耐酒精酵母的筛选

1、摘要：从野外葡萄园土壤中采集土壤样品，在实验室中通过微生物培 养，微生物的富集，菌种的分离、纯化，筛选出纯的酵母菌。将筛选 出的纯的酵母菌分组分别进行培养，进行耐酒精能力的比较。培养到 最佳时期的时候，分别测定各组酵母菌株培养基中酒精含量，筛选出 耐酒精性能最好的菌株。该超强耐酒精能力的优良菌株的成功筛选为 酵母菌能高效利用发酵培养液提供了菌种来源，同时也为发酵后的酒 精分离降低了难度和成本。关键词：微生物；耐酒精；酵母；筛选；性能测定前言：随着化石能源的日趋匮乏及环境污染的加剧，开发一种绿色能 源势在必行。乙醇作为一种生产工艺成熟、生产原料来源广的替代能 源日益受到人们关注。尤其是燃料酒精作

2、为清洁能源，原料资源可以 再生，大大的刺激了酒精行业的发展。用微生物法生产酒精的历史由 来已久，并且生产工艺早已成熟。目前乙醇的生产原料为玉米、小麦 等粮食产品为主。尽管用粮食生产酒精成本昂贵，但由于用纤维素作 原料生产酒精的方法还不成熟，工艺过程很不完善，所以怎样提高粮 食生产酒精过程中原料的利用率，是目前酒精发酵过程研究的一个重 要方向，也是降低发酵生产酒精的重要措施。因为酒精是酵母菌糖代 谢产物，对酵母菌的发酵有一定抑制作用，当酒精成分达到10%左右 时，酵母菌就停止繁殖，发酵过程也随之放慢。在酒精发酵过程中， 由于一般酒精酵母的耐酒精能力不强（耐酒精度一般为10%），导致 酵母菌不能充

3、分利用发酵原料，造成了原料的浪费，同时由于发酵液 中酒精含量低，使得酒精后期的分离纯化过程复杂，从而大大增加了 生产成本。因此，耐高酒精度的酒精酵母的筛选具有非常重要的意义。 耐高酒精度的酒精酵母能够减缓产物的抑制作用，提升酒精酵母产酒 精的潜力【1】。耐酒精酵母可以在发酵液中较高浓度的酒精中不会死 亡，并且仍然具有利用培养液发酵酒精的能力，从而提高酒精原料的 利用率。同时和一般酵母发酵相比，发酵产物中酒精的含量能达到 18%左右，产物中原料和杂质的含量下降，产物中酒精的纯度增加， 也使得酒精的分离提纯更加容易进行，从而使粮食生产酒精成本降 低。因此高耐性酒精酵母这一领域的研究工作一直在深入的

4、进行，并 且有了可喜的成果【2】。耐酒精酵母的应用，使相同原料的酒精产量 大大提高，从而使我国的酒精生产总量增加，改善我国酒精产品供应 不足的状况，更好的为我国的国民经济服务。酒精成本的降低，使得 酒精能源能够得以广泛使用，缓解能源的危机，降低化石燃料的使用， 减少日益严重的环境污染，改善我国恶劣的环境状况。对我国经济的 可持续发展有着深远的影响。在查阅了大量文献资料的前提下，本文 拟从自然界分离筛选一株耐酒精产酒精能力强的酵母菌株，使其应用 于工业酒精发酵，提高酒精发酵的产率和质量，降低酒精生产的成本。 实验部分：1材料与试验方法：1.1材料：1.1.1样品来源：野外葡萄园中的土壤样品。1.

5、1.2菌株来源：从葡萄园中土壤样品中分离酵母菌株。1.1.3培养基：1.1.3.1 富集培养基：葡萄糖 50 g,KH2PO4 2.5 g,Na2HPO4 0.5 g,（NH4）2SO4 1 g,尿素 1 g,MgSO 47H2O 0.5 g,酵母膏 0.5 g,FeSO4 0.1 g,孟加拉红（1%水溶液）3.3 mL,水定容至1000 mL。若配制液体培 养基，将其pH调至4.5；若配制固体培养基，则加琼脂15 g,然后调 pH至5.56。在112C下灭菌30 min【3】。1.1.3.2分离培养基：YPD（葡萄糖30g、蛋白胨15g、酵母膏15g）培 养基【4】。1.1.3.3初筛培养基

6、：即TIC显色培养基。上层培养基为TTC 0.5 g，葡 萄糖5 g,琼脂15 g,水1000 mL,自然pH7；下层培养基为葡萄糖10 g,蛋白胨 2 g，酵母膏 1.5 g, KH2PO4 1 g,MgSO4 7H2O0.4 g，琼脂 20 g,水 1000 mL, pH 值 5.55.7【4】。复筛培养基:葡萄糖30%,酵母膏0.5%，蛋白胨0.5%,氯化铵0.15%, 磷酸氢二钾0. 15%，硫酸镁0. 1%，氯化钙0. 28%, 0. 06MPa灭菌 15min 【4】。发酵培养基：玉米淀粉适度糖化后添加部分营养元素。1.1.4实验仪器：高压灭菌锅；恒温培养箱；摇床；超净工作台；干热

7、灭 菌箱；全套接种工具；培养所用的玻璃器具。1.1.5酶制剂：淀粉酶；糖化酶。1.2试验方法：1.2.1菌种的富集培养：富集培养法可以创造一些条件只让所需微生物生长，在这些条件下， 所需的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远 超过其他微生物。所创造的最适条件包括选择最适的碳源、能源、温 度、pH等。在相同的培养基和培养条件下，经过多次重复移种，最 后富集的菌株很容易在培养基上长出单菌落【5】。将配制好的富集培养基装入用干热灭菌箱灭菌后的三角瓶中，用高压 灭菌锅进行彻底灭菌后冷却。将采集到的样品加入到富集培养基中， 于最是的温度条件下，放在摇床上（将培养基放在摇床上培养的目的

8、是为了是菌体与培养基充分接触，使培养的菌种充分利用培养基的成 分，同时使培养基中的菌种分布均匀。）进行富集培养48小时，观察 有无酵母菌细胞的存在，并且使培养基中酵母细胞增殖。同时移种重 复富集培养多次，使所需分离的酵母菌在固体培养基中长出单菌落。 1.2.2菌种的分离和纯化：1菌种得分离：从富集培养基上挑取酵母单菌落，在超净工作台的无菌环境中，在分 离培养基上划线，将菌种接种到分离培养基上。将分离培养基中添加 适量的青霉素抑制细菌的生长，32C培养48小时。所得的酵母菌纯 度已经很高。然后进行酵母的纯化试验，得到纯种的酵母菌株。2菌种得纯化：在超净工作台上，从分离培养基上挑取单菌落，接种到初

9、筛培养基， 通过染色，镜鉴获得纯种（不含任何杂菌）酵母菌株。具体方法如下： 个体形态观察：用美蓝染色法取对数生长期的菌体制片，在放大400 倍及1000倍的显微镜下观察酵母形态，用测微尺测量酵母细胞的大小, 并进行死活鉴别。液体培养特征观察：用三角瓶装PD液300 mL， 灭菌后，接种分离的酵母菌，于28 r培养并观察其特征。菌落特征观察：将分离的酵母菌接种在PDA平板上，28r保温培养 48 h后观察菌落特征【5】。（酵母菌的菌落形态特征细胞个体大，湿 润，表面光滑，多数不透明，黏稠，菌落颜色单调，多数呈乳白色， 少数红色，个别黑色。酵母菌生长在固体培养基表面，容易用针挑起， 菌落质地均匀，

10、正、反面及中央与边缘的颜色一致。不产生假菌丝的 酵母菌菌落更隆起，边缘十分圆整；形成大量假菌丝的酵母，菌落较 平坦，表面和边缘粗糙。酵母菌细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊 肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。比细菌的单细胞个体要大得多， 一般为15微米52微米。酵母菌无鞭毛，不能游动。酵母菌具有 典型的真核细胞结构，有细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞质、液泡、 线粒体等，有的还具有微体。酵母菌的细胞形态酵母菌的细胞形态酵 母菌细胞结构的显微照片酵母菌的菌落。大多数酵母菌的菌落特征与 细菌相似，但比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易 挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，

11、菌 落多为乳白色，少数为红色，个别为黑色。酵母菌菌落特征是分类鉴 定的重要依据。）通过细胞形态观察，挑去初筛培养基中具有典型酵母形态的细 胞，在无菌条件下，划线接种到复筛培养基中，经过24小时的培养 增殖，从而得到纯种的酵母菌菌落。从而获得纯种的不含杂菌的酵母 菌株，以便为后期筛选耐酒精酵母提供需要。1.2.2耐酒精酵母的筛选1耐酒精能力的试验从复筛培养基中得到的分离纯化后的纯种酵母菌，在酵母菌株挑取对 数期（对数期的菌种细菌代谢旺盛，个体的形态和生理特性比较稳定， 细胞各成分平衡生长，生长速率恒定且最高，是发酵工业中用做种子 的最佳材料。）时的单菌落，在无菌条件下，接种到灭菌后的发酵培 养基

12、上，分别接种十二组酵母菌中进行耐酒精能力实验。酵母菌中在 发酵培养基上，吸收培养基的营养成分，首先进行菌种得繁殖。等到 菌种繁殖到足够数量的时候开始利用发酵培养基中原料进行发酵产 生酒精。等到大部分菌种到稳定期（有害代谢产物积累，新增细胞数 目与死亡细胞数目达到动态平衡，次级代谢产物大量积累，形成芽孢。 此时期酵母细胞的发酵已基本停止，产生的酒精量达到最大值）的时 候发酵停止，然后进行各个发酵培养基中酒精含量和酵母菌的存活率 的测定。1.2.2.2耐酒精能力的测定1.2.2.2.1酒精度的测定在各个培养基中各取100mL成熟发酵醪，加入100mL蒸馏水，置1000W 电炉上蒸馏出100mL液体

13、,摇匀后用酒精计测定其酒度，然后查表校正为 20C酒精浓度【6】。然后比较不同组分培养液中酒精的含量。 耐酒精能力的比较比较十二组试验中各组分中，培养基中酒精的含量，挑选出酒精含量 最高的那组。酒精含量高的培养基，可以说明该酵母的产酒精能力比 一般的酒精酵母高。1.2.2.2.2酵母存活率的测定：酵母细胞鉴定程序【7】。（7欧阳谅.微生物学实验法M.南昌： 江西人民出版社，1980.）酵母菌细胞数与死亡率的测定【8】：采用 Neubauer血球计数板法计数。8程丽娟.微生物学实验技术M.天则 出版社,1993选择出酵母存活率最高的那组菌株。酵母存活率高，证明该酵母菌的 耐酒精能力比一般酵母强。

14、1.2.2.3测定结果：通过各个发酵培养基中酒精含量和酵母菌的存活率的测定。测定结果 表明酒精含量最高的培养液和酵母成活率最高的培养液是同一培养 液。2结果与分析：2.1实验结果：2.1.1酵母菌中的分离纯化结果：实验结果表明，通过酵母菌的富集培养，分离培养，初筛培养和复筛 培养，可以将野生酵母菌经过菌种的分离纯化得到纯种的用于耐酒精 实验所需的酵母菌株。2.1.2耐酒精酵母菌筛选结果：通过十二组发酵培养基中酵母菌的发酵实验，各个发酵培养基中酒精 含量和酵母菌的存活率的测定，得到耐酒精能力远远高于一般酒精酵 母的耐酒精酵母，筛选得到的这株耐酒精酵母的耐酒精含量可以达到 18%。根据上文的实验结

15、果，表明酒精含量最高的培养液和酵母成活率最高 的培养液是同一培养液。由于耐酒精能力强的和产酒精量高的菌株是 同一菌株，证明本实验的方法是正确的，获得了理想的酵母菌株。2. 2实验分析：2.2.1正确实验思路和合理的实验步骤是整个实验过程的关键。整个 实验过程最重要操作是无菌操作，避免杂菌的污染是实验成功的关 键。无菌操作包括培养基的灭菌，实验器具的灭菌，菌种接种培养过 程的无菌操作。同时培养基的选择也很重要，菌种得分离，纯化，耐 高温筛选都需要各自不同的培养基，进行各自的操作。2.2.2同时酵母菌的生长时期的选择和控制也是非常重要的【8】。 迟缓期酵母菌接种至培养基后，对新环境有一个短暂适应过

16、程（不适应者可 因转种而死亡）。此期曲线平坦稳定，因为细菌繁殖极少。迟缓期长 短因素种、接种菌量、菌龄以及营养物质等不同而异，一般为14 小时。此期中细菌体积增大，代谢活跃，为细菌的分裂增殖合成、储 备充足的酶、能量及中间代谢产物。对数期又称指数期（exponential phage）。此期生长曲线上活菌数直线 上升。酵母菌以稳定的几何级数极快增长，可持续几小时至几天不等（视培养条件及细菌代时而异）。此期酵母菌形态、染色、生物活性 都很典型，对外界环境因素的作用敏感。是发酵工业中用做种子的最 佳材料。稳定期该期的生长菌群总数处于平坦阶段，但细菌群体活力变化较大。由于 培养基中营养物质消耗、毒性

17、产物（有机酸、H2O2等）积累ph下 降等不利因素的影响，酵母菌繁殖速度渐趋下降，相对酵母菌死亡数 开始逐渐增加，此期细菌增殖数与死亡数渐趋平衡。衰亡期随着稳定期发展，酵母菌繁殖越来越慢，死亡菌数明显增多。活菌数 与培养时间呈反比关系，此期细菌变长肿胀或畸形衰变，甚至菌体自 溶，难以辩认其形。生理代谢活动趋于停滞。2.2.3整个实验过程试验方法的选择也是至关重要的，参考大量有价 值的文献选择合理的试验方法是成功的关键。同时，酒精含量的检测， 酵母存活率的检测方法选择要得当。2.2.4本实验的独特之处是在筛选耐酒精酵母的方法上，不但检测了 酒精酵母的耐酒精能力，还检测了酵母的产酒精能力，得到及高

18、产酒 精又耐高浓度酒精的酵母菌株，从而证明了高产酒精和耐高浓度酒精 的酵母是同一株。酵母菌有耐高浓度酒精能力的同时也具有高产酒精 的能力。而其他的很多实验只是做了其中一方面的工作。3.结论和讨论：3.1结论：综上所述：在自然界通过菌种分离纯化和耐酒精能力的的筛选可以得 到纯种的耐酒精酵母。3.2讨论：3 1高浓度酒精发酵是人们近年来普遍关注的一个研究课题。这一 研究的技术关键在于获得高渗透压且酒精发酵速率快、对自身产生乙 醇的耐受力强的酵母菌种，提高酵母菌的乙醇耐受力、解除高浓度乙 醇的抑制作用也是人们的研究热点。研究结果表明：酵母菌对乙醇的 耐受能力不仅仅是由于酵母细胞自身对不同水平的乙醇耐

19、受的内在 能力，而且与酵母原生质膜的脂类组成及功能、发酵营养状况、环境 参数、碳水化合物基质补充方式等因素有密切关系。乙醇毒性的简要 机制是:临界乙醇浓度导致质膜磷脂裂解，如果菌株质膜本身或发酵时 具备相当营养及环境条件适宜等,酵母就对乙醇毒性有所适应和抵抗, 特别是温度尤为明显。随着温度的提高,酵母质膜的磷脂量很快降低, 以维持质膜的流动性和保护胞间活性。从本研究结果看，该菌株的最 适发酵温度在32C左右，试想如果通过高温驯化或进一步将该菌株与 耐高温菌株进行原生质体融合,使之既耐高温、高产酒精又具有良好 的絮凝特性，那么这样的菌株将会有更高的应用价值【9】。3 - 2近年来，酒精高强度连续

20、发酵技术研究也取得了许多中试结果, 如细胞循环发酵、悬浮床或固定化细胞发酵与分离同步的发酵技术等, 但这些成果未能在淀粉质原料生产酒精中广泛应用，除技术本身原因 外，主要与我国特有的薯干原料酒精占主导有关。近年来，广西、沈阳 先后研究开发了固定化酵母细胞酒精生产技术,并在部分厂家推广应 用，但由于人们的认识问题等原因，因而推广面不大。以玉米为原料采 用精料发酵，设备堵塞情况可大大减少，可实现高浓度发酵。由于在前 期将玉米副产物进行了彻底分离，大大提高了玉米原料利用价值，同时 克服了酒精液固液分离的难题，大大减少了污染物的排放，减轻了治污 工作量，提高了设备利用率和工人劳动生产率，节水、节电，同

21、时有助于 许多新技术的实施【9】。3.3耐高温酵母筛选的意义3.3.1本实验只进行了耐酒精酵母的筛选，在酒精工业生产重，耐高 温酒精酵母的筛选也同样具有中的意义。超高温耐高酒精度乙醇酵母 的选育，对燃料乙醇或酒精工业具有较大的实用价值。目前国内研究 得较多的主要有沈睿的YH4耐高温酵母【10】。国外的研究主要集中 在东南亚、日本和巴西D司。所筛选的这些酵母一般在384OC还 具有较高的酒精产率。筛选超高温耐高疆精度乙醇酵母菌株其意义主 要体现在：能够解决糖袍温度和发酵温度不协调的矛盾，实现真正 意义上酶边1糖化边发酵，使糖化和发酵在同一设备中进行从而减少 葡萄糖对纤维素酶的抑制作用，提壹绿维素酶的擅率，进而提高纤维 素发酵生产燃料乙醇的得率；高温发酵还能够提高发酵效率，降低