针刺对胶原性关节炎Cx43基因敲除鼠血清TNFα的影响

1、针刺对胶原性关节炎Cx43基因敲除鼠血清TNF-的影响【摘要】目的讨论针刺对胶原性关节炎(llagen-induedarthritis，IA)模型x43基因敲除小鼠治疗作用的途径及分子机制。方法用牛型胶原免疫野生型(x43+/+)及杂合型(x43+/-)小鼠，诱导关节炎建立IA模型，初次免疫后第3周开场针刺治疗，观察其发病程度及外周血血清中肿瘤坏死因子(TNF-)的变化。结果针刺降低x43+/+IA小鼠关节炎指数和外周血TNF-比x43+/-IA小鼠明显(P0.01)。结论针刺疗效与x43有关，通过缝隙连接蛋白起作用;抑制胶原性关节炎小鼠血清中的TNF-;可能是其治疗类风湿关节炎的作用机制之一

2、。【关键词】针刺;x43;型胶原性关节炎;肿瘤坏死因子-Abstrat：bjetiveTexplrethetherapeutieffetfaupunturellagen-induedarthritis(IA)inx43knkutie.ethdsHeterzygtes(x43+/-)andild-types(x43+/+)ieereusedtindueIAusedel.Aupuntureasarriedutfrthethirdeek.Atthesaetie,arthritissreandnsetfarthritisasrerded.Aftertreatentithaupunture,sellin

3、gindexfjintandseruTNF-levelereexained.ResultsTheresultsshedthataupuntureulddereasethesellingindexfjintsandlevelfTNF-.nlusinTheeffetfaupunturenIAieisassiatedithx43.TregulatethelevelfTNF-aisneftheainehanisfaupunturettreatRA.Keyrds：x43;Aupunture;llageninduedarthritis;TNF-具有二千五百余年历史的针灸疗法是我国传统医学的瑰宝，长期的临床

4、理论已证实针刺对类风湿关节炎(RheuatidArthritis，RA)的有效性，尤其是对关节疼痛的缓解和炎症的控制。近年来越来越多的实验研究和临床研究显示针灸能调节RA患者和模型动物的免疫和内分泌功能、改善血循环等1。前期的研究显示缝隙连接蛋白(x43)与经络有着高度的相关性24。本研究通过观察针刺对x43+/-和x43+/+IA小鼠的关节炎指数和血清中TNF-的变化，在分子程度上讨论针刺在x43IA小鼠治疗作用中的途径和可能机制。1材料与仪器1.1动物及饲养条件x43基因敲除杂合型B6;129S-GjaltlKdr/J小鼠(x43+/-)从美国JaksnLabratry购置，在其子鼠出生后

5、第21天利用PR技术进展基因类型鉴定。将产生的x43+/-和x43+/+小鼠作为研究对象，选择810周龄的雄性小鼠。均在无菌条件(speifipathgenfree，SPF)下饲养。1.2试剂牛型胶原蛋白(llagen，)、完全弗氏佐剂(pleteFreundsadjuvant，FA)购自美国hndrex公司，TNF-试剂盒购自深圳晶美公司。1.3仪器酶标仪ELX800型，Bi-tek，美国产。2方法2.1IA小鼠模型的制备液态的与FA等体积混合，充分乳化，对x43+/-和x43+/+小鼠进展造模。首次免疫在小鼠尾部距尾基部23处皮内注射0.1l乳剂(含0.1g和0.25g结核分枝杆菌)，第2

6、1天在小鼠尾基部按上述方法加强免疫。对照组用FA与冰醋酸等体积混合，充分乳化后进展免疫(剂量、方法同实验组)。2.2分组未造模的x43+/+和x43+/-小鼠分别设为A、B对照组，将造模成功的x43+/+小鼠按随机分配的原那么分为、E组;将造模成功的x43+/-小鼠按随机原那么分为D、F组。详细分组情况如下：A组：x43+/+对照组;B组：x43+/-对照组;组：x43+/+IA未治疗组;D组：x43+/-IA未治疗组;E组：x43+/+IA针刺治疗组;F组：x43+/-IA针刺治疗组。每组各4只小鼠。2.3针刺治疗方法针刺组小鼠以自制布袋固定，选取双侧足三里(后三里)穴(膝关节下外侧，腓骨小

7、头下3.5处)，直刺3。E、F组治疗从首次免疫后第4周开场，1次/d，连续3周，共21次。2.4关节炎评分首次免疫后18d每天观察小鼠成模情况，并根据肉眼所见的关节炎严重程度进展临床评分，各关节病变程度按4分评分法(详见hndrex公司)：0分，关节正常;1分，轻度关节肿胀伴或不伴红斑，无关节变形;2分，明显关节肿胀，但无关节变形;3分，关节强直或变形。四肢合计最高评分为12分。2.5TNF-的测定在针刺治疗后3周眶静脉取血，离心取血清，置-80冰箱保存备用。采用ELISA试剂盒，并按试剂盒说明进展检测。结果采用urveExpert1.38作标准曲线并计算浓度。2.6统计学处理计量指标均采用s

8、表示，各组间比拟用SPSS11.0统计学软件包进展分析。转贴于论文联盟.ll.3结果3.1针刺治疗对IA小鼠关节炎指数的影响见表1。表1各组小鼠不同时期关节炎指数牛型胶原免疫的小鼠，初次免疫后3周左右开场出现关节炎病症，即鼠爪明显红、肿，关节炎指数增加，说明IA造模成功。x43+/+IA小鼠经针刺治疗3周后，与x43+/+IA未治疗组相比，关节炎指数明显降低(P0.01);而x43+/-IA小鼠经针刺治疗3周后，与x43+/-IA未治疗组相比，关节炎指数无明显变化(P0.05)。3.2血清TNF-测定见表2。表2血清TNF-测定将各组动物的血清用ELISA法检测TNF-的含量。结果显示：x43

9、+/+IA小鼠经针刺治疗3周后，与未治疗组相比，TNF-的含量明显降低(P0.01);而x43+/-IA小鼠经针刺治疗3周后，与未治疗组相比，TNF-的含量无明显变化(P0.05)。4讨论类风湿关节炎(RA)是一种典型的多因素诱发的自身免疫反响性疾病，T细胞的活化是RA炎症启动与持续的核心事件5，6。根据T淋巴细胞分泌细胞因子形式的不同，激活的辅助T细胞(Th细胞)可分化为Th1和Th2细胞亚群，其中Th1主要分泌IFN-，IL-2，IL-1，IL-12，TNF-;Th2主要分泌IL-4，IL-5，IL-6，IL-10。近年研究提示IA和RA都是Th1细胞介导的自身免疫应答疾病，某些Th1型炎

10、症型细胞因子(TNF-)的过度表达，被认为在RA的发病中起重要作用7，8。RA的发病机制及病程进展与细胞因子的网络失调关系亲密，尤其是TNF-，它可以启动和维持RA炎症免疫反响。单核-巨噬细胞系大量合成TNF-，TNF-又大量诱生其它的体液因子，从而使炎症放大并持续。此外，TNF-还可激活炎性细胞杀灭微生物，应用TNF中和抗体的小鼠大大降低了对微生物部分感染的控制才能，因此TNF-被认为是RA发病中首先发动的炎症因子，是激起机体级联反响过程中的关键因子9。目前抗风湿药或因疗效不非常满意，或因毒副作用太大，难以长期坚持使用。实验研究和临床研究均显示针灸能调节RA患者和模型动物的免疫和内分泌功能、

11、改善血循环等1。针灸疗法已越来越广泛用来治疗本玻在本实验中对于IA小鼠采用了关节炎指数来评估疗效，并检测血清中TNF-中含量讨论其作用机制。结果显示，针刺治疗x43+/+IA小鼠关节炎指数和血清中TNF-含量均比x43+/+IA小鼠未治疗组下降明显(P0.01);而x43+/-IA小鼠治疗组与未治疗组比拟关节炎指数和血清中TNF-含量均无明显变化(P0.05)。TNF-属于Th1型细胞因子，Th1型细胞分泌的TNF-等能激活巨噬细胞、成纤维细胞等与RA相关的细胞，而这些细胞又可分泌大量的Th1型细胞因子，在RA病变滑膜的炎症反响中起着重要作用。有研究说明，RA滑膜中的T细胞可表达D69等活化标

12、志，而激活的T细胞那么可通过接触依赖的方式，诱导巨噬细胞和滑膜细胞前炎症性细胞因子(特别是TNF-)的产生，并由此推动RA病情的开展10。所以，抑制Th1型细胞因子的过度分泌，有可能有助于减轻RA滑膜病变早期的炎症反响及滑膜细胞的增生。综上所述，与x43+/+IA小鼠相比，针刺治疗x43+/-IA小鼠疗效不明显，其疗效差异可能是由于针刺对x43+/+IA小鼠治疗作用是通过缝隙连接蛋白起作用，对Th1型细胞因子TNF-释放的抑制作用明显，而针刺对x43+/-IA小鼠TNF-释放的抑制作用不明显，在分子程度上说明了针刺疗效产生与x43有关。【参考文献】1方剑乔.类风湿关节炎的中医针灸治疗.杭州：浙

13、江科学技术出版社,2000:93.2黄晓桃,黄光英,张明敏.缝隙连接蛋白43在经穴上皮细胞和成纤维细胞中表达的实验研究J.湖南中医学院学报,2022,25(1):43.3郑翠红,黄光英,张明敏.缝隙连接蛋白x43在大鼠经脉线上表达的实验研究J.中国针灸,2022,25(9):629.4黄光英,郑翠红,张明敏.针刺对大鼠“足三里穴缝隙连接蛋白x43表达的影响J.中国针灸,2022,25(8):565.5eyand,GnzyJJ.PathgenesisfrheuatidarthritisJ.edlinNrthA,1997,81:29.6KliiukPA,YangH,GnzyJJ,eta1.PrdutinfytkinesandetallprtelnasesinrheuatidsynvitisisTelldependentJ.linIunl,1999,90:65.7Verhef,vanRnJ,LafeberF,eta1.Th1/Th2ellbalaneinrheuatidarthritisJ.linAppllunRev.2001,153.8陆意.类风湿性关节炎发病机制的研究进展J.中华风湿