李金明 聚合酶链反应(PCR)及其应用

1、聚合酶链反应(PCR)测定技术及其临床应用卫生部临床检验中心 李金明Telmail: ljm63hnPCR?PCR只是一个简单的不起眼玩艺凯利穆利斯（Kary Mullis)PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术。后者又上升成为新的概念。 摘自MakingPCR: A Story ofBiotechnology by PaulRabinowKary Mullis什么是PCR?我不认为PCR能够用两种“革命”(政治革命和科学革命)加以说明。它的发明并没有改变基因操作的本质。有了PCR，我们能在更广的范围内更快、更容易

2、地进行基因操作 。它只不过是一种新工具。凯利穆利斯（Kary Mullis)PCR及有关技术的发展历史（1）1983 Cetus 公司的 K. Mullis在这年底（12月16日第一次成功实验）发明了PCR。“这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝DNA片段的方法是在不可想象的情况下，即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。-KB Mullis, The unusual origins of the Polymerase Chain Reaction.Scientific American. 1990,April:56-65.PCR发明过程的简单回顾“ 只有当PCR仪被造出来,或被

3、开发出来后,PCR方法才成为有用的技术 ” 享利厄利克“ 不应该将诺贝尔奖授予凯利一个人,也不应该将这个奖授予凯利和其他人，我们的工作干得很出色，几乎无懈可击” 兰德尔才木“ 真正惊人的是PCR完全不是为解决某一个难题而设计的,该技术成熟之后,它所能解决 的难题才开始涌现” 史蒂文沙夫PCR及有关技术的发展历史（2）1985关于PCR 的文章首次由Cetus公司Saiki等人在Science 上 发 表 (R. Saiki, S. Scharf, F. Faloona, K.Mullis, G. Horn, H. Erlich and N. Arnheim)1987 KB Mullis et

4、al. ”Specific synthesis of DNA in vitrovia a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods inEnzymology 155:335PCR及有关技术的发展历史（3）1987 当年7月Cetus 公司在美国获得PCR基本技术专利批准。1985年底成立的Perkin-Elmer Cetus仪器公司 （ PECI ） 于这一年的11月推出了第一 个PCR试剂产品及第一台热循环仪。1989 Science (1988)报道了耐热性DNA多聚酶 Taq 酶的发现,预示着分子时代的到来。1989年12月Science杂

5、志将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。Hoffmann-La Roche 公司和Cetus 开 始合作将PCR应用于临床诊断 。RK Saiki, KB Mullis et al. (1988) ”Primer-directed enzymaticamplification of DNA with a thermo-stable DNA polymerase”, Science239:487Taq DNA polymeraseThermusaquaticusTaq DNA polymerase A thermostable DNA polymerase from Thermus

6、 aquaticus.PCR及有关技术的发展历史（4）l DuPont理由是，1971年PCR的雏形已由Khorana一系列文章阐明，并公布于众，应当是公共产权。斯坦福大学Kornberg（研究DNA聚合酶获诺贝尔奖）也认为，任何具备生物技术知识的人都可以从Khorana等的文章中推知如何操作PCR。PCR及有关技术的发展历史（5）Study on polynucleotides: repair replicationof short synthetic DNAs as catalyzed byDNA polymerases. J Mol Biol, 1971, 56:341“经过DNA变性，

7、与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。核酸体外扩增最早设想不能实现的原因:当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物；当时(1970)Smith等发现了内切酶，体外克隆基因成为可能H.G. Khorana美国MIT教授、1968年诺贝尔医学奖得主The article from 1971 in which Kleppe et al. describe Repairreplication basically the same principle as PCR!J. Mol. Biol. (1971) 56 341-361PCR及有关技术的发展历史（6）1990

8、Cetus科学家 D.Gelfand和S.Stoffel发明了纯 化Taq DNA 多聚酶的方法。Cetus 科学家H. Erlich 和K. Mullis在德国临床化学领域获得生化分析奖。1991 TaqMan 技 术 发 表。当年11月Hoffmann-La Roche公司从Cetus获得全球 的PCR专利权。Roche Molecular Systems 创建了单一耐热多聚酶rTth 进行RT-PCR技术，并用于临床RNA病毒检测。耐热逆转录酶首次由Cetus科学家发现并报道。实时荧光PCR技术1986年末 RussHiguchi来到PCR的诞生地Cetus公司工作探讨“闭管PCR”的可

9、能“溴化乙锭”的使用光导纤维的使用实时荧光PCR技术发展历程l 1991年Cetus公司的Holland等在Proc Natl AcadSci U S A 上发表了TaqMan probes技术。l 1993年美国Applied Biosystems, Division ofPerkin-Elmer 的Lee 等在Nucleic Acids Research杂志上发表了使用双荧光标记的实时荧光PCR方法。l 1996年美国纽约公共卫生研究所(Public HealthResearch Institute) Tyagi和Kramer在NatBiotechnol上发表了分子信标(Molecular

10、beacons)方法。PCR及有关技术的发展历史（7）1992 当年3月Cetus 公司获得Taq酶、热循环扩增仪等专利；1993 AMPLICOR HCV*首次用于临床RNA PCR标准试剂盒。Kary Mullis 因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。PCR及有关技术的发展历史（8）九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开l 1998年 实时荧光PCR技术开始在中国较广泛的应用于临床检测l 1999年 西方发达国家尝试将PCR应用于血液筛查PCR 循环 第一步 加热变性靶序列靶序列PCR 循环- 第二步 引物与靶序列退火PCR 循环 - 第三步 - 引物延伸第1个 PCR 循环完成后 得到两个

11、拷贝的靶序列30次循环后靶序列扩增的数量No. of No. AmpliconCycles Copies of Target1 cycle = 2 Amplicon122 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon244 cycle = 16 Amplicon384165 cycle = 32 Amplicon5326 cycle = 64 Amplicon66420301,048,5761,073,741,8247 cycle = 128 AmpliconPCR扩增过程图示PCR扩增的理论模式PCR扩增为指数扩增，每一扩增周期后产物的量可以下式表达：Y =Y

12、 (1+E) = Y (1+E)2= X(1+E)nnn-1n-20E1其中E表示扩增效率，Yn表示在n个周期后PCR产物的分子数量，Yn-1为n-1个周期后PCR产物的分子数量。等式仅在限定的扩增周期数（通常为20或30）内成立。超过此周期数，扩增过程即由指数扩增降低至稳定的扩增速率，最终达到平台，不再扩增.影响PCR扩增效率的因素: PCR定量的困难?l 引物/靶的杂交l 反应试剂的相对量l 样本在扩增仪中的位置的不同l 临床样本中DNA聚合酶抑制物的存在l PCR扩增模板的量l 靶核酸链的再退火及酶过量可致E降低PCR 和定量问题nnn高浓度/高效率高浓度/低效率低浓度/高效率log-p

13、hase analysisend-point analysisNN :扩增分子的数目n :扩增循环的次数n定量PCR与定性PCR测定的最根本的区别定量PCR测定的测定点为PCR扩增的指数扩增期;而定性PCR测定的测定点则多为PCR扩增的平台期。定性PCR测定方法l 荧光PCR（ Taq Man和分子信标等）l PCR-膜上杂交l PCR-ELISAl PCR-RFLP或测序等定量PCR的方法l 定量PCR方法可归为三大类，即外标方法、动力学方法和内标共扩增方法l 定量还可分为绝对定量（即测定X的分子数量）和相对定量（即测定不同样本中X的比率）用外标准的定量PCR方法使用外标的定量PCR方法的优

14、缺点l 优点：（1）方法简便，容易建立；（2）使用双孔重复测定，这种方法可得到非常准确的结果，甚至可排除管间的差异，但不能排除样本间的差异；l 缺点：（1）PCR反应体系中小的区别也会对测定造成较大的影响。由于最后在扩增效率上的差异，从而使得定量测定精密度和重复性不佳。l 因此，如果建立一个使用外标准的PCR定量方法，则必须进行方法的精密度（批内变异）和重复性（批间变异）分析，以确定其应用的局限性。TaqMan实时荧光定量PCR荧光共振能量转移（Fluorescenceresonance energy transfer，FRET）l FRET首先是由Fster于1948年提出。l 当一个荧光基

15、团与一个荧光淬灭基团（可以淬灭前者的发射光谱）距离邻近至一定范围时，就会发生荧光能量转移，淬灭基团会吸收荧光基团在激发光作用下的激发荧光，从而使其发不出荧光。但如果荧光基团一旦与淬灭基团分开，淬灭作用即消失。纵坐标为Ct值横坐标为起始拷贝数时的数学模型基本计算公式的推导Yn = X ( 1+E )n (1)其中，Yn 为第n个循环后扩增产物的量，X为原模板数，E为扩增效率，n为扩增循环数。在扩增达到阈值线时，此时，n = Ct，于是，扩增产物的量为：YCt = X ( 1+E )Ct (2)YCt 为荧光信号达到阈值强度时扩增产物的量。在阈值线设定以后，它就是一个常数。（2）式两边同时取对数，

16、得：Log YCt = LogX ( 1+E )Ct (3)亦即：Log YCt = LogX +CtLog ( 1+E ) （4）纵坐标为Ct值横坐标为起始拷贝数时的数学模型LogX = -CtLog ( 1+E ) + Log YCt (5)可变换为:Ct =( -1/log(1+E) Log X +Log YCt / log(1+E) (7)l A= -1/log(1+E), B= Log YCt / log(1+E)l 如果扩增效率为1（100%），则斜率A =-1/log2=-3.32l 如果扩增效率为0.5（100%），则斜率A =-1/log1.5=-5.68纵坐标为Ct值横坐标

17、为起始拷贝数时的数学模型l 此种计算模式下，斜率A必-3.32。l 截距B则为原始模板趋向于0亦阴性标本检测的Ct 值，因此，一个实时荧光PCR，如果设定的扩增循环数为40，则其截距B即应40。日常扩增的实时荧光曲线所蕴含的信息分子信标实时荧光定量PCR使用非竞争性内标准的定量PCR方法l 非竞争性内标准：（1）一般为与靶核酸无关的基因组；（2）既可是内源的也可是外源的；（3）与靶核酸无相同的引物结合位点和扩增序列。l 对于DNA的扩增，非竞争性内标几乎所有的基因都可应用，最常用的有丙酮酸脱氢酶、前脑啡肽或肌动蛋白的基因。l 而对RNA的扩增，则非竞争性内标较难寻找。理想的mRNA内标应该在整

18、个细胞周期中表达的水平变化不大，此外，其表达水平应接近于靶RNA，而且它们的扩增效率应相等，因此两者扩增线性区域是重合的。已有许多的mRNA被尝试用来作为此种内标，如HLA、肌动蛋白、GPDH和组蛋白H3.3的mRNA或14S rRNA等。以非竞争性内标定量的主要优点l 内标的制备简单l 复管测定可排除管间差异，并且在一定程度上，可排除样本间的差异。以非竞争性内标定量的缺点l 内标准和靶核酸的逆转录的效率有可能不同，并且有可能既使针对的是相同的靶核酸逆转录效率也会有很大差异。因此，使用这种方法进行RNA的定量PCR测定极为困难。l 在扩增过程中的指数期测定可对原始模板相对定量，但如果没有验证在

19、一定的扩增周期内靶核酸和内标有相同的扩增效率，则不能进行绝对定量。使用竞争性内标准的定量PCR方法l “竞争性”内标：人为构建的可与原始靶核酸竞争酶、核苷酸和引物分子的核酸标准，其特点是，与靶核酸具有相同的引物结合位点、但引物之间的顺序需加以修饰，使得扩增产物在检测时能够很容易地通过诸如凝胶电泳、探针杂交或高效液相层析等方法区分。l 对内标准的修饰方法包括对野生型基因组的点突变、部份缺失或插入外来顺序等，目前尚无通用的规则或程序来构建这种内标准。使用竞争性内标准的定量PCR方法l 使用竞争性内标既可进行相对定量也可进行绝对定量。l 相对定量具有很好的精密度和重复性。而绝对定量，关键是要证明竞争性内标和野生型靶核酸的扩增效率相同。亦可将竞争性内标置于含已知量的野生型靶核酸的样本中同时扩增来评价。使用竞争性内标准的定量PCR方法l 要定量单份的临床样本，必须进行数管竞争性PCR测定，每管中靶核酸的量不变，但改变竞争性内标的量，因为只有当待测靶核酸与竞争性内标等摩尔量时才能有可靠的定量。l 由于竞争性PCR可排除管间和样本间的差异，因此，其可作为准确的PCR定量方法，适用于绝对定量及含低拷贝数样本的定量。定量和定性PCR测定的临床应用及应注意的问题l 为什么要做定量测定？l 定性和定量测定结果报告上的混淆。为什么要做定量测定？l 用于已知病毒感染