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文档简介

1、实验二 蛋白质的比色定量分析 考马斯亮蓝法实验目的熟悉分光光度计的基本原理和使用方法掌握利用考马斯亮蓝定量分析蛋白质的方法思考题1.考马斯亮蓝 G-250 法测定蛋自质含量的原理是什么？ 还有哪些蛋自质定量法？ 2.考马斯亮蓝法测定蛋自质含量时，应该注意些什么？ 利用蛋白质-染料结合的原理，定量测定蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G-250在游离状态呈红褐色，当它与蛋白质结合后变为蓝色，前者最大吸收波长为488nm，后者为595nm。在一定蛋白浓度范围内（0.011.0mg/ml），蛋白质-色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量分析。蛋白质和考马斯

2、亮蓝G-250结合2min左右达到平衡，完全反应十分迅速，其结合物在室温下1小时内保持稳定。实验原理实验器材 762分光光度计 （1）分析天平（2）移液器（3）试管、试管架（4）烧杯（5）分光光度计 主要试剂1、生理盐水：称0.9g NaCl，用蒸馏水定溶至100mL。 2、蛋白质标准液（1 mg/ml）：称小牛血清白蛋白100mg，用蒸馏水定溶至100mL。4、考马斯亮蓝G-250溶液：称100mg考马斯亮蓝G-250，加95%乙醇50mL，加85%（W/V）H3PO4 100mL，用蒸馏水定溶至1000mL，置棕色瓶过夜，再用二层滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G-25

3、0，4.7%(W/V)乙醇。一、制定标准曲线常量法标准曲线实验操作试管编号0123451mg/ml标准蛋白溶液(ml)0.00.010.020.030.040.05生理盐水(ml)0.10.090.080.070.060.05考马斯亮蓝试剂(ml)各5ml摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色OD595nm取6支10ml干净试管 按下表取样，混匀，放置2min。在595nm 下比色，纪录数据。以OD值为纵坐标、标准蛋白含量（mg/ml）为横坐标作图，得到标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的OD值，即可查出未知样品的蛋白含量。 测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量可以忽略。测定结束后，可用乙醇将比色杯壁上的蓝色洗干净。注意事项计算结果 OD595nm值对应的标准曲线蛋白质含量（mg/ml） 样品蛋白质浓度(mg/ml)=稀释倍数制备待测样品：已准备好。二、未知样品蛋白质浓度测定测定：取1 支10mL 试管，按下表取样。管 号1待

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