 反

12、义核酸类药品必需符合条件1、选择性() 当前,许多癌基因和病毒基因序列已经搞清。所以,只对其序列选择一个区段，设计所要合成反义/ 序列。这些区段主要包含: 5端帽子结构区; 起始编码区或编码区; 核前体拼接区; 反转录病毒引物区等。 反义核酸药物剖析第29页 这些区段均为基因表示关键区或敏感区,对基因调控起主要作用。 普通而言,只要人工设计合成15-20个碱基长度反义或反义,就足以使此反义核酸与靶形成结合作用,且这种结合调整是非常特异性。反义核酸药物剖析第30页2、稳定性() asON功效在很大程度上取决于其稳定性,asOD在体内生理条件下,很轻易被各种核酸酶降解,这么就根本无法到达阻遏翻译目

13、标。所以,大家对反义核酸结构进行各种化学修饰以提升其稳定性,增加对核酸酶抗性。反义核酸药物剖析第31页 碱基是asON与靶基因经过氢键形成而直接接触部位,而氢键形成又是asON发挥功效必要条件。所以,该部位修饰应以不影响氢键形成为前提。任何影响A-T（U）/G-C碱基配正确修饰都会因碱基错配而造成asON与靶基因结合或特异性降低或丢失。 如： 1、在胞嘧啶5位点甲基化（最常使用） 2、使用三氟甲基、咪唑丙基、炔丙基等。 （1）碱基修饰：反义核酸药物剖析第32页 DNA chain-CH3反义核酸药物剖析第33页（2）骨架修饰第1条路径-磷修饰: 磷原子是核酸酶主要攻击位点,修饰后效果显著。磷修

14、饰包含硫代、甲基化、氨化、酯化等,尤以硫代磷酸寡核苷酸(phosphoroth-ioteoligonucletide,PS-ODN)最为常见,称为“第一代反义药品”。 PS-ODN是至今研究最深入、应用最广泛一类asODN，它有效增强了对核酸酶稳定性、含有良好水溶性及易于大量合成，基础能满足临床治疗需要。反义核酸药物剖析第34页PS-ODN与天然ODN相比：经过细胞内吞作用进入细胞内平衡所需时间更长最终细胞内浓度也更高；t1/2普通都大于24h，极大提升了对核酸酶耐受力； 但因为PS-ODN其本身带有大量负电荷，能与各种因子结合从而造成非特异效应。在体内表现出剂量依赖毒副作用。反义核酸药物剖析

15、第35页反义核酸药物剖析第36页第2条路径-糖环修饰: 糖环修饰包含构型、1位取代、2位取代、3- 3 连接、5 5 连接等。原理是使核酸酶不能有效识别磷酸二酯键。构型修饰: 是指将天然或型糖苷键替换成构型,使核酸酶不能有效地识别其磷酸二酯键。1位取代、2位取代: 指将戊糖1 2位引入一些取代基。如烷基、烷化剂等。嵌入特殊功效分子后,也使as具备更强核酸酶抗性，但不影响亲和力。反义核酸药物剖析第37页33 55连接修饰: 考虑到核酸酶只识别3 ,5磷酸二酯键, 故合成一类含有33 55颠倒连接末端asON(asON),结果使核酸酶不能识别。反义核酸药物剖析第38页第3条路径-肽骨架 基于asO

16、N发挥特异性抑制基因表示关键在于其碱基排列次序,而与易于降解磷酸和糖环组成磷酸二酯键骨架无关。所以,asOD磷酸-糖骨架以肽键取代，得到新型化合物-多肽核酸( , )。 因为结构上PNA与DNA类似，其两相邻碱基间距及碱基与类肽链骨架间距离均相近，PNA与DNA以及RNA与PNA之间均可形成碱基配对。反义核酸药物剖析第39页 假肽取代磷酸二酯键后其： 特异性更强， 带电荷少、 不被蛋白酶和核酸酶识别, 亲和性更高, 副作用降低。 含有比前两代反义寡核苷酸更加好亲和力和最少相同序列特异性，而且也有相当抗病毒活性。称为第三代反义核酸。最近这种肽核酸研究很多。反义核酸药物剖析第40页反义核酸药物剖析

17、第41页 即综合应用各种化学修饰,效果很好,有“第二代反义药品”之称。它以PS-ODN为关键，两翼序列上核糖2位被其它基团修饰。除了化学修饰，还能够试作转基因表示反义核酸，在体细胞内以DNA为模板转录产生,模拟天然形成过程,这么表示反义可能在细胞内被天然修饰,从而稳定性得到提升。 第4条路径-构建嵌合体结构反义核酸反义核酸药物剖析第42页3、溶解性() 从反义核酸作用原理来看,它必须溶解于水且又能透过细胞膜,进入细胞中才能与发生作用。故asON水溶性与脂溶性必需有一个恰到好处平衡。因为asON带负电荷且有较强亲水性,所以不易与带一样电荷靶细胞接触,更不易透过由脂质双分子层组成细胞膜进入细胞内。

18、化学修饰是处理这一问题有效伎俩,修饰路径包含引入亲脂性基团和改变其负电性等。反义核酸药物剖析第43页五、反义药品临床应用 asON 能经过封闭或抑制肿瘤细胞和病毒关键编码基因来特异性抑制肿瘤细胞增殖和病毒复制，是治疗肿瘤和病毒性传染病潜在新型药品。 反义核酸药物剖析第44页1、在癌症方面应用 反义核酸技术特异性抑制癌基因表示,进而抑制肿瘤细胞增殖已取得极大成功。已完成期临床 (蛋白激酶 )反义化合物(3521),可使卵巢癌患者盆腔肿瘤块消退。在期临床试验中可使结肠癌患者癌胚抗原()维持稳定。预计在很快未来,针对各种癌基因和生长因子反义药品将陆续投放市场,为肿瘤治疗提供一条新分子靶向路径。反义核

19、酸药物剖析第45页多年来,反义药品应用于抗癌研究又包括到新领域。研究发觉,浸润和转移是恶性肿瘤生物学特征。文件认为乙酰肝素酶与黑素瘤细胞潜在性转移相关连,神经生长因子()或神经性营养因子 3( 3)不但增加黑素瘤细胞乙酰肝素酶生成,而且有力促进其基质胶渗透。以黑素瘤细胞75(75抑癌基因受体)为反义靶点,反义能降低 3与75结合和基质胶渗透,到达抑制黑素瘤细胞浸润。反义核酸药物剖析第46页 同时,研究还发觉,肿瘤生长和转移均依赖于血管生成,而血管生成早期一个关键步骤就是激活内皮细胞产生尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂()。等应用反义(受体)拮抗与结合后血管生成转换,进而抑制葡萄糖吸收、二酰基甘油()

20、合成,活化,有效阻滞内皮细胞增殖和化学趋化性、化学浸入。反义核酸药物剖析第47页2、在抗病毒方面应用 当前还难以找到特异性抗病毒药品,反义药品出现,如治疗人免疫缺点病毒91、0193、177,人乳头瘤病毒2195等,为处理抗病毒药品特异性问题提供了有力武器。反义药品福米伟生()已完成新药应用()登记,成为第一个取得美国食品与药品管理局()同意治疗艾滋病相关巨细胞病毒()反义药品。反义核酸药物剖析第48页 依据文件提供治疗视网膜炎研究结果表明,能显著延缓视网膜炎病情进展,18名接收治疗(每七天玻璃体内给药一次,连续三周,然后隔月给药)患者病情进展平均时间为71,而对照组为14。常见不良反应是眼内

21、压升高(18.5%),轻至中度可逆转眼内炎症(15%)。反义核酸药物剖析第49页 因为反义为多聚阴离子,含有不易透过细胞膜,细胞难于吸收,胞内积累较少缺点。怎样增加反义细胞吸收,增加其抗病毒活性,成为许多学者研究重点。在人肠癌细胞,文件验证了与含肠冠状病毒基因间同感序列峰形蛋白起始编码区完全互补18聚反义抗病毒活性:1.磷酸二酯病毒抑制率为12%34%,2.经修饰硫代磷酸以环糊精衍生物为载体磷酸二酯病毒抑制率分别为56%90%和90%,为提升反义抗病毒活性提供了有效路径。反义核酸药物剖析第50页3、在心血管方面应用 以去唾液酸糖蛋白()载体分子偶合反义与胆固醇喂养兔动脉粥样硬化间关系。结果显示

22、：注射反义兔与对照组和有义()相比较,不但胆甾型酯转移蛋白()降低和低密脂蛋白()受体增加,而且主动脉胆甾醇含量及主动脉表面积病变百分率显著减低,有效抑制主动脉粥样硬化发展。反义核酸药物剖析第51页用 1(胞外信号调整激酶)和 2反义降低蛋白表示(83%和75%),从而反义抑制油酸和血管担心素所致协同有丝分裂反应,缓解肥胖性高血压患者血管平滑肌病变。反义核酸药物剖析第52页六、反义药品给药路径 最初反义药品是采取局部注射给药。最新临床前研究表明,反义寡核苷酸药品经修饰可制成不一样制剂,包含口服制剂,扩充了其治疗应用范围。处于临床试验第一代反义药品均是经过静脉输注或皮下和眼玻璃体注射给药,临床资

23、料表明,这种给药方式可使药品直达作用靶位。反义核酸药物剖析第53页来自ISIS和Hybridon两家企业临床前研究显示,反义寡核苷酸经肠道吸收、透皮和吸入等路径给药安全有效。研究人员采取在体肠道再灌注模型,发觉经过改变寡核苷酸化学结构以及使用渗透促进剂,可使药品生物利用度到达15%20%,非常靠近口服生物利用度,这说明口服反义药品是可行。透皮吸收亦为一有效给药路径,临床前研究显示,以乳膏剂型局部应用反义化合物,可在表皮或真皮形成达治疗浓度、具药理活性寡核苷酸层。反义核酸药物剖析第54页另外,经过变更药剂组成,可改变寡核苷酸所抵达皮肤部位,这对用于不一样疾病至关主要。在鼠和猴试验中,采取吸入方式给以硫代磷酸寡核苷酸药品,随即便在血浆和一些器官发觉了原型寡核苷酸,这表明此给药方式能抵达全身性释药效果。基于这些研究结果,ISIS企业希望其反义药品ISIS-2302在进行期临床试验时,能用其灌肠制剂治疗溃疡性结肠炎,用其吸入制剂治疗哮喘,用其外用制剂治疗牛皮癣。反义核酸药物剖析第55页INEX企业专门研制开发了寡核苷酸脂质体产品,便于口服,且可防止核酸酶降解作用及与血浆蛋白结合。INX-6295是一个抗c-myc基因(存在于各种恶性肿瘤,包含黑色素瘤、肺、乳腺和结肠直肠癌)脂质体包囊型反义药品,体外研究显示:它与阿霉素联用具抗