骨唾液酸蛋白的表达对骨肉瘤细胞侵袭转移特性的影响

1、骨唾液酸卵白的表达对骨血瘤细胞侵袭转移特性的影响黄涛，陈安民，郭风劲，张衣北，廖晖【关键词】骨唾液酸卵白基因；基因表达；肿瘤转移；骨血瘤ExpressinfBSPInfluenenBehavirfInvasinandetastasisfstesaraKeyrds：Bnesialprteingene;Geneexpressin;Neplasetastasis;stesara1质料和要领11重要质料和试剂12要领121正反义人BSP表达载体的构建产物别离转化感觉态细菌DH5，选择阳性克垄扩增、抽提质粒DNA。经BaH和Hind双酶切断定和DNA测序断定。122细胞造就和转染124肿瘤重组基底膜侵袭

2、实行用50g/Latrigel18稀释液包被Transell小室底部，将Transell小室放入24孔造就板中，在小室外加趋化因子200l和含10%FBS的DE200l；在小室内参加100l肿瘤细胞悬液，细胞数为1105，每组重复6个样本。通例造就24h后，用棉签警觉擦去微孔膜上层细胞，95乙醇结实，Giesa溶液染色。在倒置显微镜下计数移至微孔膜下层的细胞，每个样本计数10个视野。125细胞划痕实行将各组细胞别离接种在用FN预包被的24孔造就板中,每组6孔，每孔细胞数为5105,通例造就至形成细胞单层，用移液器滴头沿造就板底部划“一字形横线伤口，继承用无血清DE造就。镜下不雅察12h、24h

3、、36h、48h、60h、72h的细胞活动环境，记载从迁徙出发点到迁徙最远端细胞核之间的间隔，用迁徙间隔反响迁徙速率。126统计学处置惩罚实行数据接纳SPSS12.0统计软件举行统计学处置惩罚，数据用s表现，差异的明显性用组间t查验，统计要领接纳方差阐发。P0.05有统计学意义。2效果21正反义人BSP表达载体的构建和断定22细胞转染效果转染后24h、48h及72h别离在荧光显微镜下不雅察,未转染细胞在荧光显微镜下不雅察未见荧光,而转染细胞在荧光显微镜下不雅察见绿色荧光,且转染后48h表达绿色荧光卵白的细胞数目多于24h，72h的转染细胞增长量渐渐淘汰。23esternblt检测各组不变转染细

4、胞BSP卵白的表达esternblt检测效果表白,各组细胞中均有BSP卵白的表达,说明在骨血瘤细胞中有BSP的表达，和文献报道同等。但各组表达强度差异,与阴性比拟组比拟,公理转染组细胞中BSP的表达量增长,反义转染组细胞中BSP的表达量显着低落,阳性比拟组细胞中BSP的表达量无变革,见图2。24重组基底膜侵袭按捺4组细胞均可以或许穿过铺有atrigel的滤膜。和阴性比拟组细胞比拟，公理转染组肿瘤细胞的穿膜细胞数增高，有明显差异性P0.05。反义转染组的穿膜细胞数显着小于阴性比拟组，有非常明显差异性P0.01。阳性比拟组和阴性比拟组的穿膜细胞数比拟无明显性差异(P0.05),见表1。表1Tran

5、sell侵袭小室测定各组细胞侵袭本领(略)划痕后12h，各组细胞均见细胞向阔别划痕区回缩，各组别离记载划痕区两侧细胞之间的间隔，并以之为基准。24h镜下可见各组少量细胞开始爬行。36h镜下可见细胞向划痕区爬行，反义转染组显着慢于其他各组，而公理转染组、阳性比拟组、阴性比拟组爬行速率好似未见显着差异。48h后反义转染组有少数细胞靠近划痕区，别的各组均有多量细胞靠近划痕区。60h镜下见公理转染组，阳性比拟组和阴性比拟组划痕区内有少量细胞存在，反义转染组细胞仍在划痕区边沿，划痕内未见细胞存在。72h不雅察可见公理转染组，阳性比拟组和阴性比拟组细胞划痕区内有多量细胞，反义转染组的划痕区有细胞散在漫衍。

6、按照细胞迁徙环境，选择了60h时细胞迁徙间隔举行测定，见表2。表2划痕损伤模子测定细胞迁徙间隔(略)3讨论反义核酸技能是肿瘤生物治疗的计谋之一，接纳方案适当的反义寡核苷酸能特异性按捺基因表达，极有大概成为治疗肿瘤的新要领。侵袭、转移是恶性肿瘤的本质特性，其转移纪律极其庞大，也是肿瘤临床治疗的困难。因此，应用反义核酸技能操纵肿瘤的侵袭转移是如今肿瘤治疗研究的一大热门。Kid等3就通过反义氨肽酶NDNA转染骨血瘤细胞,明显按捺骨血瘤细胞在体外的粘附与挪动,并在裸鼠体内有用低落了其肺转移率。迩来有研究表白，很多肿瘤在生长历程中都陪同有BSP的表达，而这些表达BSP的肿瘤也更轻易表现出侵袭、转移的倾向

7、4。altregny等5对乳腺癌和前线腺癌研究初次阐发BSP在肿瘤的骨转移中作用明显。Zhang6、Sharp等7证明人乳腺癌细胞在鼠模子中BSP的过分表达能促进骨转移，而按捺了BSP表达的细胞也同时按捺了其骨转移。ldberg等8研究表现BSP通过其RGD基序促进骨血瘤细胞之间的粘附。在BSP分子中包罗与整合素v3结合的精甘天(门)冬氨酸(ArgGlyAsp，RGD)基序，能到场整合素介导的信号传导通路，从而介导细胞的粘赞同迁徙9，10。由于在正常构造中，BSP的表达仅范围于骨相干细胞和滋养层中，因此我们通过反义核酸技能，构建正反义hBSP表达载体，并选择骨血瘤细胞作为工具举行转染，开端研究

8、BSP卵白表达对骨构造自身肿瘤的生物学举动的影响。实行接纳人工基底膜胶和纤维粘连卵白人工模拟基底膜和细胞外基质，测定转染了公理和反义hBSP的骨血瘤细胞对基底膜的侵袭和瘤细胞的迁徙本领。在侵袭实行中，我们创造，反义转染BSP的肿瘤细胞的迁徙本领显着受到按捺。过表达BSP的肿瘤细胞迁徙本领得到必然程度的增强，提示BSP程度的上调，大概与骨血瘤的侵袭转移有严密干系，而BSP程度的下调那么能起到按捺骨血瘤侵袭的作用。说明通过反义hBSP表达载体的转染，直接按捺了DNA的转录而影响到BSPRNA的表达，使BSP的表达淘汰，从而低落了瘤细胞的活动和趋向性。在体外划痕实行模子中，也表现反义转染的骨血瘤细胞的迁徙速率受到显着按捺。推测其原理同样是由于BSP的低表达可以或许按捺FN对瘤细胞活动的趋化