《PCR技术简介》PPT课件.ppt

1、PCR技术简介,主要内容,PCR RT-PCR（reverse transcriptional-PCR） 琼脂糖凝胶电泳,PCR的概念,PCR（polymerase chain reaction）即聚合酶链反应技术，它是以待扩增的两条DNA链为模板，在一对人工合成的寡核苷酸引物的介导下，利用耐热DNA聚合酶的酶促作用，通过变性-复性-延伸的循环操作，快速特异地扩增出特定的DNA片断,DNA的复制 核酸体外扩增的设想 1985年Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR） 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后诞生了第一台PCR自动化热循环仪 1989年美国Science杂志列PC

2、R为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖,PCR技术简史,PCR的原理,PCR反应时，一般采用变性-复性-延伸三步循环。 1变性：通常采用加热变性，即将模板DNA或延伸后的双链DNA加热到940C，使双螺旋DNA解开成为单链,2复性（退火）：通过降低反应温度至45-700C，使两种引物能与两条解开的DNA互补链的3端粘合,PCR的原理,PCR的主要用途,目的基因的克隆 基因的体外突变 生成大量DNA以进行序列测定 特异基因表达量分析,PCR反应体系,20ul；25ul；50ul,PCR实验准备试剂,Taq酶 0.5-2.5 U

3、/50 l（通常2.5 U/50 l ） 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量 从生物公司购买：生工；华美；Takara;Promega; 与buffer,mg2+成套出售,Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂 1.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系（通常4 l/50 l ） Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性,PCR实验准备试剂,PCR实验准备试剂,Buffer 提供合适的PH值 有10buffer和2buffer 有的buffer中含有mg2+，有的buffer中不含有mg2,PCR实验准备试剂,dNTP dATP，dT

4、TP， dGTP ，dCTP 可以购买dNTP混合液，也可以购买dATP，dTTP， dGTP ，dCTP等体积混合 四种dNTP浓度应相等 每种200umol/L（通常4 l/50 l ） 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量,PCR实验准备试剂,模板（DNA或cDNA） 单、双链DNA均可 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类 一般50ng DNA模板/50L 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加 提取细胞或组织中的基因组DNA,PCR实验准备试剂,ddH2O 灭菌的去离子水或双蒸水,PCR实验准备试剂,引物 0.1-0.5 mol/L（通常10pm

5、ol的引物2ul/50ul） 浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降 利用软件（Omiga、Primer primier）设计引物后，由生物公司（生工、赛百盛）合成，收到合成完毕的引物后根据说明对引物进行稀释，一般稀释成10pmol使用 引物设计中需关注的有上下游引物之间的长度，即将来PCR产物的大小；以及上下游引物的Tm值，即将来PCR中的退火温度,PCR实验准备-试剂,引物设计原则： 1.长度以1530个碱基为宜 2.正向反向两条引物链之间的距离适中，一般使扩增出的片断在300-1100bp之间。如果使用RT-PCR检测RNA病毒，引物间距离以500bp最佳。片断过短影响结果判定，过

6、长则不易扩增 3.引物碱基组成应随机分布，G+C含量在45-55为宜。过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大 4.引物自身不形成二级结构，引物间没有互补序列（4个碱基以上），引物间3端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败 5.引物序列具有特异性 6.引物3端碱基与模板DNA一定要配对，并且3末端碱基最好选T、 C或者G，不选A。因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高,PCR实验准备-仪器、耗材,PCR仪 移液器 吸头 200ul PCR管 EP管架 枪头盒 PCR板 冰盒,重复13步 2530轮,目的DNA片段 扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链

7、与引物复性,DNA变性 形成2条单链,子链延伸 DNA加倍,PCR反应程序,PCR反应程序,变性温度:94C or 95C ,不变； 延伸温度：72C，不变； 退火温度：50C左右，可变，Tm值-5,延伸时间：30-60s，与PCR产物的大小有关，参考酶的延伸效率（通常1000bp/min,PCR反应程序,1) 94变性3min， (2) 94变性30sec， (3) 52 退火30sec， (4) 72 延伸1min。 (5) goto(2)repeat29, （6）72 延伸10min。 （7）hold at 4,PCR操作过程,混匀，瞬时离心3-5sec,PCR操作过程,PCR操作过程,

8、RT-PCR（reverse transcriptional-PCR,RT-PCR原理,RT-PCR主要用途,检测特异基因的表达量 特异基因的组织定位 构建cDNA文库 鉴定已转录序列是否发生突变,RT-PCR反应体系,一步法RT-PCR,RT-PCR反应体系,两步法RT-PCR,cDNA PCR扩增,cDNA第一链合成反应,RT-PCR的准备-试剂,提取细胞或组织中RNA 购买RT-PCR试剂盒（一步法或两步法,RT-PCR的准备-耗材、仪器,超净台 PCR仪 移液器 吸头 200ul PCR管 EP管架 枪头盒 PCR板 冰盒,RT-PCR过程中cDNA第一链合成反应所用的枪头、枪头盒、P

9、CR管等塑料制品均提前用氯仿进行处理，高压灭菌后使用。玻璃制品在180干烤6-8小时。加样过程在超净台内进行，需戴手套与口罩。 cDNA PCR扩增的准备工作同普通PCR反应,RT-PCR反应程序,1) 4230min， (2) 943min， (3) 94变性3min， (4) 94变性30sec， (5) 52 退火30sec， (6) 72 延伸1min。 (7) goto(4)repeat29, （8）72 延伸10min。 （9）hold at 4,RT-PCR操作过程,cDNA第一链合成反应所用枪头、枪头盒、PCR管等塑料制品均提前用氯仿进行处理，高压灭菌后使用。玻璃制品在180干

10、烤6-8小时。在超净台内按试剂盒说明书进行加样，加样过程需戴手套与口罩。 cDNA PCR扩增的准备工作同普通PCR反应。 在PCR仪上设定程序进行反应,琼脂糖凝胶电泳的原理,琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定核酸片段的有效方法，琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性，利用电荷效应，在电场的作用下及中性pH的缓冲条件下，带负电的核酸分子向正极迁移。利用分子筛效应可以分离不同片断大小和不同构象的DNA、RNA分子,琼脂糖凝胶电泳的主要用途,分离不同片断大小和不同构象的DNA、RNA分子。 鉴定DNA片段，如PCR产物的鉴定。 纯化DNA分子,琼脂糖凝胶电泳的准备-试剂,琼脂糖 电泳缓冲液：T

11、ris，冰乙酸，EDTA（TAE） 6X载样缓冲液（Load buffer）：溴酚蓝，蔗糖 染色液：goldview DNA或RNA样品 DNA分子量marker,琼脂糖凝胶电泳的准备-仪器、耗材,电泳仪 电泳槽 微波炉 三角瓶 移液器 电子天平 枪头 凝胶成像系统,琼脂糖凝胶电泳的操作过程,1g 琼脂糖加入100ml 1TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。（冷却到60，加入5l的goldview，并摇匀。） 装好制胶板，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50）倒入，室温冷却凝固。 充分凝固后，小心垂直向上拔出梳子，将凝胶置入电泳槽中，加1TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm,琼脂糖凝胶电泳的操作过程,用移液器吸取PCR产物10